用于TNT检测的氧化石墨烯光学生物传感器的制备方法

摘要

本发明公开了一种用于TNT（2,4,6-三硝基甲苯）检测的氧化石墨烯光学生物传感器的制备方法，将对TNT特异性敏感的多肽与氧化石墨烯纳米片共价交联，实现了多肽的TNT特异敏感性和氧化石墨烯独特光学性质的结合。该方法构建的交联多肽的氧化石墨烯生物传感器可稳定、简便地将TNT分子结合到氧化石墨烯纳米片表面，从而引起其光学性质的改变，导致传感器紫外吸收光谱发生变化，进而完成对目标分子TNT的检测。本发明制备的交联多肽的氧化石墨烯生物传感器灵敏度高，检测下限低，特异性强且稳定性好。

说明书

技术领域

本发明涉及一种传感器件的制备技术，尤其涉及一种用于TNT（2,4,6-三硝基甲苯）特异性检测的交联多肽的氧化石墨烯光学生物传感器的制备方法。 

背景技术

氧化石墨烯是近年来一种热门的碳纳米片材料。其上丰富的含氧官能团使其具有良好的亲水性、独特的光学性质以及易于进行生化修饰性等性质，在生物传感领域、荧光检测领域和光电领域具有很大应用价值。目前针对爆炸物如TNT（2,4,6-三硝基甲苯）和DNT（ 2,4-二硝基甲苯）等的检测对公共安全和环境保护具有重要意义。在各类爆炸物检测方法中，生物传感器以其模拟生物系统的高灵敏度和可微型化引起了高度关注和广泛研究。在众多生物传感器的敏感元件中，多肽作为一种可人工合成的生物识别分子，具有化学多样性和特定的生物敏感性，可与多种物质结合形成复杂多样的结合物并维持长时间的稳定性和敏感性，因此成为一种理想的生物传感器敏感元件。利用氧化石墨烯和多肽的这些优势，构建一种新型的基于特定序列交联多肽氧化石墨烯的光学生物传感器，可以高灵敏、高特异性地稳定地检测爆炸物（TNT），并在安全检测、环境污染监测等方面具有重要应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于TNT特异性检测的交联多肽的氧化石墨烯光学生物传感器的制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种用于TNT检测的氧化石墨烯光学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）氧化石墨烯纳米片分散液的配置：取氧化石墨烯粉末分散在去离子水中，获得1 mg/mL的氧化石墨烯分散液，然后进行冰水浴超声30分钟，再以3000 r.p.m.的速度离心30分钟，取上清液，即为良好分散的氧化石墨烯分散液；

（2）将多肽固定在步骤1得到的氧化石墨烯分散液中的氧化石墨烯上，得到交联多肽的氧化石墨烯分散液，该步骤通过以下子步骤来实现：

（2.1）在氧化石墨烯分散液中依次加入EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）粉末和NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）粉末，所述氧化石墨烯、EDC粉末和NHS粉末质量比为1:1:1，然后冰水浴超声1小时，得到悬浊液；

（2.2）向步骤2.1中得到的悬浊液中加入NaOH溶液调节液体pH至8.0；

（2.3）人工合成TNT敏感的多肽，其氨基酸序列为WHWQRPLMPVSI，分散在浓度为0.1 M的磷酸缓冲盐溶液（PBS）中，得到浓度为250 mg/mL的多肽溶液；将该多肽溶液加入步骤2.2得到的pH为8.0的悬浊液中，悬浊液与多肽溶液的体积比为10:1，4 °C避光静置过夜；

（2.4）取出避光保存的液体并以13000 r.p.m.离心30分钟，取沉淀，用去离子水重复冲洗3次，再重新分散在去离子水中，即可获得交联多肽的氧化石墨烯分散液，将该分散液加入光谱仪即组成本发明用于TNT检测的氧化石墨烯光学生物传感器，分散液平时置于4 ℃条件下备用。

本发明的有益效果是，本发明将特异序列多肽固定在氧化石墨烯纳米片上，与光谱仪结合构建了交联多肽的氧化石墨烯光学生物传感器。该方法构建的交联多肽氧化石墨烯生物传感器实现了将多肽简便并稳定地固定在氧化石墨烯纳米片上，检测时，目标分子TNT与多肽的特异性结合引起传感器光学特性的改变，导致传感器紫外吸收光谱相应变化，实现对TNT的特异性光学检测。该生物传感器检测特异性高、检测下限低、稳定性好。

附图说明

图1为本发明交联多肽的氧化石墨烯光学生物传感器制备图；

图2为本发明交联多肽氧化石墨烯光学生物传感器紫外吸收光谱表征图；

图3为本发明交联多肽氧化石墨烯光学生物传感器分别检测不同浓度的TNT分子溶液的紫外吸收光谱图；

图4为本发明交联多肽的氧化石墨烯光学生物传感器分别与不同浓度TNT溶液发生反应后紫外吸收峰吸收度与TNT浓度之间的统计关系图；

图5为本发明交联多肽氧化石墨烯光学生物传感器分别检测不同浓度的DNT分子溶液的紫外吸收光谱图；

图6为本发明交联多肽氧化石墨烯光学生物传感器分别检测不同浓度的乙酸异戊酯气味分子溶液的紫外吸收光谱图；

图7为本发明交联多肽的氧化石墨烯光学生物传感器分别检测不同浓度TNT、DNT和乙酸异戊酯溶液得到的紫外吸收峰吸收度与物质浓度之间的统计对比图。

具体实施方式

以下结合附图及具体实施例对本发明作详细描述，但并不是限制本发明。

本发明用于TNT检测的氧化石墨烯光学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

1、氧化石墨烯纳米片分散液的配置

取5 mg Hummers法制得的纯净氧化石墨烯粉末加入5 mL去离子水中，加入冰水浴（0 °C）中在40W功率下超声30分钟，使得氧化石墨烯在水中呈棕色片状分散，再将该液体以3000 r.p.m.离心三十分钟去除多余悬浮物质，滤去少量沉淀，得到的离心上清液即为澄清的棕色氧化石墨烯分散液（约为1 mg/mL）。

2、多肽在氧化石墨烯片上的固定

首先，向澄清的氧化石墨烯分散液中依次加入5 mg EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺）和5 mg NHS（N-羟基琥珀酰亚胺），然后将获得的混合物在冰水浴中超声1小时，使氧化石墨烯片上的羧基与NHS结合成稳定酯键，得到的胶状悬浊液用NaOH溶液调节pH到8.0，为后续的多肽交联做准备。

人工合成TNT敏感的多肽，其氨基酸序列为WHWQRPLMPVSI，分散在浓度为0.1 M的PBS溶液中，得到浓度为250 mg/mL的多肽溶液；将该多肽溶液加入上述pH为8.0的悬浊液中，悬浊液与多肽溶液的体积比为10:1，4 °C避光静置过夜，使多肽与混合液中的酯类物质充分反应，多肽上的氨基将与氧化石墨烯纳米片上的羧基形成肽键，完成多肽与氧化石墨烯纳米片的交联。取出避光保存的液体并以13000 r.p.m.的速度离心30分钟，将交联多肽的氧化石墨烯纳米片离心出来。得到的沉淀用去离子水重复冲洗3次，再以1 mg/mL的浓度重新分散在去离子水中，即得交联多肽的氧化石墨烯分散液，该分散液与光谱仪结合即得本发明氧化石墨烯光学生物传感器，分散液置于4℃条件下备用。制备过程示意如图1所示。

交联多肽的氧化石墨烯的光学特性表征如下：

首先对步骤1中的氧化石墨烯分散液进行紫外吸收光谱扫描，将扫描的光谱作为对照，取200 μL氧化石墨烯分散液加入光谱仪测试腔（石英皿）中，光谱仪可以采用海洋光学的USB2000+产品，具体测试参数为积分时间100 ms，扫描波长200 nm ~ 400 nm，得到氧化石墨烯的紫外吸收光谱，一次测量结束后，先缓慢吸出上述测量溶液，然后加入400 μL的去离子水，静置5分钟后缓慢吸出去离子水，该步骤重复3次，用于清洗上次测量残留的混合溶液，再用氮气吹干测量腔备用。再以光谱仪作为仪器平台对步骤2得到的交联多肽的氧化石墨烯分散液进行紫外吸收光谱扫描，向光谱仪测试腔中加入200 μL交联多肽氧化石墨烯分散液，对其在相同测试参数下进行紫外光谱扫描，得到交联多肽的氧化石墨烯紫外吸收光谱，一次测量结束后，先缓慢吸出上述测量溶液，然后加入400 μL的去离子水，静置5分钟后缓慢吸出去离子水，该步骤重复3次，用于清洗上次测量残留的混合溶液，再用氮气吹干测量腔备用。将交联多肽的氧化石墨烯的紫外吸收光谱与氧化石墨烯的紫外吸收光谱进行比较，交联多肽的氧化石墨烯的吸收峰相对氧化石墨烯的吸收峰有向长波长的偏移，即前者的吸收峰对应的波长比后者的大，如图2所示，证明本发明交联多肽的氧化石墨烯生物传感器构建成功。

本发明基于交联多肽的氧化石墨烯生物传感器可用于特异性检测TNT，该应用具体如下：

1.配制待测TNT标准样品溶液：采用溶剂为无水甲醇、浓度为1 mg/mL的待测TNT标准贮备溶液稀释配制6种浓度梯度（10^-8 mg/mL、10^-7 mg/mL、10^-6 mg/mL、10^-5 mg/mL、10^-4 mg/mL和 10^-3 mg/mL）的标准样品溶液，稀释底液为无水甲醇；

2.检测TNT标准样品溶液，建立光照波长-紫外吸收度曲线，具体包括如下子步骤：

2.1进行空白对照溶液紫外吸收光谱的测量，选取无水甲醇作为空白对照的目标检测物，为了排除甲醇对氧化石墨烯片在溶液中分散的影响，交联多肽的氧化石墨烯分散液与无水甲醇的体积比为10:1，将按图1流程制得的交联多肽的氧化石墨烯分散液200 μL与20 μL的无水甲醇均匀混合，再将该混合液加入到光谱仪的测量腔中，设置光谱仪测量参数：积分时间100毫秒，平均次数50次，平滑度为10，扫描波长为200~400 nm，以光谱仪为仪器平台对该空白对照溶液进行紫外吸收光谱扫描，测量结束后，先缓慢吸出上述测量溶液，然后加入400 μL的去离子水，静置5分钟后缓慢吸出去离子水，该步骤重复3次，用于清洗上次测量残留的混合溶液；

2.2进行TNT标准样品溶液的测量：向测量腔中加入交联多肽的氧化石墨烯分散液200 μL与20 μL的10^-8 mg/mL的TNT标准样品溶液的均匀混合液，重复上述测量步骤用于TNT样品溶液的紫外吸收光谱检测；为了排除甲醇对氧化石墨烯片在溶液中分散的影响，交联多肽的氧化石墨烯分散液与TNT标准样品溶液的体积比同样为10:1，因此得到的是10^-9 mg/mL的TNT样品溶液对应的紫外吸收光谱，该光谱被连续重复测量3次，一次测量结束后，先缓慢吸出上述测量溶液，然后加入400 μL的去离子水，静置5分钟后缓慢吸出去离子水，该步骤重复3次，用于清洗上次测量残留的混合溶液；

2.3重复上述空白测量和TNT标准样品溶液的测量，直至完成10^-7 mg/mL、10^-6 mg/mL、10^-5 mg/mL、10^-4 mg/mL和10^-3 mg/mL TNT标准样品溶液的测量，最终得到交联多肽的氧化石墨烯生物传感器与6个不同浓度（10^-9 mg/mL、10^-8 mg/mL、10^-7 mg/mL、10^-6 mg/mL、10^-5 mg/mL和10^-4 mg/mL）下的TNT样品溶液相互作用的紫外吸收光谱，如图3所示；将每个浓度TNT标准样品溶液重复测量3 ~ 5次，并统计每个浓度TNT标准样品溶液的紫外吸收峰对应的吸收度，得到TNT标准样品溶液浓度与其紫外吸收峰对应吸收度之间的关系曲线y=a^-bx，其中，x为TNT标准样品溶液实际浓度（10^-9 ~ 10^-4 mg/mL），y为紫外吸收峰对应吸收度，a和b为常数。图4所示为6个浓度TNT标准样品溶液重复4次测量后得到的紫外吸收峰吸收度统计结果，其中，吸收度数值点对应紫外吸收峰吸收度4次测量平均值，图上的标准误差对应根据4次测量吸收峰吸收度得到的标准差（SD），从图4可以看出本发明交联多肽的氧化石墨烯生物传感器的检测下线为10^-9 mg/mL，并且结果稳定，重复性好；

3.检测DNT标准样品溶液和乙酸异戊酯气味分子标准样品溶液，验证本发明交联多肽的氧化石墨烯生物传感器的特异性，具体包括以下子步骤：

3.1配制待测DNT标准样品溶液：采用溶剂为无水甲醇、浓度为1 mg/mL的待测DNT标准贮备溶液稀释配制6种浓度梯度（10^-8 mg/mL、10^-7 mg/mL、10^-6 mg/mL、10^-5 mg/mL、10^-4 mg/mL和 10^-3 mg/mL）的标准样品溶液，稀释底液为无水甲醇；配制待测乙酸异戊酯标准样品溶液：称取1 mg乙酸异戊酯加入1 mL甲醇溶液中，配置浓度为1 mg/mL的待测乙酸异戊酯标准贮备溶液，再稀释配制6种浓度梯度（10^-8 mg/mL、10^-7 mg/mL、10^-6 mg/mL、10^-5 mg/mL、10^-4 mg/mL和 10^-3 mg/mL）的标准样品溶液，稀释底液为无水甲醇。

3.2按照步骤2所述方法分别重复4次测量各浓度DNT标准样品溶液和乙酸异戊酯气味分子标准样品溶液，得到DNT标准样品溶液和乙酸异戊酯气味分子标准样品溶液的紫外吸收光谱图，分别如图5和图6所示。进而得到样品溶液浓度-紫外吸收峰吸收度增长值柱状统计图，如图7所示，其中，紫外吸收峰吸收度增长值为各溶液吸收峰吸收度数值平均值与空白对照溶液吸收峰吸收度数值之差，图上的标准误差对应由各溶液4次重复测量得到的吸收度计算出的标准差（SD），只有测量TNT时吸收度出现了明显增长，证明了本发明交联多肽的氧化石墨烯生物传感器可以对TNT进行特异性测量。