一种喹喔啉亚胺类化合物作为变异链球菌生物膜抑制剂的制备方法及应用

摘要

一种喹喔啉亚胺类化合物作为变异链球菌生物膜抑制剂的制备方法及应用，涉及抑菌药物筛选技术领域。所述抑制剂由化合物2-(4-甲氧基苯基）-N-(3-{[2-(4-甲氧基苯基）乙基]亚胺基}-1，4-二氢-2-喹喔啉亚基）乙胺与二甲基亚砜（DMSO）组成；制备方法如下：（1）将粉末状的2-(4-甲氧基苯基）-N-(3-{[2-(4-甲氧基苯基）乙基]亚胺基}-1，4-二氢-2-喹喔啉亚基）乙胺 50mg溶解到1mL的二甲基亚砜（DMSO）溶剂中，配制成原始浓度为50mg/mL的抑制剂母液；（2）将抑制剂母液用二甲基亚砜（DMSO）进行梯度稀释，并加入至牛心脑浸液（BHI）液体培养基中，使其抑制剂的最终浓度分别为：0.05μg/mL，0.5μg/mL，5μg/mL和50μg/mL，溶剂DMSO的最终浓度均为1%（v/v）；应用试验表明：本抑制剂能够作为口腔变异链球菌生物膜抑制剂以及新型防龋策略的候选靶向药物。

说明书

技术领域

本发明属于抑菌药物筛选技术领域，具体涉及一种能够抑制变异链球菌生物膜形成和 成熟的小分子化合物，即喹喔啉亚胺类化合物作为变异链球菌生物膜抑制剂的制备方法及 其应用。

背景技术

龋病是人类最常见的口腔疾病，它是在以细菌为主的多种因素作用下，牙体硬组织发 生进行性破坏的一种疾病，表现为牙齿颜色、形态、质地的改变。龋病严重影响口腔的发 音、咀嚼、语言等功能，严重者还可导致牙髓炎及颌骨骨髓炎等多种疾病。无论是婴儿、 青少年或成人，都具有患龋风险。龋病已经成为全球普遍存在的口腔健康及公共卫生问题 (Jeon et al.,2011)。世界卫生组织已将其与肿瘤和心血管疾病并列为人类三大重点防治疾 病。

口腔链球菌，尤其是变异链球菌，是主要的龋病相关性细菌(Bowen et al.,2011)。牙菌 斑生物膜是细菌在口腔中的主要存在形式，也是龋病发生的始动因子。流行病学研究发现， 牙菌斑生物膜中变异链球菌的检出率与龋病的发生呈正相关，而变异链球菌在牙面上定植 并形成生物膜的能力与其毒力关系密切(Takahashi et al.,2011)。葡萄糖基转移酶 (glucosyltransferase，Gtfs)是变异链球菌重要的毒力因子。变异链球菌利用其Gtfs代谢碳 水化合物产生胞外多糖，在口腔细菌对牙面的粘附及生物膜形成方面具有重要作用。因此， Gtfs被公认为是口腔链球菌，特别是变异链球菌最重要的致龋毒力因子之一(Koo et al., 2010)。

控制龋病最有效的方法就是菌斑控制，包括抑制菌斑生物膜形成并定期清除牙面上的 菌斑生物膜(Featherstone,2004)。然而，目前最主要的龋病临床防治策略并不是采用药物抑 制龋病进展，而是采用牙科材料充填龋病的结局——龋洞。氟化物因具有抑制脱矿、促进 再矿化的作用而一直被用于龋病的防治。但是，氟化物防龋效果存在争议：首先，摄入过 多氟化物可能造成氟中毒；其次，氟化物对于牙齿的作用部位具有选择性，对咬合面的点 隙裂沟龋效果较差；同时，氟化物对牙菌斑作用较弱，无法从病因学角度彻底控制龋病 (Cheng et al.,2007)。

研究表明，变异链球菌在其gtfB、gtfC和gtfD基因(分别编码Gtf B、Gtf C和Gtf D蛋白 质，简称Gtfs)分别敲除后，其体外形成生物膜的细胞及胞外基质受到影响，从而使变异 链球菌生物膜形成功能不全(Koo et al.,2010)。这一研究结果提示，如果通过外源性手段 特异性抑制变异链球菌Gtfs，则可抑制口腔生物膜形成，进而对龋病防治提供新的思路和 途径。

因此，从龋病病因和发病机制入手，寻找新的防龋策略并研发出新的有效的防龋药物 是目前研究的热点，也是亟待攻克的难题。对比文献CN103140242A公开了一种“口腔用 组合物”，其目的是通过豆类提取物来控制由龋齿病原菌引起的生物膜的形成，从而抑制龋 齿病。但仅仅是介绍了通过实验对生物膜形成的抑制活性评价以及豆类组合物的提取方 法。本发明人通过潜心研究在众多的喹喔啉亚胺类化合物中筛选出一种化合物，通过对龋 菌生物膜的形成、成熟抑制实验以及浮游状态下变异链球菌生长影响实验，证实了本发明 能够有效抑制和清除致龋菌生物膜；从而克服了现有防龋药物的诸多不足，并可开发作为 新型防龋策略的候选靶向药物。

发明内容

本发明的目的是测定一种喹喔啉亚胺类化合物对变异链球菌生物膜的抑制作用，以期 提供一种喹喔啉亚胺类化合物作为变异链球菌生物膜抑制剂在抑制该生物膜的形成和成 熟中的制备方法及其应用，克服现有防龋药物氟化物不能靶向作用于牙菌斑生物膜的不 足。

实现本发明目的之技术解决方案如下面所述：一种式(1)结构的喹喔啉亚胺类小分 子化合物2-(4-甲氧基苯基)-N-(3-{[2-(4-甲氧基苯基)乙基]亚胺基}-1，4-二氢-2-喹喔啉亚 基)乙胺在抑制变异链球菌生物膜形成和成熟中作为变异链球菌生物膜抑制剂的用途，所 述抑制剂由式(1)化合物2-(4-甲氧基苯基)-N-(3-{[2-(4-甲氧基苯基)乙基]亚胺基}-1， 4-二氢-2-喹喔啉亚基)乙胺与二甲基亚砜(DMSO)组成；

所述式(1)结构如下：

其中，分子式为C26H28N4O2；分子量为428.53。

一种喹喔啉亚胺类化合物作为变异链球菌生物膜抑制剂的制备方法：

(1)将粉末状的2-(4-甲氧基苯基)-N-(3-{[2-(4-甲氧基苯基)乙基]亚胺基}-1，4-二 氢-2-喹喔啉亚基)乙胺50mg溶解到1mL的二甲基亚砜(DMSO)溶剂中，配制成原始 浓度为50mg/mL的抑制剂母液；

(2)将上述配好的抑制剂母液用二甲基亚砜(DMSO)进行梯度稀释，并加入至牛心 脑浸液(BHI)液体培养基中，使其抑制剂的最终浓度分别为：0.05μg/mL，0.5μg/mL，5 μg/mL和50μg/mL，而溶剂DMSO的最终浓度均为1％(v/v)。

所述抑制剂对于变异链球菌生物膜的形成有抑制作用。

所述抑制剂对于变异链球菌生物膜的成熟有抑制作用。

进一步的，所述抑制剂能够特异性地抑制变异链球菌生物膜，而对浮游状态的变异链 球菌生长无明显抑制作用。

更进一步的，所述抑制剂能够作为口腔变异链球菌生物膜抑制剂以及开发新型防龋策 略的候选靶向药物。

本发明所述的喹喔啉亚胺类化合物是一种已知化合物，其中文名称为2-(4-甲氧基苯 基)-N-(3-{[2-(4-甲氧基苯基)乙基]亚胺基}-1，4-二氢-2-喹喔啉亚基)乙胺；其英文名称 为：

2-(4-methoxyphenyl)-N-(3-{[2-(4-methoxyphenyl)ethyl]imino}-1,4-dihydro-2-quinoxalinyl  idene)ethanamine。其ZINC数据库ID为ZINC08382282；分子式为C₂₆H₂₈N₄O₂；分子量为 428.53；

国际化合物标识是：

InChI＝1S/C26H28N4O2/c1-31-21-11-7-19(8-12-21)15-17-27-25-26(30-24-6-4-3-5-23(24) 29-25)28-18-16-20-9-13-22(32-2)14-10-20/h3-14H,15-18H2,1-2H3,(H,27,29)(H,28,30)；大鼠口 服半数致死量(Rat Oral LD₅₀)为10200mg/Kg。该化合物可以从商业途径购买得到，本发 明所使用的该化合物是从荷兰Specs公司(网址：http://www.specs.net)购买得到。

本发明测定了该喹喔啉亚胺类化合物对变异链球菌生物膜的抑制作用。在本发明的 实施例中，申请人详细描述使用该化合物抑制和清除变异链球菌生物膜的具体方法。本发 明的实施例中涉及的变异链球菌菌株的公共获得来源为：中国医学细菌保藏管理中心，菌 种编号为：32401。网址：http://www.cmccb.org.cn/)。

本发明中将不同浓度(0.05μg/mL，0.5μg/mL，5μg/mL和50μg/mL)的抑制剂预溶解 于二甲基亚砜(DMSO)添加到用于培养变异链球菌生物膜的BHI蔗糖液体培养基中，使 各组中二甲基亚砜(DMSO)终浓度均为1％(v/v)，再分别接种经过夜活化培养的变异链 球菌，于37℃兼性厌氧培养24小时后弃上清液，漂洗生物膜细胞，重悬并稀释细胞后于 BHI固体培养基进行培养，通过读取不同组别的菌落形成单位(CFU)来判断所述抑制剂 对变异链球菌生物膜形成的抑制效果。对照1为不添加抑制剂，对照2为添加终浓度为1％ (v/v)的二甲基亚砜(DMSO),实验过程中的数据是与两个对照组比较来评价使用候选 抑制剂得到的抑制效果。采用同样的方法，通过与对照组比较还测定了抑制剂对变异链球 菌24小时生物膜进一步成熟的抑制效果。此外，本发明还将不同浓度的抑制剂添加到BHI 液体培养基中，接种变异链球菌后于37℃兼性厌氧培养16小时，通过读取不同时刻的OD 值并与对照组比较来判断变异链球菌的浮游生长是否受到抑制剂影响。对照1、2如上所 述，对照3为添加250μg/mL氨苄西林的液体培养基。通过与3个对照组比较来评价候选 抑制剂对变异链球菌的浮游生长是否受到影响。

本发明的显著优点与积极效果：

1、本发明抑制剂其筛选的溶质小分子化合物分子量小，结构相对简单，较易溶于多种 溶剂或应用于多种赋型、载体。

2、本发明抑制剂通过试验及生物学统计，证实具有特异性好，针对性强，能够显著抑 制变异链球菌生物膜的形成和成熟，同时对浮游状态下的变异链球菌无明显影响的特性。

3、本发明抑制剂有效的克服了现有防龋药物氟化物不能靶向作用于牙菌斑生物膜的不 足，能够有效抑制变异链球菌生物膜的形成和成熟，可以作为开发新型防龋策略的候选靶 向药物。

附图说明

图1是所述不同浓度的抑制剂处理组对变异链球菌生物膜形成的抑制结果，以及添加 DMSO与不添加DMSO的对照组结果。

图2是所述添加5μg/mL抑制剂与添加50μg/mL抑制剂处理组对变异链球菌24小时 生物膜进一步成熟的抑制结果，以及添加及不添加DMSO的对照组测定结果。

图3是所述添加浓度分别为50μg/mL、5μg/mL的抑制剂处理组与添加及不添加 DMSO的对照组，添加氨苄西林的对照组；对浮游状态下变异链球菌生长的影响测定结果。

图4是所述酶谱法分析抑制剂对变异链球菌Gtfs蛋白质活性的影响。图左为未经抑制 剂处理的变异链球菌(菌种编号为：32401)，即对照组；图右为加入50μg/mL抑制剂处 理后的变异链球菌。

术语解释

CFU：菌落形成单位；

DMSO:二甲基亚砜；BHI：牛心脑浸液；

具体实施方式

结合图1、图2、图3、图4及实施例对本发明做进一步说明：

参见图1。是本抑制剂对变异链球菌生物膜形成的抑制结果。从左到右分别为添加抑 制剂(从左到右浓度分别为：50，5，0.5，0.05μg/mL)的处理组，添加DMSO的对照组， 和不添加DMSO的对照组。其中加入终浓度为50μg/mL的抑制剂，对变异链球菌生物膜 形成的抑制效果最明显。加入终浓度为5μg/mL的抑制剂，抑制效果次之。加入终浓度为 0.5μg/mL的抑制剂，抑制效果再次之。加入终浓度为0.05μg/mL的抑制剂后，与添加和 不添加DMSO的对照组相比，抑制效果无统计学差异，说明溶剂DMSO对变异链球菌生 物膜的形成并无影响，同时终浓度为0.05μg/mL的抑制剂对变异链球菌生物膜的形成抑制 作用较小。因此选择终浓度为50μg/mL、5μg/mL作为本发明后续实施例的候选浓度。

参见图2。是抑制剂对变异链球菌24小时生物膜进一步成熟的抑制结果。从上到下分 别为添加及不添加DMSO的对照组，添加5μg/mL抑制剂的处理组，和添加50μg/mL抑 制剂的处理组。其中添加及不添加DMSO的对照组测试结果无统计学差异，说明溶剂 DMSO对变异链球菌24小时生物膜进一步成熟并无影响。添加50μg/mL抑制剂的处理组， 对变异链球菌24小时生物膜进一步成熟的抑制效果明显优于添加5μg/mL抑制剂的处理 组。

参见图3。是抑制剂对浮游状态下变异链球菌生长的影响。其中，第16小时，添加抑 制剂的处理组(浓度分别为50μg/mL、5μg/mL)与添加及不添加DMSO的对照组，各组 间OD值均无统计学差异，说明溶剂DMSO对浮游状态下的变异链球菌生长抑制均不明显， 同时不同浓度的抑制剂对浮游状态下的变异链球菌生长抑制均不明显；而添加250μg/mL 氨苄西林的对照组数值小于其余4组，差异有统计学意义，说明250μg/mL氨苄西林能够 明显抑制浮游变异链球菌的生长。

参见图4。酶谱法分析抑制剂对变异链球菌Gtfs蛋白质活性的影响。图左为未经抑制 剂处理的变异链球菌(菌种编号为：32401)，即对照组。图右为加入50μg/mL抑制剂处 理后的变异链球菌。处理后，位于下方的Gtf C条带亮度有明显降低，揭示分子量较小； 而Gtf B，D条带亮度增加揭示分子量相近。说明抑制剂对变异链球菌的Gtf B，C，D蛋 白质有作用，分析猜测其对变异链球菌生物膜的抑制作用的机理可能与Gtf B，C，D有关。

实施例1：菌株的培养和液体抑制剂的制备方法

供试菌株的准备：

本实施例的供试菌株涉及变异链球菌(菌株编号：32401；从中国医学细菌保藏管理 中心获得，网址：http://www.cmccb.org.cn/)。

培养基的组分及制备：

牛心脑浸液(为了叙述方便，以下简称为BHI)液体培养基的组分及其配制方法：将 37g商购的BHI粉末(该BHI粉末购自美国Sigma公司，货号：53286)加入1000mL蒸 馏水中，高温高压(121.3℃，103.4kPa)灭菌15分钟，冷却后待用。该液体培养基是针对 变异链球菌浮游培养的典型液体培养基。

BHI蔗糖液体培养基的组分及其配制方法：分别将37g商购BHI粉末该BHI粉末购自美 国Sigma公司，货号：53286)和10g蔗糖(Thermo Fisher Scientific，USA，货号：S3-500) 加入1000mL蒸馏水中，高温高压(121.3℃，103.4kPa)灭菌15分钟，冷却后待用。该液 体培养基是针对变异链球菌生物膜培养的典型液体培养基。

BHI固体培养基的组分及其配制方法：将52g商购BHI粉末(该BHI粉末购自美国Sigma 公司，货号：70138)加入1000mL蒸馏水中，高温高压(121.3℃，103.4kPa)灭菌15分钟， 冷却后待用。该固体培养基是针对变异链球菌菌落分离培养的典型固体培养基。

候选抑制剂的准备：

本实施例的抑制剂是将粉末状的2-(4-甲氧基苯基)-N-(3-{[2-(4-甲氧基苯基)乙基]亚 胺基}-1，4-二氢-2-喹喔啉亚基)乙胺50mg溶液解到1mL的二甲基亚砜(DMSO)溶剂中， 配制成原始浓度为50mg/mL的抑制剂母液；其中采用的二甲基亚砜(DMSO)，购自美国 Thermo公司，货号：BP231-4；形成液体状态的抑制剂母液便于候选实验使用。候选实验 中，将上述配好的抑制剂母液用二甲基亚砜(DMSO)进行梯度稀释，形成不同浓度的预 溶解于二甲基亚砜(DMSO)候选抑制剂。具体做法是，向20μL抑制剂母液中加入180μL  DMSO，使之成为浓度为5mg/mL的溶液；取20μL浓度为5mg/mL的溶液，加入180μL  DMSO，使之成为浓度为0.5mg/mL的溶液。取20μL浓度为0.5mg/mL的溶液，加入180μL  DMSO，使之成为浓度为0.05mg/mL的溶液。最后，取上述4种浓度的贮存液各80μL，分 别加入到80mL的液体培养基中备用，使抑制剂的最终浓度分别为：50μg/mL，5μg/mL， 0.5μg/mL和0.05μg/mL，溶剂DMSO的最终浓度均为1％(v/v)。

接种及培养方法：

将变异链球菌(菌种编号为：32401)菌液接种于BHI固体培养基上，37℃、兼性厌 氧(5％CO₂)培养24小时。用接种环挑取一个单菌落接种于3mL BHI液体培养基，37℃、 兼性厌氧(5％CO₂)培养。用紫外可见光分光光度计测定其在595nm波长的吸收值(OD₅₉₅)。 将培养至对数生长期(OD₅₉₅≈0.6)的菌悬液按照1：100比例稀释于BHI液体培养基(用 于变异链球菌浮游培养)或BHI蔗糖液体培养基(用于培养变异链球菌生物膜)并分装到 48孔板中继续培养。整个操作在生物安全柜的无菌条件下进行。

实施例2：抑制剂对变异链球生物膜形成的抑制实验

按照实施例1的无菌操作程序，将实施例1的变异链球菌菌悬液(菌种编号为：32401) 分别接种于含不同浓度抑制剂的BHI蔗糖液体培养基中，以确定抑制剂对变异链球菌生物 膜形成的抑制活性。具体方法是：按照1：100比例将实施例1中的变异链球菌菌悬液分 别接种到添加有浓度梯度为0.05μg/mL，0.5μg/mL，5μg/mL和50μg/mL抑制剂的BHI 蔗糖液体培养基中，于37℃、兼性厌氧(5％CO₂)培养16小时。然后，小心吸出48孔板 中的浮游细菌及上清液，用pH＝7.4，0.01M的磷酸盐缓冲液(该缓冲液购自美国Thermo 公司，货号：P5368)。一袋内容物溶于1000ml去离子水，混匀)清洗并洗脱底部的生物 膜细胞，经10⁶倍稀释后，涂布于BHI固体培养基。经37℃、兼性厌氧(5％CO₂)培养 48小时后，读取BHI固体培养基上的菌落形成单位(CFU)数目，每组细菌浓度以lg^CFU/mL 表示。对照1为不添加抑制剂，对照2为添加终浓度为1％(v/v)的二甲基亚砜(即DMSO， 该DMSO购自美国Thermo公司，货号：BP231-4)。实验过程中的数据是与两个对照进 行比较来评价抑制剂对变异链球菌生物膜形成的抑制效果。结果如图1所示。从图1可以 明显看出抑制剂能够有效抑制变异链球菌生物膜的形成，具有剂量-反应关系。同时抑制剂 的溶剂DMSO对变异链球菌生物膜的形成并无影响。

实施例3：抑制剂对变异链球菌生物膜成熟的抑制实验

按照实施例1的无菌操作程序，首先将实施例1的变异链球菌菌悬液(菌种编号为： 32401)接种于BHI蔗糖液体培养基中形成生物膜，然后分别加入不同浓度的抑制剂来确 定抑制剂对变异链球菌生物膜成熟的抑制活性。具体方法是：按照1：100的稀释比例将 实施例1中的变异链球菌菌悬液接种到含有BHI蔗糖液体培养基的48孔板中，于37℃、 兼性厌氧(5％CO₂)培养24小时，形成生物膜。此时，分别向变异链球菌的生物膜培养 物中添加最终浓度为5μg/mL和50μg/mL的抑制剂，于37℃、兼性厌氧(5％CO₂)继续 培养48小时。然后，小心吸出48孔板中的浮游细菌及上清液，用pH＝7.4，0.01M的磷酸 盐缓冲液(该缓冲液购自美国Thermo公司，货号：P5368。一袋内容物溶于1000mL去 离子水，混匀)清洗并洗脱底部的生物膜细胞，经10⁶稀释后，涂布于BHI固体培养基。 经37℃、兼性厌氧(5％CO₂)培养48小时后，读取BHI固体培养基上的菌落形成单位(CFU) 数目，每组细菌浓度以lg^CFU/mL表示。对照1为不添加抑制剂，对照2为添加终浓度为 1％(v/v)的二甲基亚砜(即DMSO，该DMSO购自美国Thermo公司，货号：BP231-4)。 实验过程中的数据是与两个对照进行比较来评价抑制剂对变异链球菌生物膜成熟的抑制 效果。结果如图2所示。从图2可以看出抑制剂能够有效抑制变异链球菌生物膜的进一步 成熟，具有剂量-反应关系。同时抑制剂的溶剂DMSO对变异链球菌生物膜的成熟并无影 响。

实施例4：抑制剂对浮游状态下变异链球菌生长的影响

按照实施例1的无菌操作程序，将实施例1的变异链球菌菌悬液(菌种编号为：32401) 分别接种于含不同浓度抑制剂的BHI液体培养基中来确定抑制剂对浮游生长状态变异链球 菌的影响。具体方法是：按照1：100比例将实施例1中的变异链球菌菌悬液分别接种到 添加有浓度梯度为5μg/mL和50μg/mL抑制剂的BHI液体培养基中，于37℃、兼性厌氧 (5％CO₂)培养16小时，期间每小时读取一次595nm波长下的OD值，并与对照组(含 对照1、对照2和对照3)进行比较来判断变异链球菌的浮游生长是否受到影响。对照1 为不添加抑制剂，对照2为添加终浓度为1％(v/v)的二甲基亚砜(即DMSO，该DMSO 购自美国Thermo公司，货号：BP231-4)，对照3为添加250μg/mL氨苄西林(该氨苄西 林购自美国Sigma公司，货号：A9393)。实验过程中的数据是与三个对照进行比较来评 价抑制剂对浮游状态变异链球菌生长的影响。结果如图3所示。从图3可以看出，250μg/mL 氨苄西林作为阳性对照能够明显抑制浮游变异链球菌的生长，而不同浓度的抑制剂对浮游 状态下的变异链球菌生长抑制均不明显。同时抑制剂的溶剂1％(v/v)DMSO对浮游状态下 的变异链球菌生长无影响。该实施例的结果与实施例2和实施例3的结果共同说明本发明 所述抑制剂能够特异性地抑制变异链球菌生物膜，而对浮游状态的变异链球菌生长无明显 抑制作用。

实施例5：抑制剂对变异链球菌Gtfs蛋白质活性的影响

按照实施例1的无菌操作程序，变异链球菌菌种(菌种编号为：32401)接种于BHI 琼脂平板培养基上，37℃、兼性厌氧(5％CO₂)孵育24小时。用接种环挑取一个单菌落 接种于BHI液体培养基进行增菌培养18小时，之后1:100稀释接种于新鲜的养BHI液体 培基。分别取8mL新鲜菌液两管，其中一管加入80μL 50μg/mL抑制剂，另一管加入80 μL二甲基亚砜(即DMSO，该DMSO购自美国Thermo公司，货号：BP231-4)作为对照。

变异链球菌产生Gtfs并将其释放到胞外，所以可以通过浓缩细菌培养液来快速，简便 的收集Gtfs。以37℃、兼性厌氧(5％CO₂)孵育约1小时，至OD₅₉₅≈0.8。低温离心(4℃， 4000转/分钟)菌液两次，每次5分钟，分别收集两管上清液置于50kDa超滤管(该超滤管 购自德国Merck Millipore公司，货号：UFC805096)，反复离心(4℃，4000转/分钟)浓缩 直至体积约为40μL，此浓缩液即为粗提的Gtfs蛋白浓缩液。分别取20μL Gtfs蛋白浓缩液， 加入20μL的上样缓冲液(即2SDS PAGE Sample Loading Buffer，购自上海生工生物工程 有限公司，货号：SD8321)。加样于10孔8％的SDS-PAGE凝胶，每孔加样20μL，电压150 V，70分钟，4℃电泳。电泳凝胶于2.5％的Triton X-100(该Triton X-100购自美国Amresco 公司，货号为：9002-93-1)中震荡洗脱复性三次，每次10分钟。然后置于Gtfs酶谱孵育缓 冲液中37℃过夜孵育。观察在暗背景下蛋白胶上的白色条带。

酶谱孵育缓冲液的配置方法为：取磷酸氢二钠8.9克(购自上海生工生物工程有限公司， 货号：S0404)，磷酸二氢钠16.4克(购自上海生工生物工程有限公司，货号：S0571)， 50克蔗糖(购自Thermo Fisher Scientific，USA，货号：S3-500)，2克葡聚糖T70(购自上 海生工生物工程有限公司，货号：DB0375)加无菌水至1升。

经酶谱法分析的蛋白胶结果显示(图4)，变异链球菌菌株经50μg/mL抑制剂处理后， Gtf C(分子量较小)条带亮度有明显降低，提示处理后Gtf C酶活性降低，而Gtf B，D条带 亮度增加(分子量相近，位置重合)。说明抑制剂对变异链球菌的Gtf B，C，D有作用， 分析猜测其对变异链球菌生物膜的抑制作用可能与其对Gtf B，C，D活性的影响有关。