一种负载氧化铁纳米颗粒的海藻酸钠纳米凝胶的制备方法

摘要

本发明涉及一种负载氧化铁纳米颗粒的海藻酸钠纳米凝胶的制备方法，包括：(1)水热法合成PEI包覆的Fe3O4纳米颗粒(Fe3O4-PEI)；(2)海藻酸钠的水溶液先经EDC活化，然后经双乳化反应形成W/O/W的聚合物乳液；(3)将(1)中的Fe3O4-PEI作为交联剂加入到(2)中的聚合物溶液中发生交联反应，除去有机溶剂和表面活性剂后，即得。本发明工艺十分简单，易于操作分离，同时原料来源广泛；制备的海藻酸钠纳米凝胶粒径较小、分布均匀、弛豫率高、造影效果显著，同时具有良好的水溶性、胶体稳定性、生物相容性和血液相容性，对生物体无不良影响，成本低廉，在磁共振成像诊断领域有潜在的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于磁共振成像造影剂的制备领域，特别涉及一种负载氧化铁纳米颗粒的海藻酸 钠纳米凝胶的制备方法。

背景技术

纳米凝胶是由亲水性或两亲性的高分子链通过物理或者化学交联的方式组成的三维网 状结构的水凝胶颗粒，它是一种纳米尺度的软体材料。纳米凝胶具有许多优良的特性，如良 好的胶体稳定性、生物相容性、高负载能力、易于多功能化、易进入肿瘤组织等，促进了其 在诸多领域的应用。海藻酸钠(Alginate,AG)是一种天然多糖类物质，具有良好的生物相容 性和生物可降解性，同时价廉易得，广泛用于合成纳米凝胶。它是从褐藻类的海带或马尾藻 中提取碘和甘露醇之后的副产物，是由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸以1,4-糖苷键连接 而成的线性聚合物，每个糖醛酸单元上含有一个羧基。海藻酸钠的分子式为(C₆H₇O₆Na)_n，相 对分子量为2000-200000。海藻酸钠具有无毒，良好的水溶性、生物相容性和生物降解性等优 点,已广泛用于生物医学领域。

磁共振成像(MRI)技术是七十年代发展起来的一种先进医学成像诊断技术，已广泛用于 人体多种疾病的检测和早期诊断。MRI具有较高的分辨率，较高的空间和断层成像能力，无 放射引起的电离损害，同时可获得解剖及生理信息，具有其他医学成像无可比拟的优点。MRI 在疾病监测领域发挥越来越重要的作用。但MRI的弱点是其敏感性较低，而且不同器官或肿 瘤组织的弛豫时间相互重叠使MRI诊断困难。近年来，通过注射MRI造影剂的方法可以有 效解决MRI敏感性较低的问题，显著提高成像的对比度和清晰度。因此选择合适的MRI造 影剂就显得尤为重要。

磁性四氧化三铁纳米颗粒(Fe₃O₄)近年来在生物医学领域有着越来越广泛的应用，尤其 是在MRI造影剂方面的应用更是受到了普遍的关注。Fe₃O₄纳米颗粒具有独特的磁学性质以 及较高的信号强度、较低的使用剂量、良好的生物相容性和较低的制造成本等特点。本课题 组前期专利成果(史向阳，蔡红东，沈明武等。一种HPEI包裹的氧化铁磁性纳米颗粒的制 备方法。中国发明专利，授权公告号：CN102911373B)显示水热法制备的聚乙烯亚胺(PEI) 修饰的超顺磁性氧化铁纳米颗粒(Fe₃O₄-PEI)尺寸较小，颗粒分布均匀，表现出较高的r₂弛 豫率，且其表面存在大量的氨基活性基团，可作为纳米凝胶合成的交联剂。本发明以水热法 合成的Fe₃O₄-PEI为交联剂合成海藻酸钠纳米凝胶，构建了负载Fe₃O₄纳米颗粒的海藻酸钠纳 米凝胶用作MRI造影剂。纳米水凝胶负载Fe₃O₄纳米颗粒用于磁共振造影剂的优势是，纳米 凝胶作为软体材料易于被细胞吞噬，其具备的高的渗透性也使其易于渗透到肿瘤组织深层部 位用于肿瘤的有效成像，另外纳米水凝胶对Fe₃O₄纳米颗粒的负载，使Fe₃O₄纳米颗粒形成团 簇结构，大大提高其弛豫效应，从而提高磁共振成像的灵敏度。最后，海藻酸钠纳米凝胶表 面丰富的羧基可以进一步修饰，为本发明的进一步深入研究开发提供了很大的空间。

检索国内外文献发现，尚没有发现关于用水热法合成的Fe₃O₄-PEI为交联剂制备海藻酸 钠纳米凝胶作为MRI造影剂研究的相关报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种负载氧化铁纳米颗粒的海藻酸钠纳米凝胶的制备 方法，该方法工艺简单，易于操作分离，原料来源广泛价廉生物可降解，具有良好的发展前 景。

本发明的一种负载氧化铁纳米颗粒的海藻酸钠纳米凝胶的制备方法，包括：

(1)将二价铁盐溶解在超纯水中，加入NH₃·H₂O并于空气气氛下搅拌反应5-10min，得到 混合溶液，然后将混合溶液转移到高压反应釜中，并加入超支化聚乙烯亚胺PEI水溶 液，搅拌混匀后，在134-140℃进行水热反应1-3h，自然冷却至室温，分离，洗涤， 纯化，得到PEI包裹的四氧化三铁纳米颗粒Fe₃O₄-PEI；

(2)将海藻酸钠溶解于水中，先用EDC活化，然后逐滴加入到磺基琥珀酸二辛酯钠AOT 溶液中，搅拌3-5min，形成W/O乳液，然后将该W/O乳液逐滴加入到聚乙烯醇PVA 的水溶液中，搅拌5-10min，得到W/O/W的聚合物乳液；

(3)将步骤(1)得到的PEI包裹的四氧化三铁纳米颗粒Fe₃O₄-PEI逐滴加入到步骤(2) 中的聚合物乳液中，搅拌过夜，分离洗涤，即得负载氧化铁纳米颗粒的海藻酸钠纳米 凝胶；其中海藻酸钠和Fe₃O₄-PEI的质量比为3:1。

所述步骤(1)中二价铁盐、超纯水、NH₃·H₂O的比例关系为1.25g:7.75mL:6.25mL。

所述步骤(1)中二价铁盐为FeCl₂·4H₂O。

所述步骤(1)中超支化聚乙烯亚胺PEI水溶液的浓度为0.1-0.2g/mL。

所述步骤(1)中分离为磁分离。

所述步骤(2)中活化时间为2-3h。

所述步骤(2)中AOT溶液的溶剂为二氯甲烷DCM。

所述步骤(2)中海藻酸钠水溶液的浓度为1wt％，AOT溶液的浓度为2.5wt％，PVA的水溶 液浓度为2wt％。

所述步骤(2)中海藻酸钠水溶液、AOT溶液、PVA水溶液的体积比为1:2:15。

所述步骤(3)中分离洗涤为先蒸发除去有机溶剂，然后8000-10000rpm离心水洗3-5次，除 去表面活性剂。

所述负载氧化铁纳米颗粒的海藻酸钠纳米凝胶作为磁共振成像造影剂的应用。

所述步骤(3)中负载氧化铁纳米颗粒的海藻酸钠纳米凝胶是由海藻酸钠与Fe₃O₄-PEI进行化 学交联而成。

所述步骤(3)中制备的负载氧化铁纳米颗粒的海藻酸钠纳米凝胶，具有较高的r₂弛豫率，易 于被肿瘤细胞吞噬，可用于肝脏和肿瘤模型的磁共振成像造影诊断。

本发明先利用一步水热法合成PEI包裹的Fe₃O₄磁性纳米颗粒，然后将其加入到经EDC 活化和双乳化的海藻酸钠溶液中，发生交联反应形成负载Fe₃O₄纳米颗粒的海藻酸钠纳米凝 胶。

本发明操作简单，易于分离，原料来源广泛。制备的海藻酸钠纳米凝胶颗粒分布均匀、 弛豫率高、造影效果显著，具有良好的水溶性、胶体稳定性、生物相容性和血液相容性，对 生物体无不良影响，易于被肿瘤细胞吞噬。体内肝脏成像和肿瘤成像结果显示，本发明制备 的负载Fe₃O₄纳米颗粒的海藻酸钠纳米凝胶具有显著的造影效果，在磁共振成像造影剂领域 有潜在的应用价值。

本发明使用Zeta电势及动态光散射分析(DLS)、原子力显微镜(AFM)、透射电子显微 镜(TEM)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)、紫外可见吸收光谱(UV-Vis) 和核磁共振(MR)分析等手段表征制备的负载Fe₃O₄纳米颗粒的海藻酸钠纳米凝胶 (AG/PEI-Fe₃O₄)。然后利用刃天青还原法评价纳米凝胶的细胞毒性，并用相差显微镜获取与 材料共培养后的细胞的形貌；通过溶血实验评价本发明的纳米凝胶血液相容性。随后评价肿 瘤细胞对该纳米凝胶的吞噬能力。最后进行体外细胞、裸鼠体内肝脏和肿瘤模型的磁共振成 像实验，考察AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶的体内外MR成像效果。此外，通过组织分布实验研究 AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶在生物体内的代谢情况。具体测试结果如下：

(1)纳米凝胶的Zeta电势及动态水力径测试结果

Zeta电势结果显示AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶的表面电势为-7.58mV，证明了AG和PEI-Fe₃O₄的成功交联。其水动力学直径为308.75±16.33nm，颗粒分布均一，且水动力直径能长时间保 持几乎不变，从而说明制备的纳米凝胶具有良好的胶体稳定性。

(2)TEM和AFM测试结果

本发明制备的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶的TEM图片和AFM图片(参见附图1)表明所形 成的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶的形貌呈球形或准球形，尺寸均匀，凝胶直径约为170nm，没有 明显的团聚现象，在溶液中分散良好而且不发生聚集。

(3)磁共振(MR)分析结果

Fe₃O₄纳米材料可以用作核磁共振成像的阴性造影剂，随着Fe浓度的增加，MRI信号强 度逐渐减弱。弛豫率(r₂)反映Fe₃O₄纳米材料作为MRI造影剂的成像效率，为单位摩尔浓度铁 的横向弛豫时间，可通过不同浓度下的弛豫时间(T₂)的倒数拟合计算得到。通过本发明制 备的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶T₂弛豫时间倒数与Fe浓度的线性拟合图，可以看出这种 AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶的弛豫时间倒数随着铁浓度的增加，具有良好的线性关系。随着Fe 浓度的增高，其MR信号强度明显减弱。不同浓度样品的磁共振成像可以看出纳米颗粒具有 良好的体外成像效果。通过计算得出AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶的r₂值为170.81mM^-1s^-1(参见 附图2)。

(4)血液相容性

具有良好的血液相容性对纳米材料的体内应用来说是至关重要的，因此通过溶血实验对材 料血液相容性进行了评价。附图3中显示了AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶在不同Fe浓度(0.025、 0.05、0.1、0.2mM)下的溶血性测试结果。通过对上层清液的紫外吸光光谱进行测量来定量 评价纳米凝胶的溶血性。如图4右上角紫外图谱显示，在Fe浓度达到0.2mM时，AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶的溶血率都小于5％，说明制备的这些纳米材料具有很好的血液相容性，因而可以安 全地用于生物体内MR成像。

(5)刃天青还原实验和相差显微镜测试结果

通过刃天青荧光比色法测定HeLa细胞(人子宫颈癌细胞)的活力来评价本发明制备的 AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶的细胞相容性。将HeLa细胞种植于96孔板中(8000细胞/孔)，每种 浓度设定5个平行样(Fe浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mM)。细胞培养板置于CO₂浓 度为5％和温度为37℃的环境中共培养24小时。将贴壁生长的HeLa细胞与加入不同Fe浓 度AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶(Fe浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mM)的培养基置于5％CO₂， 37℃条件下共培养24小时，倒掉原有培养基并用无菌PBS清洗3遍，加入含有0.1mg/mL 刃天青的培养基置于相同条件下继续培养4小时后，吸出上层培养基测量其在激发波长λ＝ 530nm，发射波长λ＝590nm处的荧光值，荧光值的大小可以反映活细胞的数量。附图4为 经过不同Fe浓度AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶处理的HeLa细胞的刃天青试验结果。结果显示，与 PBS对照组相比，AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶在试验浓度范围内对HeLa细胞没有明显细胞毒性， 细胞存活率均在75％以上，说明AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶具有良好的生物相容性，可以安全地 应用于生物体内MR成像。同时，通过相差显微镜观察法进一步验证了AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝 胶对细胞形貌的影响。结果表明不同Fe浓度AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶(Fe浓度为0.02、0.04、 0.06、0.08、0.1mM)在37℃下与细胞共培养24小时后，细胞形貌与PBS处理的细胞没有 明显的变化(参见附图5)。进一步说明了AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶具有良好的生物相容性。

(6)细胞吞噬实验

一种理想的造影剂纳米材料应该易于被肿瘤细胞吞噬，才能更好的应用于肿瘤的MR成像。 因此对AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶被肿瘤细胞的吞噬情况进行了评价。HeLa细胞与AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶(Fe浓度为0.025、0.05、0.1mM)在5％CO₂，37℃条件下共培养6小时，以PBS培 养作为空白对照组。PBS清洗细胞之后，用王水(盐酸/硝酸；体积比3:1)消化，然后利用ICP-AES 测量细胞吞噬的Fe浓度。附图6结果显示，相对于表面同样带负电的对照材料(羧化后的 Fe₃O₄-PEI，Fe₃O₄-PEI.SAH)，AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶处理的细胞的吞噬量明显要高，二者具 有显著性差异(***p＜0.001)。这一结果说明AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶更易于被肿瘤细胞所吞 噬，为获得理想的造影效果奠定了基础。

(7)普鲁士蓝染色

通过普鲁士蓝染色法来进一步验证肿瘤细胞对AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶的吞噬效应。HeLa 细胞与AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶和Fe₃O₄-PEI.SAH(Fe浓度为0.025、0.05、0.1mM)在5％CO₂， 37℃条件下共培养6小时，以PBS培养作为空白对照组。培养结束后用PBS清洗3次，戊 二醛(2.5％)固定15分钟，PBS清洗3次，普鲁士蓝染色液染色10分钟，PBS清洗3次。 然后在相差显微镜下观察细胞吞噬纳米颗粒后的染色情况(参见附图7)。从图中可以看出， 经过PBS处理的细胞没有被染色，Fe₃O₄-PEI.SAH处理的HeLa细胞内显示出较浅的染色效 果，而AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶处理的HeLa细胞显示出较深的染色效果，这进一步说明 AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶更易于被肿瘤细胞所吞噬。

(8)体外细胞MR成像结果

在体内实验之前，评价了本发明制备的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶的细胞MR成像效果(参 见附图8)，HeLa细胞与AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶(Fe浓度为0.0125、0.025、0.05、0.1mM) 在5％CO₂，37℃下共培养6小时，并且以PBS处理的细胞作为对照组。在图8a中，随着 Fe浓度的增加，AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶处理后的细胞表现出MR信号衰减的趋势，说明随着 Fe浓度的增加，细胞对纳米凝胶的吞噬量也增加。图8b是细胞经过不同浓度的纳米凝胶处 理后的MR成像信号值，从图中明显看出，随着Fe浓度的增加，细胞的MRI信号值均逐渐 减少。这些结果说明制备的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶具有很好的细胞MR成像效果。

(9)体内肝脏MR成像

通过尾静脉注射AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶(200μL，[Fe]＝27.21mM)来评价体内的MR 成像效果(参见附图9)，与注射前的对照组相比较，在注射后0.5小时，小鼠的肝脏表现出 明显的变暗，在注射2小时后，肝脏部位亮度最低，注射12、24小时后，肝脏部位逐渐变亮， 说明纳米凝胶已经开始逐渐从肝脏代谢(图9a)。图9b是相应注射时间的肝脏信号值变化， 在注射后0.5小时，信号值较注射前明显降低，2小时后，信号值达最低，而随后又逐渐缓慢 上升，这与图9a的结果一致，这些结果说明该制备的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶能成功应用于 体内MR成像的造影剂。

(10)体内肿瘤MR成像结果

在裸鼠体内构建HeLa皮下瘤模型，通过尾静脉注射本发明制备的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶 和对照材料Fe₃O₄-PEI.SAH的PBS溶液(200μL，[Fe]＝51.04mM)来评价肿瘤部位MR成 像效果(参见附图10)。与注射前的对照组相比较，在注射后0.5到1小时内，注射对照材料 Fe₃O₄-PEI.SAH的小鼠肿瘤部位稍微变暗，而注射AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶的小鼠肿瘤明显变 暗，说明AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶更易被肿瘤细胞所吞噬，具有明显的MRI肿瘤诊断效果。 在注射后2小时，两个实验组的小鼠肿瘤部位明暗程度都逐渐开始恢复，24小时后基本恢复 完全。说明此时纳米材料随着血液流通从肿瘤部位逐渐代谢出去(参见附图10a和10b)。图 10c是相应注射时间的肿瘤MRI信号值变化，在注射后30分钟到1小时，两个实验组的小鼠 肿瘤部位信号值都有所降低，而注射AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶的小鼠肿瘤MRI信号值降低更 加显著，在注射后2小时，两个实验组的小鼠肿瘤部位MRI信号值均开始上升，这与图10a 和10b的结果一致，说明纳米材料逐渐从肿瘤部位代谢出去。肿瘤MR成像结果说明本发明 制备的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶可以应用于体内肿瘤MR成像诊断的造影剂。

(11)体内组织分布结果

为了研究本发明制备的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶在生物体内各组织的代谢情况，采用 ICP-AES测量在注射后24小时各个重要器官中铁的含量(参见附图11)，并以空白裸鼠作为 参考对照。从图中可看出在注射本发明制备的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶和对照材料 Fe₃O₄-PEI.SAH的PBS溶液(200μL，[Fe]＝51.04mM)后，肝、脾和肺中铁的含量较注射 前均明显增加，而在其他的器官，比如：心、肾和肿瘤，铁的聚集较少。说明本发明制备的 AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶能在小鼠体内正常的代谢清除。

有益效果

(1)本发明采用水热法合成的Fe₃O₄-PEI作为交联剂制备AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶用于MR 成像造影剂，该方法工艺简单，易于操作分离，原料来源广泛价廉生物可降解，具有 良好的发展前景；

(2)本发明制备的负载氧化铁纳米颗粒的海藻酸钠纳米凝胶AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶粒径分 布均匀，具有良好的水溶性、胶体稳定性、细胞相容性和血液相容性，弛豫率高，造 影效果显著，在磁共振成像领域具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为本发明制备的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶的TEM(A)和AFM(B)图片；

图2为本发明制备的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶(Fe的浓度范围0.0025-0.08mM)T₂弛豫时 间倒数与Fe浓度的线性关系图；

图3为本发明制备的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶的溶血试验紫外图谱，右上角插图显示的是 图中放大的紫外吸收图谱，右下角插图从左到右依次是水、PBS、0.2mM、0.1mM、0.05mM 和0.025mM纳米凝胶处理2小时并离心后的人血红细胞图片；

图4为刃天青荧光比色法测试的HeLa细胞经过PBS缓冲液(空白对照)和本发明制备 的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶(浓度范围在0-0.1mM)处理24小时后的细胞活力；

图5为HeLa细胞经过PBS缓冲液(空白对照，a)和本发明制备的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝 胶(Fe浓度为b:0.02mM、c:0.04mM、d:0.06mM、e:0.08mM、f:0.1mM)处理24小时 后的细胞形态；

图6为经本发明制备的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶和对照材料Fe₃O₄-PEI.SAH(Fe浓度为 0.025、0.05、0.1mM)处理6小时后的HeLa细胞的Fe含量(***p<0.001)；

图7为经本发明制备的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶(a,b,c,d)和对照材料Fe₃O₄-PEI.SAH(a’, b’,c’,d’)(Fe浓度为0.025、0.05、0.1mM)处理6小时后的HeLa细胞的普鲁士蓝染色的显 微镜图片。

图8为HeLa细胞经过PBS缓冲液和本发明制备的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶(Fe浓度为 0.0125、0.025、0.05、0.1mM)处理6小时后的细胞T₂MR成像图片(a)和相应的MR信 号值变化(b)；

图9为尾静脉注射AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶的PBS溶液(200μL，[Fe]＝27.21mM)前和 注射后不同时间点小鼠肝脏的MR成像(a)和相应的信号强度变化(b)；

图10为尾静脉注射本发明制备的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶和对照材料Fe₃O₄-PEI.SAH的 PBS溶液(200μL，[Fe]＝51.04mM)后不同时间点小鼠肿瘤的T₂MR成像图片(a，b)和 相应的MR信号值变化(c)；

图11为尾静脉注射本发明制备的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶和对照材料Fe₃O₄-PEI.SAH的 PBS溶液(200μL，[Fe]＝51.04mM)后24小时，Fe元素在小鼠主要器官(心、肝、脾、肺、 肾、和肿瘤)的组织分布图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

将1.25g FeCl₂·4H₂O倒入烧杯中，加入7.75mL的超纯水，温和搅拌下，加入6.25mL NH₃·H₂O，将上述混合液在空气气氛下连续搅拌10分钟，使二价铁充分被氧化，接着将混合溶 液转移到高压反应釜中。将0.5g PEI超声溶解于5mL水溶液中，用移液枪将其转入反应釜 中，与反应釜中溶液充分混匀，于134℃反应3小时。反应结束后，自然冷却至室温，将所 得到的黑色沉淀Fe₃O₄-PEI磁分离除去上清液，再加适量超纯水超声分散，再磁分离，如此 重复超纯水洗涤五次，以除去杂质，然后重新分散于20mL超纯水中，即得PEI包覆的Fe₃O₄纳米颗粒(Fe₃O₄-PEI)。取3mL浓度为1wt％AG(30mg)水溶液，先用15mg EDC活化3 小时；然后逐滴加入到6mL 2.5wt％AOT的DCM溶液中，搅拌5分钟，形成W/O乳液；然 后将该W/O乳液逐滴加入到45mL 2wt％PVA的水溶液中，搅拌10分钟，形成W/O/W的 聚合物乳液。将之前制备得到的Fe₃O₄-PEI(10mg)水溶液逐滴加入到上述W/O/W的聚合 物乳液中，搅拌过夜，蒸发除去有机溶剂，然后8000rpm离心、水洗，重复3次以除去表面 活性剂，最后将产物重新分散在1mL的超纯水中，即得到AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶。

实施例2

取实施例1中制备的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶，将其用超纯水稀释100倍后，用于测表面 电势和水动力直径。Zeta电势测定结果表明AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶的表面电势为-7.58mV， 证明了AG和Fe₃O₄-PEI的成功交联。其水动力学直径为308.75±16.33nm，粒径分布均一， 且水动力直径能长时间保持几乎不变，从而说明AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶(实施例1)具有良 好的胶体稳定性。之后通过透射电子显微镜(TEM)和原子力显微镜(AFM)观察实施例1 中制备AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶的形貌(如图1)。结果表明所形成的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶 的形貌呈球形或准球形，尺寸均匀，凝胶直径大小约为170nm，没有明显的团聚现象，在溶 液中分散良好而且不发生聚集。

实施例3

通过ICP-AES测试法测定实施例1制备的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶中Fe元素的含量。分 别配制Fe浓度为0.0025、0.005、0.01、0.02、0.04、0.08mM的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶水溶 液2mL，通过磁共振成像分析仪测定材料在不同Fe浓度下的T₂弛豫效应(如图2)。弛豫率 测试结果表明AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶的弛豫时间倒数随着铁浓度的增加(在0.0025～0.08mM 浓度范围内)具有良好的线性关系。通过计算得出AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶的r₂值为170.81 mM^-1s^-1。因此，本发明所制备的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶可以作为MR分子影像学诊断中的优 良T₂信号衰减造影剂。

实施例4

将实施例1制备的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶重新分散在PBS水溶液中(Fe浓度为0.025、 0.05、0.1、0.2mM)，与新鲜的人血红细胞在室温下经过2小时孵育，离心观察溶血情况。 相应的，以去离子水作为阳性对照组，PBS水溶液作为阴性对照组，样品的溶血程度通过紫 外可见分光光度仪在541nm处的吸收值进行量化表征。实验结果显示，在浓度达到0.2mM 时，AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶的溶血率都小于5％，随着样品浓度的降低溶血率随之降低(如 图3)。说明本发明制备的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶具有良好的血液相容性。

实施例5

收集对数生长期HeLa细胞，按照8000细胞每孔的密度接种在96孔细胞培养板上，置于 5％CO₂，37℃条件下孵育24小时。弃掉培养基后，每孔更换180μL培养基，并添加20μL 含不同浓度的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶(最终Fe浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mM)或 纯PBS(对照组)。将细胞培养板继续放置在5％CO₂，37℃继续孵育24小时。按照20μL 每孔的浓度加入刃天青溶液(1mg/mL)，避光环境下37℃恒温培养4小时。按顺序每孔吸 取上层培养液100μL于黑色96孔板中，在多功能荧光酶标仪上检测各孔在激发波长λ＝530 nm，发射波长λ＝590nm处的荧光值，荧光值的大小可以反映活细胞的数量(如图4)。结果 显示，与PBS对照组相比，AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶在试验浓度范围内对HeLa细胞没有明显 细胞毒性，细胞存活率均在75％以上，说明AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶具有良好的生物相容性。 同时，通过相差显微镜观察法进一步验证了AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶对细胞形貌的影响。如图 5所示，不同Fe浓度AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶(Fe浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mM) 在37℃下与细胞共培养24小时后，细胞形貌与PBS处理的细胞没有明显的变化，进一步说 明了AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶具有良好的生物相容性。

实施例6

一种理想的造影剂纳米材料应该易于被肿瘤细胞吞噬，才能更好的应用于肿瘤的MR成 像，因此对AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶被肿瘤细胞的吞噬情况进行了评价。将HeLa细胞与实施 例1制备的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶(Fe浓度为0.025、0.05、0.1mM)在5％CO₂，37℃条 件下共培养6小时，以PBS培养作为空白对照组。PBS清洗细胞3遍之后，通过ICP-AES 测量被肿瘤细胞吞噬的材料的Fe元素浓度。如图6所示，相对于表面同样带负电的对照材料 (羧化后的Fe₃O₄-PEI，Fe₃O₄-PEI.SAH)，AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶处理的细胞的吞噬量明显要 高，二者具有显著性差异(***p＜0.001)。这一结果说明AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶更易于被肿 瘤细胞所吞噬，从而获得理想的造影效果。通过普鲁士蓝染色法来进一步验证肿瘤细胞对 AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶的吞噬效应。HeLa细胞与AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶和Fe₃O₄-PEI.SAH (Fe浓度为0.025、0.05、0.1mM)在5％CO₂，37℃条件下共培养6小时，以PBS培养作 为空白对照组。培养结束后用PBS清洗3次，戊二醛(2.5％)固定15分钟，PBS清洗3次， 普鲁士蓝染色液染色10分钟，PBS清洗3次。然后在相差显微镜下观察细胞吞噬纳米颗粒后 的染色情况(如图7)。从图中可以看出，经过PBS处理的细胞没有被染色；Fe₃O₄-PEI.SAH 处理的HeLa细胞内显示出较浅的染色效果；而AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶处理的HeLa细胞显 示出较深的染色效果，这进一步说明AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶更易于被肿瘤细胞所吞噬。

实施例7

在体内实验之前，评价了本发明制备的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶的细胞MR成像效果，HeLa 细胞与实施例1制备的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶(Fe浓度为0.0125、0.025、0.05、0.1mM) 在5％CO₂，37℃下共培养6小时，并且以PBS处理的细胞作为对照组，在培养结束后细胞 用PBS清洗5次，再胰酶消化、离心、过滤，最后分散在1mL PBS(含0.5％琼脂糖)中， 用核磁共振成像仪测量各细胞样品的T₂弛豫效应(如图8)。在图8a中，随着Fe浓度的增加， AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶处理后的细胞表现出MR信号衰减的趋势，说明随着Fe浓度的增加， 细胞对纳米凝胶的吞噬量也增加。图8b是细胞经过不同浓度的纳米凝胶处理后的MR成像信 号值，从图中明显看出，随着Fe浓度的增加，细胞的MRI信号值均逐渐减少。这些结果说 明制备的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶具有很好的细胞MR成像效果。

实施例8

腹腔注射麻药迷昏小鼠，通过尾静脉注射AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶(200μL，[Fe]＝27.21 mM)，用核磁共振成像仪测试小鼠肝脏在注射后不同时间点的T₂成像，以此来评价 AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶的体内MR成像效果。如图9a所示，与注射前的空白对照组相比较， 在注射后0.5小时，小鼠的肝脏表现出明显的变暗，在注射2小时后，肝脏部位亮度最低， 注射12、24小时后，肝脏部位逐渐变亮，说明纳米凝胶已经开始逐渐从肝脏代谢。图9b是 相应注射时间的肝脏信号值变化，在注射后0.5小时，信号值较注射前明显降低，2小时后， 信号值达最低，而随后又逐渐缓慢上升，这与图9a的结果一致，这些结果说明该制备的 AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶能成功应用于体内MR成像的造影剂。

实施例9

在裸鼠体内构建HeLa皮下瘤模型，通过尾静脉注射本发明制备的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝 胶和对照材料Fe₃O₄-PEI.SAH的PBS溶液(200μL，[Fe]＝51.04mM)来评价肿瘤部位MR 成像效果(参见附图10)。与注射前的对照组相比较，在注射后0.5到1小时内，注射对照材 料Fe₃O₄-PEI.SAH的小鼠肿瘤部位稍微变暗，而注射AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶的小鼠肿瘤明显 变暗，说明AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶更易被肿瘤细胞所吞噬，具有明显的MRI肿瘤诊断效果。 在注射后2小时，两个实验组的小鼠肿瘤部位明暗程度都逐渐开始恢复，24小时后基本恢复 完全。说明此时纳米材料随着血液流通从肿瘤部位逐渐代谢出去(参见附图10a和10b)。图 10c是相应注射时间的肿瘤MRI信号值变化，在注射后0.5到1小时，两个实验组的小鼠肿 瘤部位信号值都有所降低，而注射AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶的小鼠肿瘤MRI信号值降低更加 显著，在注射后2小时，两个实验组的小鼠肿瘤部位MRI信号值均开始上升，这与图10a和 10b的结果一致，说明纳米材料逐渐从肿瘤部位代谢出去。肿瘤MR成像结果说明本发明制 备的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶可以应用于体内肿瘤MR成像诊断的造影剂。

实施例10

以实施例9构建的HeLa肿瘤模型裸鼠来研究本发明制备的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶在生 物体内各组织的分布代谢情况。向裸鼠尾静脉注射本发明制备的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶和对 照材料Fe₃O₄-PEI.SAH的PBS溶液(200μL，[Fe]＝51.04mM)，24小时后，处死小鼠，取 出各个器官并称重，然后切成小片段，并加入3mL王水浸泡2天，用ICP-AES测定各个组 织器官中铁的含量，并以空白裸鼠作为参考对照。如图11所示，在注射两种材料后，肝、脾 和肺中铁的含量较注射前均明显增加，而在其他的器官，比如：心、肾和肿瘤，铁的聚集较 少。说明本发明制备的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶能在小鼠体内正常的代谢清除。

对比例1

按照文献(Cai等人，ACS Appl.Mater.Interfaces,2013,5(5),pp 1722–1731)，将实施例 1合成的24.44mg的Fe₃O₄-PEI与27.7mg的琥珀酸酐的DMSO溶液混合搅拌48小时 (Fe₃O₄-PEI上的氨基数与琥珀酸酐的摩尔比为1:5)，之后进行洗涤和磁分离，获得表面带负 电的羧化后的Fe₃O₄-PEI(Fe₃O₄-PEI.SAH)。