鱼类NKEF-A重组蛋白对适应性体液免疫的活化效应及其应用

摘要

本发明公开了一种鱼类NKEF-A重组蛋白对适应性体液免疫的活化效应及其应用，所述的应用为用于制备能够促进鱼类体液免疫能力的免疫增强剂，所述鱼类NKEF-A重组蛋白的氨基酸序列为SEQID NO:1所示；本发明提供的NKEF-A重组蛋白作为适应性体液免疫增强剂，其优点在于：(1)使用剂量小，效率高；以1:100(NKEF-A蛋白:抗原)的NKEF-A重组蛋白剂量即可发挥显著的免疫促进作用；(2)易于制备免疫混合液：NKEF-A重组蛋白是可溶性蛋白，容易与抗原混合，克服了传统矿物油乳剂类制剂不易乳化抗原的缺点；(3)安全性高；与细菌毒素或化合物制剂不同，NKEF-A是宿主自身的蛋白，不存在外源物质导入产生的潜在毒副作用。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及水产生物技术和水产养殖病害防治领域，特别涉及一种天 然杀伤细胞增强因子A(Natural Killer Enhancer Factor A,NKEF-A)促进 鱼类适应性体液免疫的新功能及其应用。

(二)背景技术

随着渔业生产迅猛发展，养殖水产动物病害日益突出，严重制约了水 产业健康可持续发展。长期来由于缺乏有效的病害防治方法，各种抗生素、 杀虫剂广泛使用，造成养殖环境和水产品污染，水产食品安全受到威胁， 同时抗生素产生的耐药性又加剧了水产动物病害发生。因此，研制开发天 然、安全和高效的水产动物病害防治制剂及其应用技术是一项十分紧迫的 任务。鱼类免疫抗病基因的开发利用是从根本上解决水产动物病害防治， 保障水产食品安全的有效途径，代表了当前发展绿色和环境友好型水产养 殖模式的主要方向。但长期来国内外对水产动物免疫抗病基因的研究相对 薄弱，因此所开发的免疫抗病基因数量尚十分有限。

天然杀伤细胞增强因子(NKEF)最初在人红细胞中被发现，因其能 增强天然杀伤细胞(Natural Killer,NK)的细胞毒效应而得以命名。近年 来研究表明，NKEF除了具有增强NK细胞活性外，还具有抗氧化等功能。 但对其是否具有其他的生物学功能，如是否对适应性免疫具有调节功能尚 不清楚。

本发明首次揭示NKEF-A具有促进鱼类适应性体液免疫的新功能， 发现其可以显著提高鱼类适应性体液免疫，实现对鱼类病害的有效防治。 功能机制研究表明，NKEF-A能通过抗原递呈细胞(APC)表面的TLR4 受体激活NF-κB炎症信号通路，上调共刺激信号分子CD40、CD80/86和 CD83等的表达，促进CD4⁺T细胞增殖活化以及IgM抗体的产生，从而 发挥增强适应性体液免疫功能。本发明不仅丰富了鱼类免疫学知识，而且 为鱼类病害的免疫防治开辟了新途径，具有广阔的应用前景。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种鱼类NKEF-A重组蛋白的新应用，具体为鱼 类NKEF-A重组蛋白促进鱼类体液免疫能力的应用，将NKEF-A重组蛋 白与嗜水气单胞菌全细胞疫苗配合使用，从而提高预防鱼类细菌性出血性 败血症的效果。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种鱼类NKEF-A重组蛋白在制备增强鱼类体液免疫能 力的免疫增强剂中的应用，所述鱼类NKEF-A重组蛋白的氨基酸序列为 SEQ ID NO:1所示(核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示)，其用途是促进疫 苗制剂的适应性体液免疫应答，包括但并不限于蛋白抗原疫苗、细菌全菌 灭活疫苗等诱导的适应性体液免疫应答。所述的增强鱼类体液免疫的免疫 增强剂为治疗鱼类败血症的制剂，所述制剂由嗜水气单胞菌全细胞疫苗和 具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重组蛋白构成；所述制剂的给药途 径采用皮下注射的方式，所述具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重组 蛋白用量为0.1～0.25μg/尾，所述嗜水气单胞菌全细胞疫苗用量为5× 10⁵～5×10⁶CFU/尾，在35天内产生效力。

NKEF-A重组蛋白促进鱼类适应性体液免疫的功能机制是，该因子能 促进抗原递呈细胞(APC)表达CD40、CD80/86和CD83等共刺激信号 分子，增强CD4⁺T细胞增殖活化以及IgM抗体的产生。

本发明利用大肠杆菌原核表达系统(pET28a和Rosetta BL21)体外 表达获得河豚NKEF-A重组蛋白，将此重组蛋白分别与外源抗原蛋白和 细菌全菌灭活疫苗共同免疫实验动物斑马鱼。利用荧光定量PCR(qPCR) 和流式细胞术等技术，检测抗原递呈细胞(APC)以及T、B淋巴细胞活 性，利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测B细胞产生抗体(IgM)的变 化。发现NKEF-A重组蛋白能显著促进APC以及T、B淋巴细胞活性标 志分子的转录水平，促进T、B淋巴细胞增殖以及B细胞产生抗体(IgM) 的滴度。证明NKEF-A重组蛋白可以通过促进免疫细胞的活化和抗体产 生等途径，激活机体的适应性体液免疫，增强机体免疫力，提高对细菌感 染的抵御功能，增加机体存活率。

目前在人类和哺乳动物中使用的适应性免疫增强剂有白细胞介素、干 扰素等细胞因子，铝盐、皂苷、鲨烯、脂质体、矿物油等化合物，百日咳 杆菌、胞壁酰二肽、单磷酸脂质A、细菌毒素(如霍乱弧菌肠毒素和大肠 杆菌肠毒素)等细菌结构组分或代谢分泌产物等。理想的免疫增强剂应该 是无毒副作用，对免疫系统具有显著的激活作用，便于生产和使用。事实 上，上述制剂还没有任何一种类型能完全满足这些要求，由于大多数制剂 来源于细菌产物或化合物，因此使用中存在不同程度的安全性问题。

与现有技术相比，本发明提供的NKEF-A重组蛋白作为适应性体液 免疫增强剂，其优点在于：(1)使用剂量小，效率高；以质量比1:100 (NKEF-A蛋白：抗原)的NKEF-A重组蛋白剂量即可发挥显著的免疫 促进作用，而传统矿物油乳剂类制剂与抗原的质量比例为1:1；(2)易于 制备免疫混合液；NKEF-A重组蛋白是可溶性蛋白，容易与抗原混合，克 服了传统矿物油乳剂类制剂不易乳化抗原的缺点；(3)安全性高；与细菌 毒素或化合物制剂不同，NKEF-A是宿主自身的蛋白，不存在外源物质导 入产生的潜在毒副作用。

(四)附图说明

图1为NKEF-A重组蛋白的cDNA分子克隆的PCR检测结果。M： DNA Marker，第1～6泳道为实施例1中PCR扩增产物，均得到预期的扩 增条带。

图2为NKEF-A重组蛋白的SDS-PAGE分析结果；M：标准蛋白分 子量Marker，泳道1为未诱导对照，泳道2为NKEF-A重组蛋白诱导表 达结果，预期大小22.3KDa。

图3为NKEF-A重组蛋白促进KLH抗原活化APC的结果。上：实 时荧光定量分析PBS、KLH、KLH+NKEF-A分别刺激后MHC-II和 CD80/86的改变结果。下：流式细胞术分析PBS、KLH、KLH+NKEF-A 分别刺激后APC的活化结果。

图4为NKEF-A重组蛋白促进KLH抗原活化T淋巴细胞的结果。上： 实时荧光定量分析PBS、KLH、KLH+NKEF-A分别刺激后Lck和CD154 的改变结果。下：流式细胞术分析PBS、KLH、KLH+NKEF-A分别刺激 后T细胞的活化结果。

图5为NKEF-A重组蛋白促进KLH抗原活化B淋巴细胞的结果。上： 实时荧光定量分析PBS、KLH、KLH+NKEF-A分别刺激后CD40和mIgM 的改变结果。下：流式细胞术分析PBS、KLH、KLH+NKEF-A分别刺激 后B细胞的活化结果。

图6为NKEF-A重组蛋白促进抗体(IgM)产生的结果。

图7为NKEF-A重组蛋白对细菌疫苗免疫保护的存活率变化曲线图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此：

实施例1、编码NKEF-A蛋白的cDNA分子克隆

依照Trizol试剂盒(TaKaRa)的说明从河豚脾脏提取RNA，采用3'-Full  RACE Core Set试剂盒(TaKaRa)将RNA逆转录为cDNA，以此cDNA 为模板，使用正向引物F1：5’-CCATGGCTGCAGGCAAAGCTC-3’和反向 引物R1：5’-CTCGAGGTGCTTGGAGAAGAACTC-3’进行PCR(体系见 表1)扩增，获得NKEF-A重组蛋白的编码核苷酸序列。PCR条件为： 94℃预变性4min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，72℃延 伸10min，共35个循环，PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果 显示得到了与预期相吻合的NKEF-A cDNA条带(图1)。

利用PCR产物回收试剂盒(Axygen)回收上述扩增的NKEF-A cDNA 片段，将回收片段连接(体系见表2)到pUCm-T质粒载体(TaKaRa) 中，42℃热激转化E.coli DH5α感受态细胞，培养于含Amp(氨苄青霉 素，终浓度50μg/ml)、IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，终浓度200mM) 和X-gal(β-半乳糖苷酶，终浓度40μg/ml)的LB平板上，37℃恒温培养 过夜，挑取白色阳性菌落，提取质粒，借助PCR和酶切(体系见表3) 鉴定，并送公司(上海英骏)进行序列分析。结果表明，NKEF-A的cDNA 序列全长602bp，编码200个氨基酸残基，与预期吻合，重组质粒命名为 pT/NKEF-A。

表1 NKEF-A cDNA扩增的PCR反应体系

表2 10μl T-A克隆体系

表3 20μl双酶切体系

实施例2、NKEF-A重组蛋白原核表达质粒构建

利用实施例1所述PCR引物中分别引入的NcoI和XhoI酶切位点， 酶切pT/NKEF-A重组质粒，用1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段，并采 用实施例1方法回收目的片段，重组连接到经NcoI和XhoI双酶切过的 表达质粒pET28(a)中，转化E.coli DH5α，涂布于含有Kan(卡那霉素， 终浓度50μg/ml)的LB平板上，37℃恒温培养过夜，筛选重组子，PCR 和酶切鉴定，获得NKEF-A原核表达质粒，命名为pET28(a)/NKEF-A。

实施例3、NKEF-A重组蛋白制备

将实施例2获得的原核表达质粒pET28(a)/NKEF-A转入Rosetta (BL21)工程菌中，经重组子筛选后，挑取阳性克隆并接种于5ml含Kan (终浓度50μg/ml)的LB液体培养基中，置37℃摇床，250rpm培养5h， 再将培养液以体积比1:100的比例加入含有Kan(终浓度50μg/ml)的LB 液体培养基中扩培，37℃，250rpm培养至细菌浓度OD₆₀₀介于0.6～1.0 之间时，加入IPTG，终浓度为0.1mM，然后转入20℃低温摇床，100rpm 过夜培养，诱导可溶性重组蛋白表达。次日，收集菌液，5000g、离心15min 弃上清，收集菌体，用适量PBS重悬菌体，超声破碎至菌液清澈透明。 收集所有的细胞破碎液，4℃，10000g离心10min，收集上清液，利用 SDS-PAGE鉴定蛋白表达结果，采用Ni-NTA柱(上海生工)纯化重组蛋 白，获得NKEF-A重组蛋白(氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示，核苷酸 序列为SEQ ID NO:2所示)。结果见图2所示，在所采取的诱导条件下， 获得目的蛋白，泳道1为标准蛋白分子量，泳道2为NKEF-A重组蛋白 未诱导对照，泳道3为NKEF-A重组蛋白诱导表达结果，分子量22.3KDa。

实施例4、NKEF-A重组蛋白对适应性体液免疫的促进作用

4.1NKEF-A重组蛋白对APC活化效应分析

设置3组实验动物(斑马鱼，30尾/组)：抗原实验组、NKEF-A活化 效应实验组和PBS对照组；PBS对照组，每尾鱼注射10μl PBS，抗原实 验组每尾鱼注射10μl浓度为1μg/μl的抗原蛋白KLH(Sigma)，NKEF-A 活化效应实验组每尾鱼注射10μl KLH和NKEF-A(实施例3获得，下同) 混合液，其中含10μg KLH抗原和0.1μg NKEF-A重组蛋白。72h后，血 窦穿刺采集斑马鱼血液，置含肝素(50U/ml，上海生工)的D-Hank′s液 中。同时取脾脏和头肾，于含肝素(50U/ml)的D-Hank′s液中剪碎，与 血液样品同时过200目筛网，将滤过液轻柔地加在淋巴细胞分离液(上海 生工)上层，室温2500rpm离心25min，吸取白色雾状层白细胞，转移至 另一支10ml离心管中，加6ml无肝素D-Hank′s液，4℃，1200rpm离心 10min，弃上清，收集细胞沉淀，转移至1.5ml EP管。

用1ml L-15培养液(Corning)悬浮细胞沉淀，向细胞悬液中加入鼠 抗-斑马鱼MHC-II多克隆抗体和兔抗-斑马鱼CD80/86多克隆抗体，4℃ 孵育30min；4℃、1250rpm离心5min，弃上清，加入1ml L-15培养液清 洗3次，加入抗鼠-IgG免疫磁珠(上海生工)，4℃孵育30min；上磁珠分 选架(宁波新芝)吸附5min，将未吸附的细胞溶液置另一个EP管中，加 入抗兔-IgG免疫磁珠(上海生工)，4℃孵育30min；吸附的免疫磁珠中加 入预冷的PBS清洗一次，再次分选后加预冷PBS清洗两次，弃去PBS， 加入1ml Trizol提取RNA，依照实施例1的方法将RNA逆转录为cDNA， 以此cDNA为模板，进行荧光定量PCR(条件见表4)，分析APC活化分 子MHC-II和CD80/86的转录表达。

荧光定量PCR的引物序列为：

MHC-II-F：5’-AAGGA TTTGATGGAGAGGAGC-3’；

MHC-II-R：5’-GATGGATGTCACAGGAGGGTC-3’；

CD80/86-F：5’-ATATGAATGTGTTGTTT-3’；

CD80/86-R：5’-AGGTGTAGTTGATG GTCTGG-3’。

表4：实时荧光定量PCR体系(10μl)

用鼠抗-斑马鱼MHC-II抗体以及兔抗-斑马鱼CD80/86抗体免疫荧 光标记APC，暗盒中4℃静置1h，4℃，1250rpm离心10min清洗细胞， 再用PE-羊抗鼠IgG抗体(联科生物，1000倍稀释)、FITC-羊抗兔IgG 抗体(联科生物，500倍稀释)标记，暗盒中4℃静置2h；4℃，1250rpm 离心10min清洗细胞，FACScan流式细胞仪(BD)检测，收集10000个 细胞的荧光信号，Cell Quest和Mod Fit LT软件分析细胞活化情况。结果 见图3，以PBS刺激作为对照，KLH抗原单独刺激斑马鱼时，MHC-II 上调2倍，CD80/86几乎没有上调，当KLH和NKEF-A共注射时，MHC-II 上调增加到6倍，CD80/86上调增加到5倍。同样，KLH和NKEF-A共 处理时，活化的APC比例由KLH单独刺激产生的6.99±0.79％％升高至 15.41±1.98％。

4.2NKEF-A重组蛋白对T淋巴细胞的活化效应分析

采用抗CD4抗体分选T细胞，提取RNA，逆转为cDNA模板，方法 同实施例4.1；T细胞活化用标志分子Lck和CD154的表达水平进行评价， 方法同实施例4.1。

所用荧光定量PCR引物序列为：

Lck-F：5’-AGATGAATG GTGTGACCAGTGTA-3’；

Lck-R：5’-GATCCTGTAGTGCTTGATGATGT-3’；

CD154-F：5’-CGAATGGCAACAGGGCACAAGAATG-3’；

CD154-R：5’-TCTAAACAC TCCTGCTGATGATGCC-3’；

T细胞的CD4和CD154蛋白抗原表达水平采用免疫荧光标记进行检 测，方法同实施例4.1。结果见图4，以空白PBS注射组作为对照，KLH 抗原单独刺激实验鱼时，Lck大约上调了3倍，CD154则仅有轻微上调， 而当用KLH和NKEF-A共注射时，Lck的上调增加8倍，CD154上调增 加4倍。同样，KLH和NKEF-A共处理时，活化的APC细胞比例由KLH 单独刺激产生的9.00％±1.55升高至19.58±2.37％。

4.3NKEF-A重组蛋白对B淋巴细胞的活化效应分析

采用抗BCR(mIgM)抗体分选B细胞，提取RNA，逆转为cDNA 模板，方法同实施例4.1；B细胞活化用标志分子BCR(mIgM)和CD40 的表达水平进行评价，方法同实施例4.1。

所用荧光定量PCR引物序列为：

mIgM-F：5’-TGAGCACAATAAGCGGAAAG-3’；

mIgM-R：5’-GCCAAGTCACA AACACCT-3’；

CD40-F：5’-GTCACACTGATCTGCCTTGTG-3’；

CD40-R：5’-TATC CGCTCTGATACTCTCCA-3’；

B细胞的BCR(mIgM)和CD40蛋白抗原表达水平采用免疫荧光标 记进行检测，方法同实施例4.1。结果见图5，以空白PBS注射组作为对 照，KLH抗原单独刺激实验鱼时，CD40和mIgM仅有轻微上调，当KLH 和NKEF-A共注射时，CD40上调增加4倍，mIgM表达增加3倍。同样， 当KLH和NKEF-A共处理时，活化的B细胞比例由KLH单独刺激产生 的17.97±3.22％升高至24.64±4.40％。

4.4NKEF-A重组蛋白对抗体产生的促进效应分析

设置5组实验动物(斑马鱼，25尾/组)，分别进行腹腔注射：①KLH； ②KLH+0.01μgNKEF-A；③KLH+0.05μgNKEF-A；④KLH+0.1μg NKEF-A； ⑤KLH+FCA(Sigma)，其中KLH蛋白抗原剂量均为10μg，在第1天和 第14天注射两次后，于第28天加强免疫一次，第35天采血，收集血清。 使用ELISA方法检测血清中的IgM抗体生成量。结果见图6，KLH单独 注射刺激产生的IgM抗体滴度较低，加入低剂量的NKEF-A(0.01μg和 0.05μg)时，其辅助效果不明显，当NKEF-A的使用剂量达到0.1μg时， 辅助产生的IgM抗体滴度显著上升。与经典的弗氏佐剂相比，NKEF-A 重组蛋白达到甚至超过了弗氏佐剂的辅助效果。

4.5NKEF-A重组蛋白对细菌疫苗免疫保护的促进作用分析

采用0.5％(V/V)福尔马林灭活法，制备嗜水气单胞菌(Aeromonas  hydrophila,A.h，BSK-10株，浙江省淡水研究所提供)灭活全细胞疫苗。 福尔马林处理条件为室温灭活12小时，灭活后的A.h菌液经5000rpm、 离心5分钟，弃上清，PBS悬浮菌体沉淀，重复3次，即为A.h全菌疫 苗，-20℃分装保存。取150尾成年斑马鱼，随机分为3组，50尾/组，分 别由背鳍皮下注射PBS(对照组)、A.h疫苗(5.0×10⁶CFU/尾)、A.h疫苗 +NKEF-A重组蛋白(5.0×10⁶CFU+0.1μg/尾)进行免疫接种。免疫后的试 验鱼于28℃饲养35天，然后每尾实验鱼再分别腹腔注射5.0×10⁶CFU嗜 水气单胞菌，进行攻毒感染，每3小时观察一次，连续观察24小时，记 录死亡实验鱼数目。试验重复3次，统计24小时保护率。保护率＝(1- 实验组死亡率/对照组死亡率)×100％。结果见图7和表5，未免疫对照组 在嗜水气单胞菌感染攻毒后的死亡率为76.8±4.6％；A.h疫苗免疫组的死 亡率为54.7±3.3％，保护率为28.8±0.4％；而A.h疫苗联合NKEF-A重组 蛋白免疫组的死亡率为35.1±2.8％，保护率为54.4±1.3％。与A.h疫苗免 疫组相比较，A.h疫苗联合重组NKEF-A蛋白免疫组的死亡率显著降低 (P<0.05)，保护率显著提高(P<0.05)，表明NKEF-A重组蛋白具有促进 细菌疫苗免疫保护活性的效应。

表5.NKEF-A重组蛋白对疫苗免疫保护的促进作用

本发明中，NKEF-A重组蛋白可以通过活化APC以及T、B淋巴细 胞促进抗体的产生，从而增强机体对抗原刺激的免疫应答。这种重组蛋白 制备方便，能以水溶性的形式与抗原混合，操作简便，效果明显，在科研 和生产上有广阔的应用前景。应当注意的是，以上实验列举的仅仅是本发 明的若干具体实例，显然，本发明还有许多变形，本领域的普通技术人员 能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明 的保护范围。