同时检测独一味中环烯醚萜苷、苯乙醇苷、黄酮、咖啡酰类成分的方法

摘要

本发明提供了同时检测独一味中环烯醚萜苷、苯乙醇苷、黄酮、咖啡酰类成分的方法。本发明检测方法中，出峰数量较多，分离度良好，基线平稳，能够对独一味进行有效检测，为保障药材质量提供给了新的选择。本发明首次在同一色谱条件下检测了上述环烯醚萜苷、苯乙醇苷、黄酮及咖啡酰4类成分，共指认了7个具体化合物，可更全面更准确地用于独一味药材的质量控制。

说明书

技术领域

本发明涉及同时检测独一味中环烯醚萜苷、苯乙醇苷、黄酮、咖啡酰类成分的方法。

背景技术

独一味Lamiophlomis rotata(Benth.)Kudo系唇形科独一味属植物，是重要的青藏高原药用植物和常用大宗藏药，为一级濒危藏药品种^[1]，《四部医典》和《晶珠本草》中记载本品有强筋骨，干黄水，止痛之功。现代临床用于活血止血、祛风止痛，广泛治疗跌打损伤、风湿痹痛、外科手术后的刀口疼痛、出血等症，对癌症疼痛亦有很好的抑制作用，且无成瘾性，开发前景极为广阔。我国现有生产含独一味及其提取物的现代制剂逾20种，如独一味胶囊、奇正消痛贴等知名品种。独一味药材来源全部依靠野生资源，近年来由于需求量剧增，连年过度采收造成可采资源急剧下降，为了保护日益减少的独一味野生资源，2010年版中国药典将其入药部位由全草修订为地上部分^[2]。

现代研究表明，独一味的活性成分主要有3类成分：环烯醚萜苷，具有很好的镇痛^[3]、止血、促凝血作用^[4]；苯乙醇苷和黄酮均具有镇痛活性^[5，6]。然而，现有关于独一味药材质量控制的报道多为采用HPLC法测定其中1～2类成分。如药典标准只测定了独一味地上部分中山栀苷甲酯和8-O-乙酰山栀苷甲酯这2种环烯醚萜苷的含量^[2]；潘正^[7]等同时测定了独一味根中4种环烯醚萜苷和2种苯乙醇苷；何映霞^[8]等同时测定了独一味地上部分中2种苯乙醇苷和2种黄酮。尚未见同时测定独一味中3类以上成分的报道。

发明内容

为了进一步完善独一味的质量控制标准，本发明拟采用HPLC法建立独一味的多指标含量测定方法，同时测定环烯醚萜苷、苯乙醇苷、黄酮及咖啡酰4类成分中部分化合物的含量，希望此方法能弥补现有研究的不足，进一步完善独一味的质量控制标准，为该药材的合理利用提供科学依据。

本发明提供了同时检测独一味中环烯醚萜苷、苯乙醇苷、黄酮、咖啡酰类成分的方法，它包括如下操作步骤：

(1)取待检药材，以甲醇或含水甲醇提取，制备供试品溶液；

(2)选择山栀苷甲酯、8-O-乙酰山栀苷甲酯、绿原酸、连翘酯苷B、麦角甾苷、芦丁和木犀草苷为对照品，制备对照品溶液；

(3)分别将对照品、供试品溶液注入高效液相色谱仪中，根据外标法检测独一味中上述7种成分即可，色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基键合硅胶为填料

检测波长：山栀苷甲酯、8-O-乙酰山栀苷甲酯检测波长为238nm；绿原酸、连翘酯苷B和麦角甾苷检测波长为330nm；芦丁和木犀草苷检测波长为350nm；

流动相：流动相为A：乙腈-B：0.1％～0.3％磷酸水溶液，梯度洗脱程序：0～15min，12％～12％A；15～20min，12％～20.5％A；20～30min，20.5％～20.5％A。

本发明需要指出，由于独一味中所含的黄酮类成分和苯乙醇苷类具有相似的色谱保留行为，将这两大类成分完全分离具有较大难度，梯度条件变化时，这两类成分的多个色谱峰相对保留时间变化较大，甚至出现色谱峰位置的互换，因此在同一色谱条件下实现独一味中的黄酮类成分和苯乙醇苷类成分全部达到基线分离，实现对单一成分的含量测定是难点。本发明所建立的方法可同时分离测定连翘酯苷B、芦丁、麦角甾苷和木犀草苷这4个较难分离的成分。目前公开的独一味色谱条件，均不能实现同时对本发明中的7种成分进行含量测定。药典条件仅仅测定其中的两个环烯醚萜苷类成分：山栀苷甲酯和8-O-乙酰山栀苷甲酯。

进一步地，步骤(1)中，所述含水甲醇中甲醇浓度为50～80％v/v，优选为60％v/v。

更进一步地，步骤(1)中，提取的方法选自回流、超声、浸渍或渗漉。

进一步地，步骤(2)中，磷酸水溶液浓度为0.1％。

进一步地，所述色谱柱的尺寸为4.6mm×250mm，5μm。

更进一步地，色谱柱柱温为30±2℃。

本发明检测方法中，出峰数量较多，分离度良好，基线平稳，能够对独一味进行有效检测，为保障药材质量提供给了新的选择。本发明首次在同一色谱条件下检测了上述环烯醚萜苷、苯乙醇苷、黄酮及咖啡酰4类成分，共指认了7个具体化合物，可更全面更准确地用于独一味药材的质量控制。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1 对照品(A)及独一味地上部分样品(B)色谱图，其中，1.山栀苷甲酯；2.绿原酸；3.8-O-乙酰山栀苷甲酯；4.连翘酯苷B；5.芦丁；6.麦角甾苷；7.木犀草苷

图2 对比例条件下的独一味HPLC色谱图，其中，3.胡麻属苷、4.山栀苷甲酯、5.绿原酸、8.马钱苷、9.8-O-乙酰山栀苷甲酯、10.连翘酯苷B、11.木犀草苷、12.麦角甾苷

具体实施方式

实施例1 本发明检测方法

(1)取待检独一味药材，以60％v/v甲醇提取，制备供试品溶液；

(2)选择山栀苷甲酯、8-O-乙酰山栀苷甲酯、绿原酸、连翘酯苷B、麦角甾苷、芦丁和木犀草苷为对照品，制备对照品溶液；

(3)分别将对照品、供试品溶液注入高效液相色谱仪中，根据外标法检测独一味中上述7种成分即可，色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基键合硅胶为填料

检测波长：山栀苷甲酯、8-O-乙酰山栀苷甲酯检测波长为238nm；绿原酸、连翘酯苷B和麦角甾苷检测波长为330nm；芦丁和木犀草苷检测波长为350nm；

流动相：流动相为A：乙腈-B：0.1％磷酸水溶液，梯度洗脱程序：0～15min，12％～12％A；15～20min，12％～20.5％A；20～30min，20.5％～20.5％A。

本实施例所用独一味药材是指符合2010版药典的独一味地上部分。

实施例2 方法学考察

1 材料

Utimate 3000高效液相色谱仪(包括四元梯度泵，在线脱气机，自动进样器，柱温箱，VWD3400紫外检测器，Chromeleon色谱工作站，德国戴安)，SartoriusBS224S电子分析天平(德国赛多利斯)，MILLIQ超纯水机(美国Millipore)

山栀苷甲酯、绿原酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、芦丁、麦角甾苷、木犀草苷对照品均购自成都曼思特生物科技有限公司(供含量测定用，纯度≥98％)。乙腈(色谱纯，Fisher)，水为超纯水，其余试剂为分析纯。

独一味自采对口药材24批，购买5批，共计29批(见表1)，由成都中医药大学古锐副研究员鉴定为独一味Lamiophlomis rotata(Benth.)Kudo。

表1 独一味样品来源

(注：1级编号为不同批次，2级编号为不同部位，地上部分包括独一味的茎叶、果序或花序；地下部分包括独一味的根茎和根；全草包括地上和地下部分)

2 方法与结果

2.1 色谱条件Welchrom C₁₈色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为A：乙腈-B：0.1％磷酸水溶液，梯度洗脱(0～15min，12％～12％A；15～20min，12％～20.5％A；20～30min，20.5％～20.5％A)；体积流量1.0mL·min^-1；柱温：30℃；进样量：10μL。山栀苷甲酯、8-O-乙酰山栀苷甲酯检测波长为238nm；绿原酸、连翘酯苷B和麦角甾苷检测波长为330nm；芦丁和木犀草苷检测波长为350nm。按照上述色谱条件进行测定，各成分分离度良好，对照品及样品的色谱图见图1。

2.2 对照品溶液的制备

称取减压干燥至恒重的对照品适量，加入甲醇配制成每1mL含山栀苷甲酯0.288mg、绿原酸0.177mg、8-O-乙酰山栀苷甲酯0.408mg、连翘酯苷B 0.446mg、芦丁0.154mg、麦角甾苷0.512mg、木犀草苷0.368mg的混合对照品溶液A。精密吸取混合对照品溶液A1.0mL，置10mL容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，制备稀释后的混合对照品溶液B。

2.3 供试品溶液的制备

取独一味(中粉)约0.5g，精密称定，精密加入60％甲醇40mL，称定重量，回流提取60min，冷却后补重，摇匀，静置，经0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性关系的考察

分别精密吸取混合对照品B溶液4、8μL以及混合对照品A溶液2、4、8μL进样，以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，分别绘制标准曲线，计算得各对照品的回归方程和线性范围(表2)。

表2 对照品的线性关系和范围

2.5 精密度试验

精密吸取供试品溶液(7-1号)10μL，连续进样5次，记录色谱峰面积。结果山栀苷甲酯、绿原酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、芦丁、麦角甾苷、木犀草苷峰面积的RSD分别是0.72％、0.79％、0.82％、1.25％、1.22％、0.92％和0.88％。表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取同一份样品(7-1号)粉末6份，按2.3项下方法平行制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，记录色谱峰面积。结果山栀苷甲酯、绿原酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、芦丁、麦角甾苷、木犀草苷峰面积的RSD分别是1.70％、1.87％、1.51％、2.41％、2.07％、2.59％和2.32％。表明方法的重复性良好。

2.7 稳定性试验

取同一份供试品溶液(7-1号)，分别在0、2、4、8、12、24h进样6次，记录色谱峰面积。结果山栀苷甲酯、绿原酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、芦丁、麦角甾苷、木犀草苷峰面积的RSD分别是0.98％、1.25％、1.04％、1.30％、1.41％、1.34％和1.28％，表明供试品溶液24h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的7-1号样品粉末(7种成分含量分别为：山栀苷甲酯4.967mg·g^-1、绿原酸7.590mg·g^-1、8-O-乙酰山栀苷甲酯12.472mg·g^-1、连翘酯苷B17.474mg·g^-1、芦丁2.043mg·g^-1、麦角甾苷19.714mg·g^-1、木犀草苷9.395mg·g^-1)约0.25g，平行6份，精密称定。分别依次加入60％甲醇配制的各对照品溶液适量，按供试品溶液制备方法制备。精密吸取加样回收溶液10μL，注入液相色谱仪，测定其含量。根据公式，加样回收率％＝(A-B)/C*100(A为实测量，B为样品中被测物质量C为加入对照品量)，分别计算各成分加样回收率，结果见表3。

表3 独一味中7种成分的加样回收率(n＝6)

2.9 样品的含量测定取独一味药材粉末，按2.3项下方法制备供试品溶液，平行2份。精密吸取供试品溶液10μL或20μL，注入色谱仪进行测定。采用外标法计算独一味药材中7中成分的含量，结果见表4。

表4 独一味药材中7种成分的含量(n＝2)

3 讨论

本研究建立了以HPLC法同时测定独一味中7种成分含量的方法，这7种成分分属环烯醚萜苷、苯乙醇苷、黄酮及咖啡酰4类成分，能较全面评价该药材质量。

3.1 测定波长的确定

分别对7个被测成分进行190～400nm全波长扫描，结果显示山栀苷甲酯、绿原酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、芦丁、麦角甾苷、木犀草苷的最大吸收波长分别是238nm、327nm、237nm、332nm、354nm、332nm和350nm。为了兼顾7个成分的最大吸收，最终确定山栀苷甲酯和8-O-乙酰山栀苷甲酯选用238nm作为检测波长；绿原酸、连翘酯苷B和麦角甾苷选用330nm作为检测波长；芦丁和木犀草苷选用350nm作为检测波长。

3.2 供试品提取方法的考察

分别考察了不同提取方式、不同浓度甲醇、不同料液比和不同提取时间。最终确定以0.5g粉末中加入60％甲醇40mL，回流提取60min，作为供试品溶液的制备方法。

3.2.1 提取方式的考察

精密称取7-1号药材粉末约0.5g，2份，各以回流30min和超声提取30min作为提取方法，以70％甲醇30ml作为提取溶剂，精密吸取10μl注入高效液相色谱仪，色谱条件同2.1，结果如表5所示。

表5 提取方式的考察

结果可知，回流提取的成分色谱峰面积普遍较大，故选取回流提取方式。

3.2.2 甲醇浓度的考察

精密称取7-1号药材粉末约0.5g，4份，分别加入50％、60％、70％、80％甲醇30ml作为提取溶剂，回流提取30min，精密吸取10μl注入高效液相色谱仪，色谱条件同2.1，结果如表6所示。

表6 甲醇浓度的考察

结果可知，60％甲醇提取的成分色谱峰面积普遍较大，故选取60％甲醇作为提取溶剂。

3.2.3 料液比的考察

精密称取7-1号药材粉末约0.5g，4份，分别加入60％甲醇25ml、30ml、40ml、50ml作为提取溶剂，回流提取30min，精密吸取10μl注入高效液相色谱仪，色谱条件同2.1，结果如表7所示。

表7 料液比的考察

结果可知，料液比为1:80的提取效率较高。

3.2.4 提取时间的考察

精密称取7-1号药材粉末约0.5g，4份，以70％的甲醇40ml作为提取溶剂，各回流提取30min、60min、90min、120min，精密吸取10μl注入高效液相色谱仪，色谱条件同2.1，结果如表8所示。

表8 提取时间的考察

结果表明，提取60min时7种成分的峰面积较大，且不再随提取时间延长而增大，故确定提取时间为60min。

最终确定以0.5g粉末中加入60％甲醇40mL，回流提取60min，作为供试品溶液的制备方法。

3.3 色谱条件的考察

对色谱系统(甲醇-水、乙腈-水)、酸种类(磷酸、甲酸、醋酸)、酸水浓度及流动相梯度分别进行了考察。由于样品中连翘酯苷B、芦丁、麦角甾苷、木犀草苷这4个色谱峰的保留时间较为接近，使其全部达到基线分离是本研究的难点。其中连翘酯苷B和麦角甾苷属于苯乙醇苷类成分，芦丁和木犀草苷属于黄酮类成分，前两者与后两者各自具有相似的色谱保留行为。当增大或降低流动相中有机相比例时，两个黄酮色谱峰对流动相变化的响应更为敏感，极易造成麦角甾苷峰与前方的芦丁峰或后方的木犀草苷峰包合。经过反复的条件筛选，最终选定的色谱条件能较为理想的分离以上4个成分。

如图2所示，为相同色谱柱(Welchrom C₁₈柱)；流动相亦为A：乙腈-B：0.1％磷酸水溶液，调整梯度洗脱条件(0～10min，5％～8％A；10～27min，8％～12％A；27～35min，12％～12％A；35～70min，12％～17％A；70～80min，17％～19％A；80～110min，19％～36％A；110～120min，36％～50％A，简称对比例条件)，可同时指认8个色谱峰，但是，与本发明条件相比，该条件有6个相同色谱峰，还指认了胡麻属苷、马钱苷，但无法测定芦丁。

3.4 不同来源独一味样品中7个成分的含量分析

(1)地上部分样品分析23个地上部分样品中，山栀苷甲酯和8-O-乙酰山栀苷甲酯的总含量为0.20％～2.16％，平均为1.44％；22批样品均高于中国药典含上述2种成分总量不得少于0.50％的标准，其中18份样品高于1.0％。7种成分的平均含量分别为：山栀苷甲酯6.18mg·g^-1，绿原酸5.44mg·g^-1、8-O-乙酰山栀苷甲酯8.23mg·g^-1、连翘酯苷B13.67mg·g^-1、芦丁1.34mg·g^-1、麦角甾苷17.21mg·g^-1、木犀草苷6.85mg·g^-1，除山栀苷甲酯外，其他6种成分的23批次数据近似正态分布。各成分组间具有较好的相关性，其中绿原酸含量与连翘酯苷B、芦丁、麦角甾苷、木犀草苷呈极显著正相关；连翘酯苷B含量与芦丁、麦角甾苷、木犀草苷呈极显著正相关；8-O-乙酰山栀苷甲酯与芦丁、麦角甾苷呈显著正相关。

(2)地下部分样品分析7批地下部分样品测定均表明，独一味根及根茎中不含有芦丁和木犀草苷，不含或含微量绿原酸。4批自采地下部分样品(7-2、13-3、17-3、23-4号)中山栀苷甲酯、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B和麦角甾苷4种成分的平均含量分别为6.22mg·g^-1、4.70mg·g^-1、14.45mg·g^-1和7.48mg·g^-1，各成分含量与对应地上部分样品的比值分别为0.52～4.64、0.60～1.14、0.89～1.67和0.25～0.71。其中山栀苷甲酯和连翘酯苷B的含量在地下、地上样品中较接近，而地下部分中8-O-乙酰山栀苷甲酯和麦角甾苷含量较地上部分低。因此，从成分种类多少和含量高低的角度分析，地上部分质量优于地下部分。

(3)果序和花序样品分析5组果序样品(2-2、4-2、13-2、17-2、22-2号)中各成分含量均低于地上部分(22-2号的麦角甾苷除外)，7种成分总量占对应地上部分的0.32～0.75。1个花序样品(23-3号)不含芦丁，其成分总量占对应地上部分的0.90。由此可知，花序与果序样品的成分种类与地上部分较为接近，但含量低于叶。

(4)不同贮存年度的样品分析贮存1年的地上部分样品(23-2号)与其余22批2013年新采地上部分样品(1～22号)相比，各成分的含量均较低，且不含有8-O-乙酰山栀苷甲酯。3个贮存3年以上全草样品(27～29号)的各成分及总含量亦较低，但无测定成分的缺失。独一味贮存过程中成分的降低规律尚待进一步研究。

(5)不同产地和同一产地的样品分析2013年采集的不同产地样品中，阿坝县各成分含量相对较高，但是由于采集时间不同，阿坝县、若尔盖县和碌曲县样品采自7月末、8月初，而甘孜州各县均采自9月，因此其成分积累与采收时间的关系需要深入研究。本实验结合生态学调查建立样地，在样地中采集大小接近的样品供含量测定用，来源于同一样地不同样方的样品均一性存在明显差异。测定表明仅甘肃碌曲县各样方的样品含量极为接近，而若尔盖县、雅江县各样方中样品含量差异较大，其原因值得进一步分析。

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