一种退化非洲菊更新复壮的方法

摘要

本发明涉及一种衰退植株更新复壮的方法，具体涉及一种退化非洲菊更新复壮的方法，采用退化非洲菊根段为外植体，培养后筛选靠近根系基部的根段能够脱分化形成愈伤组织并形成不定芽的部分进行不定芽诱导、增殖培养，得到生根苗。本发明的更新复壮方法，幼苗期植株生长势旺盛，消除土地连作对非洲菊种苗生长及品质影响的效应，提高了土地利用效率，使性状退化非洲菊种质材料得以重新利用，节约了非洲菊种苗生产公司在优良种苗购买方面的成本。

说明书

技术领域

本发明涉及一种衰退植株更新复壮的方法，具体涉及一种退化非洲菊更新复壮的方法。

背景技术

   非洲菊（Gerbera jamesonii Bolus），别名扶郎花、太阳花等，是菊科大丁草属多年生被毛草本宿根植物，原产非洲。由于其花朵硕大，花梗挺拔，花色丰富，切花率高，插花寿命长，观赏价值高，而且在适宜条件下能够周年供应鲜切花，因而成为世界五大切花之一。非洲菊实生繁殖的遗传分离现象明显，使其优良性状不能在世代间稳定保持，而分株繁殖的增殖系数低，不能满足市场对种苗的需求，当前商品化生产的非洲菊优良品种均采用组织培养技术进行苗木的快速繁殖。

随着人们生活水平的提高，我国无论对非洲菊鲜切花，还是非洲菊优良品种种苗的需求日益增加。据统计，全国非洲菊种植规模从2006年的3.27万亩增加到2012年的8.1万亩，年均增幅达到21%，非洲菊已成为国内很多地区发展花卉产业的“入门”产品。然而，我国对非洲菊优良品种选育工作比较滞后，具有自主知识产权的优良品种几乎为零，大宗商品化栽培的非洲菊优良品种完全依赖于国外购买，而后采用组织培养技术扩繁种苗，供应国内市场。相应地，国内对非洲菊组织培养方法的研究报道较多，主要集中在培养基类型、外植体选择、激素种类及其配比、生根诱导以及移栽炼苗等方面。为扩大非洲菊组织培养外植体取材范围，不少研究者对非洲菊不同器官外植体材料进行了筛选研究，已经以花萼、花托、花丝、叶片、茎段、花瓣、子房、花梗、花蕾、茎尖等为外植体建立了组织培养技术体系，并获得了再生植株。通过对非洲菊种苗生产公司和花农的走访调查发现，以上述非洲菊植株器官为外植体的组培苗，一则通过2~3年的继代增殖培养后，苗木出现退化现象，主要表现为幼苗期生长缓慢，花梗短而细，花形变小，花色变浅，商品价值丧失；二则种苗栽种后连作障碍问题比较普遍，影响产量和品质。因此，非洲菊种苗生产商每2~3年不得不再次从国外购进同一品种的种苗用于生产，这是当前非洲菊种苗生产中成本居高不下的主要原因之一。

植物更新复壮的方法主要包括有性繁殖复壮、根萌条或干基萌条法、反复修剪法、幼砧嫁接法、连续扦插法和组织培养法等。其中，有性繁殖复壮法是通过种子繁殖实现优良材料的复壮；根萌条或干基萌条法是利用根部、树干基部存在处于幼年阶段的不定芽或休眠芽，通过埋根促萌或环割、刻伤等促萌，获得萌条后进一步扦插繁殖，从而实现返幼复壮的目的；反复修剪法是通过强度修剪使树干维持年轻阶段的生理状态；幼砧嫁接法是通过将老龄接穗嫁接到幼龄砧木上，利用砧木幼年性的生理状态促进接穗返幼复壮；连续扦插法是指从老龄树上采取的枝条进行扦插后，对成活的植株再采取插条进行扦插，如此往复，经过连续几年的反复扦插，能够明显改善插穗的生根状况；组织培养法获得的再生植株，由于经过脱分化，可以达到返幼复壮的目的。上述植物更新复壮方法中，根萌条或干基萌条法、反复修剪法、幼砧嫁接法、连续扦插法主要适用于多年生木本植物，而有性繁殖复壮和组织培养法在木本和草本植物中均可应用，但实生繁殖容易发生分离，使优良性状不能稳定保持，组织培养中采用的外植体材料不同，也存在位置效应、成熟效应等影响，而且组织培养中多世代继代培养后的退化现象比较普遍。

发明内容

为了解决现有技术主要采用花器官、叶、茎尖等地上部分器官作为非洲菊外植体获得的苗木存在性状退化的问题，本发明提出一种退化非洲菊更新复壮的方法。

本发明的一种退化非洲菊更新复壮的方法，其特征在于按下列步骤实施：

（1）退化非洲菊根段的获得：以已退化的非洲菊无菌瓶苗为原始材料，将高约3 ~ 4 cm的无菌苗切成单株苗，接种于培养基中，培养基配方为1/2MS + IBA 0.2 ~ 1.0 mg/L，pH 5.8 ~ 6.2，蔗糖20 ~ 30 g/L，琼脂4 ~ 7 g/L；培养温度为21±2℃，以光照强度为1600 ~ 1800 Lux的光照12 h/d；待根生长至3 cm左右时，从根基部到根尖依次按上、中、下部截取0.5 ~ 1.0 cm的根段作为外植体材料；

（2）根段的筛选：将截取的长度为0.5 ~ 1.0 cm的上、中、下部根段，无菌蒸馏水下冲洗干净后，接种于启动培养基上进行培养，配养基配方为MS + 6-BA 0.5 ~ 1.5 mg/L+NAA 0.1 ~ 1.0 mg/L，pH 5.8 ~ 6.2，蔗糖20 ~ 30 g/L，琼脂4 ~ 7 g/L；培养温度为21±2℃，以光照强度为1600 ~ 1800 Lux的光照12 h/d，培养25 ~30 d；

（3）不定芽的诱导：截取长约0.5 ~ 1.0 cm的退化非洲菊无菌组培苗根系基部，蒸馏水下冲洗干净后，接种于不定芽诱导培养基上进行培养，配养基配方为MS + 6-BA 0.5 ~ 1.5 mg/L+NAA 0.1 ~ 1.0 mg/L，pH 5.8 ~ 6.2，蔗糖20 ~ 30 g/L，琼脂4 ~ 7 g/L；培养条件为温度为21±2℃，光照强度1600 ~ 1800 Lux，光照时间12 h/d，培养25 ~30 d；观测不同部位根段产生愈伤及不定芽形成情况，选择靠近根系基部（上部）的根段能够脱分化形成愈伤组织，并形成不定芽的部分；

（4）增殖培养：将基部根段诱导得到的长势较好的1 ~ 2 cm不定芽转接到增殖培养基上，增殖培养基的配方为：MS + 6-BA 0.5~2.0 mg/L + NAA 0.05 ~ 0.2 mg/L，pH 5.8 ~ 6.2，蔗糖20 ~ 30 g/L，琼脂4 ~ 7 g/L；培养温度为21±2℃，以光照强度为1600 ~ 1800 Lux的光照12 h/d，培养25 ~ 30 d，形成2 ~ 3cm高的丛生芽；将形成的丛生芽可以切成单芽，放在增殖培养基上进行增殖培养；

（5）生根培养：待继代增殖所获得的丛生芽植株长到2 ~ 3 cm时，将丛生芽切成2 ~ 4片叶子为一株的单芽，接种到配方为1/2MS + IBA 0.2 ~ 1.0 mg/L，附加20 ~ 30 g/L蔗糖，4 ~ 7 g/L琼脂的生根培养基上培养，培养温度为21±2℃，以光照强度为1600 ~ 1800 Lux的光照12 h/d；培养25 ~ 30 d后，培育出根长为1.5 ~ 2.5 cm的非洲菊生根苗；

（6）炼苗与移栽：待生根苗的根长达2 cm以上时，在室温为25℃的室内炼苗2 ~ 4天，取出生根苗，洗净粘附在根部的培养基，将幼苗送至通用非洲菊种苗培育苗床上进行移栽。

根段筛选观测结果见表1。

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多年生植物的发育程度从基部到顶部依次递增，地上部分器官存在着成熟效应、位置效应和年龄效应，易引起扦插、压条、嫁接及组培等无性繁殖苗木的老化，从而影响苗木生长。在多年生乔木树种的无性繁殖中，为保持苗木的幼年性，促进苗木的生长，一般通过对主干基部刻伤促萌，采集萌条作为繁殖材料进行育苗，尤其是植物的根系，不存在阶段发育性，永远为幼年性，也就不存在阶段性衰老。因此，以根为起始材料繁殖得到的苗木，能够获得如同种子繁殖苗木同样的幼年性，从而实现衰退树种的返幼复壮效果，恢复其生长势。非洲菊属于草本植物，根系细小，无法采用埋根促萌的方法进行返幼复壮更新，只有选用根段为外植体，采用组织培养的方法进行更新复壮。借鉴多年生乔木树种返幼复壮更新方法，建立以根段为外植体的退化非洲菊组织培养再生体系，恢复其退化性状及商品价值，不仅能够极大地节约购买繁殖原材料的成本，也为长期有效地保存非洲菊繁殖材料提供了新的途径。

将培育2个月的种苗移送到从事非洲菊鲜切花生产的花农基地，选取新地和3年连作土地进行栽种，株行距为30 cm × 50 cm，按通用管理方式进行日常管理。据观测统计，种苗在新地上栽种的成活率达到98%以上，在3年连作土地上栽种的成活率达到95%以上，二者之间的苗木生长势无差别，均在3个月后开花，花梗长度、粗度及通直性、花冠大小等均得以恢复，恢复了其商品价值。

以根段为外植体的非洲菊组培苗退化性状恢复效果见表2。。

注：以幼苗的叶长与叶宽作为苗期生长的代表值，前值为叶长，后值为叶宽。

本发明的退化非洲菊更新复壮的方法优点在于：

以基部根段为外植体的非洲菊组培苗，与最近从国外引进的相同品种而以花丝为外植体的组培苗相比较，幼苗期生长势旺盛，且提前30 d出圃销售，为非洲菊种苗生产公司节约生产成本，提高了苗圃地的利用效率。

以基部根段为外植体组织培养生产的非洲菊种苗，能够克服土地连作障碍，消除土地连作对非洲菊种苗生长及品质影响的效应，为花农节约了不断更换土地的成本，也提高了土地利用效率。

以性状退化的非洲菊无菌瓶苗为原始材料，以基部根段为外植体材料进行组织培养快繁，获得的非洲菊种苗开花后，花梗伸、增粗，花冠变大，与从国外引进时的性状一致，退化非洲菊的商品价值得以恢复，实现了退化非洲菊的更新复壮，使性状退化非洲菊种质材料得以重新利用，节约了非洲菊种苗生产公司在优良种苗购买方面的成本。

具体实施方式

实施例1：下面结合实例对本发明的技术方案进一步说明。实施时间为2013年—2014年，非洲菊的不定芽诱导和植株再生及炼苗在西南林业大学林学院组培实验室进行，组培苗移栽及种苗培育在昆明市美兰花卉种苗有限责任公司进行，种苗栽种及鲜切花生产在晋宁县非洲菊种植基地进行。

（1）退化非洲菊根段的获得：以昆明市美兰花卉种苗有限责任公司以非洲菊花丝为外植体繁殖的无菌瓶苗（品种名为太阳风）为原始材料，该材料为经过3年的继代增殖培养，种苗已表现出退化性状，即幼苗生长缓慢，花梗变短，花型变小，不能达到非洲菊商品苗的要求而进行销售。在超净工作台上，将高约3 ~ 4 cm的无菌苗切成单株苗，接种于1/2MS + IBA 0.5 mg/L的培养基上用以生根取材。其中，pH 5.8，蔗糖20 g/L，琼脂4 g/L。培养条件：培养温度为21±2℃，以光照强度为1600~1800 Lux的光照12 h/d。待根生长至3 cm左右时，从根基部到根尖依次按上、中、下部截取0.8 cm的根段作为外植体材料；

（2）根段的筛选：在超净工作台上将截取的长度为0.8 cm的上、中、下部根段，用无菌蒸馏水冲洗干净后，接种于启动培养基上进行培养，配养基配方为MS + 6-BA 0.5 ~ 1.5 mg/L+NAA 0.1 ~ 1.0 mg/L，pH 5.8 ~ 6.2，蔗糖20 ~ 30 g/L，琼脂4 ~ 7 g/L；培养温度为21±2℃，以光照强度为1600 ~ 1800 Lux的光照12 h/d，培养25 ~30 d，观测不同部位根段产生愈伤及不定芽形成情况。结果显示，仅有靠近根系基部（上部）的根段能够脱分化形成愈伤组织，并形成不定芽，而中部和下部（根尖部分）不能够产生愈伤组织。因此，选择根系基部作为外植体进行退化非洲菊的组织培养。

（3）不定芽的诱导：截取长度为0.8 cm的退化非洲菊无菌组培苗根系基部，地菌蒸馏水下冲洗干净后，接种于不定芽诱导培养基上进行培养，配养基配方为MS + 6-BA 0.5 ~ 1.5 mg/L+NAA 0.1 ~ 1.0 mg/L，pH 5.8 ~ 6.2，蔗糖20 ~ 30 g/L，琼脂4 ~ 7 g/L；培养条件为温度为21±2℃，光照强度1600 ~ 1800 Lux，光照时间12 h/d，培养25 d。

（4）增殖培养：将基部根段诱导得到的长势较好的1 ~ 2 cm不定芽转接到增殖培养基上，增殖培养基的配方为：MS + 6-BA 0.5~2.0 mg/L + NAA 0.05 ~ 0.2 mg/L，pH 5.8 ~ 6.2，蔗糖20 ~ 30 g/L，琼脂4 ~ 7 g/L；培养温度为21±2℃，以光照强度为1600 ~ 1800 Lux的光照12 h/d，培养25 d，得到2 ~ 3cm高的丛生芽。反复将形成的丛生芽切成单芽，接种到增殖培养基上进行增殖培养，可以使非洲菊快速大量地增殖，其增值倍数达5.07倍；

（5）生根培养：待继代增殖所获得的丛生芽植株长到2 ~ 3 cm时，将丛生芽切成2 ~ 4片叶子为一株的单芽，接种到配方为1/2MS + IBA 0.2 ~ 1.0 mg/L，附加20 ~ 30 g/L蔗糖，4 ~ 7 g/L琼脂的生根培养基上培养，培养温度为21±2℃，以光照强度为1600 ~ 1800 Lux的光照12 h/d；培养25 d后，获得根长为1.5 ~ 2.5 cm的非洲菊生根苗，生根率达到100%；

（6）炼苗与移栽：待生根苗的根长达2 cm以上时，在室温为25℃的室内打开瓶盖炼苗2 ~ 4天，取出生根苗，洗净粘附在根部的培养基，将幼苗送到种苗公司在通用非洲菊种苗培育苗床上进行移栽，移栽后大棚内的温度在25 ~ 30℃之间，湿度在75 ~ 80%之间，3 d喷浇水1次，10 ~ 15 d后成活。该幼苗移栽成活率达到98.2%，培育2个月，苗高达到10 cm以上，符合非洲菊种苗出圃销售的要求；

（7）退化性状恢复效果检测：将培育2个月苗高在10 cm以上的种苗移送到晋宁县非洲菊鲜切花生产的花农基地，选取宽度为120 cm的新地苗床和3年连作苗床进行栽种，株行距为30 cm × 50 cm，按通用管理方式进行日常管理。据观测统计，种苗在新地上栽种的成活率达到98%以上，在3年连作土地上栽种的成活率达到95%以上，二者之间的苗木生长势无差别，均在3个月后开花，花梗平均长度为42.21 cm、平均粗度为0.74 cm，通直，平均花冠大小9.45 cm，达到非洲菊鲜切花的要求，恢复了其商品价值。