一种人体尿液中8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷和8-异构前列腺素F2α的分析方法

摘要

本发明属于一种人体尿液中8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷和8-异构前列腺素F2α的分析方法，其特征在于：采用该方法可较为方便和快速地定量检测出活性氧引起的体内代表性氧化应激生物标志物的变化情况，可用于评估体内氧化损伤和修复程度，研究疾病病理过程。本发明采用AgilentBondEluC18固相萃取柱，可同时净化尿液中两类不同质谱检测模式的三种化合物：8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷（正离子模式检测）和8-异构前列腺素F2α（负离子模式检测），并采用相同的液相色谱柱和流动相对三种化合物进行液相色谱串联质谱检测。该方法前处理简单便捷，灵敏度高、重复性和回收率好。

说明书

技术领域

本发明涉及一种人体尿液中8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷和8-异构前列腺素F2α的前处理和分析新方法，并将其用于人体尿液中氧化应激指标的评估。具体是采用Agilent Bond EluC18固相萃取柱同时净化尿液中8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷和8-异构前列腺素F2α，然后采用HPLC-MS/MS技术测定尿液中8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷和8-异构前列腺素F2α含量的分析方法。

背景技术

活性氧(ROS)是细胞有氧代谢过程中产生的化学性质活泼的氧自由基和能转化为自由基的物质。生物体内的ROS是机体不可或缺的物质，它的产生与消除处于动态平衡状态。在低浓度和中等浓度时，ROS起重要的生理作用，它参与机体的免疫过程，并能调节信号传导途径、控制基因表达和蛋白质翻译后的修饰等，进而参与细胞生长、分化、死亡等。但当ROS的产生和机体的抗氧化能力之间的平衡被打破而导致ROS超过生理限度时，就会损害生物大分子，如DNA、RNA氧化损伤和脂质体过氧化等，从而引起多种疾病的发生和发展。8-羟基-脱氧鸟苷，8-羟基鸟苷和-异构前列腺素F2α分别对应于DNA、RNA氧化损伤产物和脂质过氧化产物。这三种化合物为代表性的氧化应激生物标志物，分析这三种化合物的含量对于评估体内氧化损伤程度以及研究疾病病理过程都有重要作用。

目前，8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷可采用用酶联免疫法、气相色谱质谱(GC-MS)、液相色谱-电化学以及HPLC-MS/MS法进行检测，其中HPLC-MS/MS法选择性好，灵敏度高。在HPLC-MS/MS进行分析时，样品可采取直接稀释或固相萃取进行前处理净化，但由于这些化合物极性很高，在常用的反相色谱柱上基本不保留，结果导致这些化合物与其它干扰物不宜分离，造成定量干扰，并且电喷雾离子源（ESI源）对反相柱分离的极性化合物的检测并不是很灵敏，实际样品化合物灵敏度可能会低于检测限；8-异构前列腺素F2α可采用酶联免疫法，GC-MS和HPLC/MS/MS进行分析。HPLC-MS/MS法具有较好的灵敏度和选择性，适宜于8-异构前列腺素F2α的分析。但尿样中这种化合物含量较低，又存在有其他结构类似的化合物，样品通常是需要固相萃取或是液液萃取-固相萃取相结合的方式进行净化，浓缩后进行定量。

文献尽管针对3种化合物都建立了相应的HPLC-MS/MS分析方法，但对于8-羟基-脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷，有必要通过合适的样品前处理方法降低样品检测时的基质效应，提高检测的灵敏度和选择性；对于8-异构前列腺素F2α的分析，则要注重于发展高效、稳定、灵敏的前处理方法。并且三种化合物分属于两种质谱检测模式，文献通常采用不同的前处理方法（不同的SPE方法）和仪器方法（不同的色谱柱和流动相）进行分析，处理通量不大。

发明内容

本发明的目的正是针对上述现有技术所存在的不足而提供的一种人体尿液中8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷和8-异构前列腺素F2α的固相萃取前处理和HPLC-MS/MS分析新方法。采用该方法可便捷地同时净化人体尿液中的8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷和8-异构前列腺素F2α，并采用HPLC-MS/MS对三种化合物的含量进行定量分析。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种人体尿液中8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷和8-异构前列腺素F2α的分析方法，包括以下步骤：

（1）8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷和8-异构前列腺素F2α的净化：将解冻好的尿液1mL，在37oC下加热5min溶解可能混在沉淀中的目标化合物，加入40 μL [C¹³N¹⁵]-8-羟基鸟苷和D₄-8-异构前列腺素F2α混合内标溶液。采用Agilent Bond EluC18固相萃取柱对尿液样品中的三种化合物进行净化。具体过程为：将尿液上样至已活化的Agilent Bond EluC18固相萃取柱上（5ml甲醇和5ml H2O活化），2ml H₂O洗涤，2ml 体积比为1∶4的甲醇/H₂O洗脱8-羟基-脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷（第一集分），2ml体积比为5∶5的甲醇/H₂O洗杂质，最后再用2ml体积比为3∶1的甲醇/H₂O洗脱8-异构前列腺素F2α（第二集分）。由于8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷极性较大，含较少的有机相的洗脱液就可以将这两种化合物洗脱，而8-异构前列腺素极性较弱，需要较高有机相的洗脱液才能将其洗脱。为减少每一洗脱集分的杂质，降低基质效应，提高检测的灵敏度，因此采用不同配比的甲醇水溶液对三种化合物进行逐步洗脱，尽可能去除样品中可能的其它杂质。

（2）8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷和8-异构前列腺素F2α的HPLC-MS/MS分析：分析条件如下：

采用 Agilent Poroshell 120 SB-C18 （150 mm × 3.0 mm i.d., 2.7 μm）色谱柱；柱温：30 oC；进样量：10 μL；流速：300 μL/min；流动相：A. 0.1%乙酸溶液，B. 乙腈；洗脱梯度：0 -2min，5%B，6-9 min 100%B，10-15 min，5 %B，；离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描模式：8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷-----正离子扫描，8-异构前列腺素F2α-----负离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；干燥气（N₂）温度和流速：290 oC，11 L/min；雾化器压力：40 psi；鞘气（N₂）温度和流速：400 oC，12 L/min；毛细管电压（Capillary voltage）：3500 V；碎裂电压（Fragmentor voltage）：380 V；碰撞气：N₂。雾化电压：1500V 

分析物及其内标的MRM参数参见表1。

表1  分析物及其内标的MRM参数

HPLC-MS/MS分析第一集分可得到尿液中8-羟基鸟苷和8-羟基脱氧鸟苷的含量，HPLC-MS/MS分析第二集分可得到尿液中8-异构前列腺素F2α的含量。

本方法与文献相比，建立的方法简单可靠，可同时净化两类不同性质的氧化应激生物标志物，并采用同样的色谱柱和流动相对样品进行分离检测。样品分析简单便捷，检出限低、灵敏度高、重复性和回收率好。

附图说明

图1为人尿液样品中8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷、8-异构前列腺素F2α的MRM色谱图，

图中：A：8-羟基脱氧鸟苷；B：8-羟基鸟苷； C：8-异构前列腺素F2α 。

具体实施方式

本发明以下结合具体实例做进一步描述：

实例1

将8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷、8-异构前列腺素F2α配制成不同浓度的混合系列标准工作溶液，8-羟基脱氧鸟苷的浓度梯度为0.5，1，2，4，10，25ng/ml，8-羟基鸟苷的浓度梯度为1，2，4，8，20，50ng/ml，8-异构前列腺素F2α的浓度梯度为0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2 ng/ml。8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷两种目标物的内标为[C¹³N¹⁵]-8-羟基鸟苷，8-异构前列腺素的内标为D4-8-异构前列腺素F2α，两个内标的最终浓度均为10ng/ml。用HPLC-MS/MS进行测定。以目标物的色谱峰面积与内标峰面积之比对其浓度之比进行线性回归分析，得到目标物的两种配标的标准曲线回归方程及相关系数，以最低浓度混合标准工作溶液进行10次测定，计算得到三种目标物的标准偏差，以3倍标准偏差作为检出限。结果表明方法线性好、检出限低（结果见表2）。

表2 方法线性回归方程及线性相关系数

实例2

对同一尿液样品，按前面发明内容部分的步骤（1）（2）对样品进行净化处理，并采用HPLC-MS/MS进行6次日内和日间平行测定。结果表明，各个化合物测定的日内和日间相对标准偏差在1.7-5.3%之间，说明该方法的重现性和稳定性很好（结果见表3，表4）。

表3 方法的日内重复性测定结果 （ng/ml）

表4 方法的日间重复性测定结果（ng/ml）

实例3

取同一尿液样品，加入8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷、8-异构前列腺素F2α的标准溶液，制备高、中、低3个水平的加标样品，按前面发明内容部分的步骤（1）（2）对样品进行净化处理，并采用HPLC-MS/MS进行样品进行分析，并由加标量和测定量计算回收率，每个浓度水平做3个平行（结果见表5）。结果表明，三个水平的回收率在87.2%–108%之间。

表5  方法回收率

实例4

取5名吸烟者和5名非吸烟者的尿液样品，按前面发明内容部分的步骤（1）（2）对样品进行净化处理，并采用HPLC-MS/MS进行样品进行分析，样品分析结果如表6所示。

表6 尿液样品测定结果