一种大豆对烟粉虱病毒病抗性的接种鉴定方法

摘要

本发明公开了一种大豆对烟粉虱病毒病抗性的室内接种鉴定方法，该方法步骤如下：（a）、获取大田烟粉虱并分离纯化出大量整齐一致的烟粉虱成虫；（b）、繁育并分离筛选出大量整齐一致3龄烟粉虱若虫；（c）、对获取的3龄烟粉虱若虫饲毒；（d）、计量烟粉虱若虫；（e）、将待测大豆品种与带毒3龄烟粉虱若虫定量共育传毒；（f）、大田显症统计：将待测大豆移栽至大田隔虫网室，大田显症后调查统计大豆烟粉虱病毒病株发病率，即可准确鉴定出待测大豆品种的抗病能力。本发明的室内接种鉴定方法克服了排趋性的干扰和烟粉虱获取规模量的难题，实现了定量而强化的大豆烟粉虱病毒病的接种鉴定，能够准确地评价大豆品种对大豆烟粉虱病毒病的抗性水平。

说明书

技术领域

本发明涉及一种大豆对烟粉虱病毒病抗性的接种鉴定方法，属于农业科学技术领域。

背景技术

烟粉虱，属同翅目，粉虱科，小粉虱属，首先报道于1889年，在希腊的烟草上发现，命名为烟粉虱。1894年，在美国佛罗里达州甘薯上发现了新北区第一头烟粉虱，被鉴定为甘薯粉虱。烟粉虱由于其形态的变异性，产生了许多同物异名，因此，烟粉虱又名棉粉虱、甘薯粉虱。到1978年烟粉虱的同物异名已达到了22种。烟粉虱食性杂，寄主广泛，寄主植物多达74科420余种。

烟粉虱以刺吸式口器吸食寄主植物汁液，造成寄主营养缺乏、组织损伤、叶片褪绿，甚至枯死。烟粉虱还分泌蜜露，使植物叶片和果实表面布满蜜露，招致灰尘污染和霉菌寄生，诱发霉污病，降低产量和品质。被害作物一般减产10%～20%，严重者达30%以上，甚至绝收。烟粉虱还具有极强的传播植物病毒的能力，据研究，烟粉虱能传播30种植物上的分属7个病毒组的70多种病毒，如双体病毒组、长线形病毒组、香石竹病毒组、马铃薯病毒组病毒等。烟粉虱以持久性方式传毒，在有毒寄主植物上取食较短时间，一般为10～60分后即可传毒，如果饲育时间长达24～48小时，则传毒效率更高。一旦获得毒性，就可连续传毒20天以上。从国外的经历来看，烟粉虱大暴发后不久，它所传播的病毒病就会随之大发生。在一些地区，烟粉虱传播病毒病所造成危害比烟粉虱直接致害要严重得多。

烟粉虱广泛分布于世界各地，是热带和亚热带地区主要害虫之一，南美洲、欧洲、非洲、亚洲、大洋洲的很多国家和地区都有分布。80年代以前，主要是一些产棉国如苏丹、埃及、印度、巴西、伊朗、土耳其、美国等国家的棉花上造成一定损失。在我国台湾、云南也有危害棉花的记录。80年代以后，烟粉虱在在世界各地的蔬菜、大豆、花卉均有发现，并且危害日趋严重，仅1991年美国西南部烟粉虱的危害就导致经济损失5亿美元，烟粉虱已成为美国、巴西、以色列、埃及、意大利、法国、泰国、印度等众多国家蔬菜、作物和园林花卉等植物的主要害虫之一。

在我国，烟粉虱的发生始记载于1949年，80年代先后有危害棉花等作物的报道，但种群数量低，发生较轻，不需防治，主要是由于烟粉虱喜温暖、不耐低温和惧怕风雨的特性，限制了它在温带和高纬度地区的发生，长期以来在我国未被列为主要经济害虫。然而近年来，由于全球气候变暖、干早日益严重和设施农业的大面积推广等因素，为其提供了大发生的环境条件。烟粉虱繁殖快、食性杂、迁徙能力强、体被蜡质保护膜、易产生抗药性等自身生物学优势又使其防治十分困难，所以烟粉虱近年在全球迅速蔓延。中国烟粉虱的发生范围也在不断扩大，危害日趋严重，继蔓延于广东、广西、海南、福建、云南、上海、浙江、江西、湖北、四川、陕西、北京、台湾等省市之后，近年来又迅速扩展于新疆、河北、天津、山东、山西等省市，并爆发成灾。自2000年在河北省北部、北京、天津等地区特大发生以后，2001年又在山东、河北、河南等地大爆发，仅山东省受害面积就达80万公顷，其中大豆、棉花、蔬菜受害最为严重，大豆受害面积达26.7万公顷以上，减产达30%以上。2003年山东省发生面积更达100万公顷，可见烟粉虱已成为中国乃至全球大豆生产的主要害虫之一。正是由于近几年烟粉虱在中国乃至世界范围内蔓延猖獗，发生范围广，危害程度重，传毒能力强，防治难度大，其中最主要的B型烟粉虱被列为全球100种最危险入侵生物之一，更是有史以来唯一一个被学术界冠以“超级害虫”称谓的昆虫。

大豆是我国重要的粮食、油料、饲料、食品加工原料、化工原料和潜在的能源作物，在国民经济发展中具有重要的战略意义……大豆也是受烟粉虱危害最严重的作物之一，有研究发现烟粉虱在几种作物上的种群数量为棉花>大豆>花生>玉米，表明大豆已经是烟粉虱最主要的寄主作物之一。据调查，大豆单叶感染烟粉虱虫数可达267头，单株达624头。烟粉虱危害大豆造成减产20%～30%，甚至绝产。同时，烟粉虱亦传播多种重要的豆科植物病毒，如细裂珊瑚油桐花叶病毒、大豆黄花叶病毒、菜豆金黄花叶病毒、绿豆黄花叶病毒、豇豆轻斑驳病毒和菜豆矮化花叶病毒等多种病毒，从国外的经历来看，烟粉虱大暴发后不久，它所传播的病毒病就会随之大发生。由于烟粉虱具有迁飞能力强、体被蜡质、繁殖能力强、食性杂、易产生抗药性等生物学特性，如何有效的抑制烟粉虱对我国农业爆发成害成为我国农业科技工作者面临的紧要的难题。

面对具有突发性和爆发性特点的烟粉虱病虫害，选育具有对烟粉虱病毒病抗性的大豆品种是防治烟粉虱危害最经济有效的方法。筛选、发掘和创新抗病虫种质资源是开展抗病育种的前提和基础，而抗性基因定位和克隆，则为利用标记辅助选择等分子育种手段、加快和高效培育抗病品种提供了全新和有利工具。但目前国内外有关烟粉虱对大豆危害和防治的研究报道还比较少，有关大豆对烟粉虱病毒病抗性的种质筛选还处于起步阶段，在生产上也没有发现对烟粉虱免疫的品种，所以对烟粉虱病毒病抗性种质进行大规模筛选和开展抗性遗传特性研究显得尤为迫切。

准确鉴定大豆品种对烟粉虱病毒病的抗性是遗传和育种研究的基础。该虫虫体较小，成虫具有极强的流动性，鉴定大豆对烟粉虱的抗性十分困难。由于烟粉虱发生时间较晚，鉴定比较困难，目前国内外还未有成熟的大豆抗烟粉虱鉴定体系。当前大豆对烟粉虱病毒病抗性鉴定所采用的是田间自然发病鉴定法，即将各鉴定品种或品系以小区形式种植于大田，每个小区几十株左右，大田常规栽培管理，烟粉虱自然取食，待大豆显现病（虫）害症状后调查各小区鉴定材料的发病率，以此为标准鉴别大豆材料抗感能力的差异。田间自然发病鉴定法直接采用大田环境，多年多点鉴别种质资源抗性，简单而直观，为目前研究大豆对烟粉虱病虫害抗性鉴定所常用。

然而，由于植物对天敌的抗性分为耐害性、抗生性和排趋性三种类别，各种抗性类别具有不同的抗性机理，大豆也不其外。不同大豆材料对烟粉虱排趋性的差异使得不同大豆材料具有某些形态和生理等特性，表现出对烟粉虱的取食偏向的差异。因此，通过田间自然发病法鉴定的烟粉虱病毒病抗性大豆，可能实际上是对烟粉虱排趋能力强的大豆。若利用对烟粉虱排趋性强的大豆作为抗源培育烟粉虱病毒病抗性品种后，规模种植导致烟粉虱被迫选择强迫饲毒，最终使得大豆对烟粉虱病毒病通过田间自然发病鉴定所表现的假抗病表现消失，将可能给农业生产带来较大的损失。

大田自然发病调查法虽然能够比较大豆品种之间对烟粉虱性状的差异，但鉴定结果容易受环境影响，适用范围也具有较大的局限性，而且无法排除排趋性的干扰导致鉴定结果不够准确。针对已有鉴定方法的不足，开发更适用、范围更广、更准确的大豆对烟粉虱病毒病抗性鉴定方法成为大豆烟粉虱病毒病抗性育种首要解决的难题。

利用本方法评价大豆品种对烟粉虱病毒病的抗性水平，既可以去除排趋性对鉴定结果的干扰，又可以克服品种抗性鉴定所需烟粉虱规模量获取的难题，并且实现了定量而强化的接种鉴定，先采用自然发病鉴定规模初步筛选后采用本技术准确鉴定，组成了目前国内外最优良的大豆对烟粉虱病毒病的抗性鉴定体系。这一鉴定方法除了可以应用于大豆品种资源的发掘鉴定、品种抗性评价、抗病虫大豆品种选育外，亦可以应用于大豆抗病虫基因定位的表型鉴定和抗性遗传规律研究等众多领域。

发明内容

本发明的目的是针对大豆对烟粉虱病毒病抗性的田间自然鉴定中存在的排趋性干扰难题和室内人工接种鉴定的烟粉虱规模量获取难题，提供一种大豆对烟粉虱病毒病抗性的接种鉴定方法，该接种鉴定方法既可以去除排趋性对鉴定结果的干扰，又解决了品种抗性鉴定所需烟粉虱规模量获取的难题，实现了定量而强化的大豆对烟粉虱病毒病抗性的接种鉴定，最终实现了对大豆烟粉虱病毒病抗性的准确评价。

本发明的目的是通过以下技术方案解决的：

一种大豆对烟粉虱病毒病抗性的接种鉴定方法，其特征在于：所述的接种鉴定方法步骤如下：

（a）、采用夜间趋光诱捕法从田间采集烟粉虱后通过纯化筛选装置获取大量烟粉虱成虫；

（b）、将筛选获得的烟粉虱成虫接种到作物昆虫共育箱内培育的棉花上共育并繁育下一代烟粉虱若虫，并进一步利用调整的纯化筛选装置分离获取大量整齐一致的3龄烟粉虱若虫；

（c）、将筛选获得的3龄烟粉虱若虫移入栽有烟粉虱重灾区取材的大豆病株上进行饲毒，3龄烟粉虱若虫饲毒后计重获得单头3龄烟粉虱若虫的重量；

（d）、通过精密电子天平称重获得单头3龄烟粉虱若虫的重量，根据确定的虫/株比例计算所需烟粉虱总重，进而称重定量；

（e）、根据确定的虫/株比例将饲毒后的定量3龄烟粉虱若虫接种到作物昆虫共育箱内栽培的待测大豆品种幼苗上共育传毒；

（f）、待烟粉虱半数死亡时将待测大豆移栽至大田隔虫网室，常规栽培管理，大豆显症后调查株发病率，根据株发病率能够准确鉴定出待测大豆品种的抗病能力。

所述步骤（a）中的烟粉虱收集时间为大田烟粉虱爆发季节。

所述步骤（a）中的纯化筛选装置使用时，采用孔径为45目和55目的分样筛组合可以有效分离出大量整齐一致的烟粉虱成虫。

所述步骤（b）中的烟粉虱成虫接种到作物昆虫共育箱内培育的棉花上时，与烟粉虱成虫共育的棉花为2～3叶期。

所述步骤（b）中的作物昆虫共育箱的培养温度控制在27℃、光14h/暗10h。

所述步骤（b）中的作物昆虫共育箱内繁育下一代烟粉虱若虫后，此时筛选装置翻转90°将垂直的趋光方向改变为水平方向，采用孔径为90目和120目的分样筛组合以有效分离获得大量整齐一致的3龄烟粉虱若虫。

所述步骤（c）中的大豆病株为上一年自烟粉虱重灾区取材后于-20℃的冰箱冷藏的，待病株自然解冻后将根用浸水脱脂棉包裹并用塑料布包扎结实模拟大田移栽方式垂直固定于作物昆虫共育箱内，然后移入3龄烟粉虱若虫饲毒48h。

所述步骤（d）中的3龄烟粉虱若虫饲毒后趋光分离毛刷刷离烟粉虱若虫时夹杂的杂质和死虫，然后转移部分烟粉虱若虫进称量瓶，通过精密电子天平称重，去皮计算瓶内烟粉虱若虫的总重后根据瓶内烟粉虱若虫的数量，计算得到单头烟粉虱若虫的重量，以根据待测大豆株数和接种强度确定饲毒烟粉虱若虫数目，进而计算接种所需饲毒烟粉虱若虫重量并称重定量。

所述步骤（e）中的待测大豆生长处于2～3叶期，且待测大豆按照40cm²/株的比例留取长势健康均匀的大豆苗。

所述步骤（e）中的待测大豆按照50～150虫/株的比例接种饲毒后的3龄烟粉虱若虫，作物昆虫共育箱的培养温度控制在27℃、光14h/暗10h共育传毒至接种的烟粉虱自然衰老死亡。

本发明相比现有技术有如下优点：

本发明通过纯化筛选装置获得大量的大田来源的烟粉虱成虫，进而通过作物昆虫共育箱共育出大量的3龄烟粉虱若虫，并再次通过纯化筛选装置获得大量整齐一致的3龄烟粉虱若虫，然后通过3龄烟粉虱若虫共育饲毒、待测大豆定量共育接种传毒的方式使得待测大豆发病，最后通过调查烟粉虱病毒病的发病情况即可准确鉴定出待测大豆品种的抗病能力。

本发明的鉴定方法既可以去除排趋性对鉴定结果的干扰，又可以克服品种抗性鉴定所需烟粉虱规模量获取的难题，并且实现了定量而强化的大豆烟粉虱病毒病抗性的接种鉴定，能够准确地评价大豆品种对大豆烟粉虱病毒病的抗性水平；该鉴定方法除了可以应用于大豆品种资源的发掘鉴定、品种抗性评价、抗病品种选育外，亦可以应用于抗病基因定位的表型鉴定和抗性遗传规律研究等众多领域，故适宜推广使用。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

一种大豆对烟粉虱病毒病抗性的接种鉴定方法，该接种鉴定方法步骤如下：（a）、大田烟粉虱的获取和分离纯化：在烟粉虱爆发季节采用夜间趋光诱捕法从大田采集烟粉虱成虫，其中含有大量杂质和杂虫。针对各地气候和种植作物的不同，采集时间因地制宜。然后利用纯化筛选装置进行分离筛选，为主要获取烟粉虱成虫，纯化筛选装置的分样筛采用孔径为45目和55目的分样筛组合，因为筛取调查发现，45～55目的分样筛组合可有效的屏蔽掉烟粉虱死虫、杂质和无（弱）趋光性昆虫、大体型趋光性昆虫、小体型趋光性昆虫和烟粉虱幼龄若虫的干扰，有效分离出大量整齐一致的烟粉虱成虫；（b）、3龄烟粉虱若虫的培育和分离筛选：将筛选获得的烟粉虱成虫接种到作物昆虫共育箱内培育的2～3叶期棉花上共育并繁育下一代烟粉虱若虫，作物昆虫共育箱的培养温度控制在27℃、光14h/暗10h，共育两周左右可观察到大量烟粉虱若虫出现，待多数若虫生长到3龄期，用柔软的毛刷将聚集在棉花叶和茎秆上的大量烟粉虱若虫分离进塑料盒内；为筛选整齐一致的3龄烟粉虱若虫，筛选装置参照成虫筛选装置进行调整，同样利用若虫的趋光性进行分选，分样筛组合选择90～120目，且由于若虫运动能力较弱，此时筛选装置翻转90°设置将垂直的趋光方向改变为水平方向，将若虫置于黑暗一端，若虫趋光水平爬动，采用90～120目的分样筛组合能够分离获得大量整齐一致的3龄烟粉虱若虫；（c）、烟粉虱若虫饲毒：将上一年在-20℃的冰箱中冷藏的大豆烟粉虱重灾区取材的大豆病株自然解冻，将病株根用浸水脱脂棉包裹并用塑料布包扎结实模拟大田移栽方式垂直固定于作物昆虫共育箱（仅通风光照，不播种、不通水）内，然后移入3龄烟粉虱若虫饲毒48h，使得3龄烟粉虱若虫带毒；（d）计量烟粉虱若虫：用柔软的毛刷将饲毒后的3龄烟粉虱若虫分离进塑料盒，不设分样筛，趋光分离毛刷刷离3龄烟粉虱若虫时夹杂的杂质和死虫，转移部分3龄烟粉虱若虫进称量瓶，精密电子天平称重，去皮计算瓶内3龄烟粉虱若虫的总重后根据瓶内烟粉虱若虫的数量，计算得到单头3龄烟粉虱若虫的重量，以根据待测大豆株数和接种强度确定烟粉虱数目，进而计算接种所需烟粉虱重量并称重定量；（e）、待测大豆与带毒3龄烟粉虱若虫定量共育传毒：当步骤（b）中的作物昆虫共育箱内烟粉虱若虫大量出现（多一龄若虫）时，将待测大豆品种播种在作物昆虫共育箱内培养，每箱播种一个待测大豆品种（家系），完成步骤（c）后待测大豆幼苗的生长会处于2～3叶期，按照40cm²/株的比例淘汰弱苗和不均匀的苗以留取长势健康均匀的大豆幼苗，按照50～150虫/株的比例将饲毒后的定量3龄烟粉虱若虫接种到作物昆虫共育箱内栽培的待测大豆品种幼苗上共育传毒，作物昆虫共育箱的培养温度控制在27℃、光14h/暗10h共育传毒至接种的烟粉虱自然衰老死亡；（f）、待测大豆大田显症统计：待烟粉虱半数死亡时将待测大豆移栽至大田隔虫网室，常规栽培管理，大豆显症后调查株发病率，根据株发病率能够准确鉴定出待测大豆品种的抗病能力。

实施例一

2013年8月5日夜间，在大田里安装诱虫灯诱捕烟粉虱活体成虫，诱捕一夜后，积虫瓶内采集到大量的烟粉虱，亦含大量杂虫，利用一种大田来源灰飞虱成虫的纯化筛选装置（ZL 201310290925.X）进行分离筛选，为分离出虫龄整齐一致的纯净的烟粉虱成虫，试验了不同孔径的分样筛组合，肉眼观察计数。

  

筛取调查发现，45～55目的分样筛组合可有效的屏蔽掉烟粉虱死虫、杂质和无（弱）趋光性昆虫、大体型趋光性昆虫、小体型趋光性昆虫和烟粉虱幼龄若虫的干扰，有效分离出整齐一致的烟粉虱成虫。

实施例二

1、采用本技术鉴定大豆黄花叶病与田间自然发病鉴定大豆黄花叶病的差异

2013年，在多个大豆烟粉虱重灾区发病点采用大田自然发病鉴定法，调查大豆黄花叶病发病率，同时采用本技术鉴定大豆黄花叶病发病率。

分析表二发现，五个大豆品种采用本方法鉴定与重灾区自然发病鉴定的大豆黄花叶病发病率差异显著，其它四个品种相对鲁豆10号黄花叶病发病率的相对抗感比差异也大多显著，滑皮豆和狼子尾相对鲁豆10号的黄化病发病率相对抗感比排名甚至出现了颠置，可能是由于品种间对烟粉虱的排趋性差异造成的。

2、不同大豆品种对烟粉虱排趋性差异鉴定

为研究不同鉴定技术获得的大豆品种对黄花叶病发病率鉴定结果不同的原因，我们做了不同大豆品种排趋性鉴定实验。将催芽后的大豆种子播于65cm×44cm×14cm的塑料周转箱内，每个品种1行，每行5株。待幼苗长至2.5～3.0叶期，按每株20头接入烟粉虱4龄若虫，每天上午8时、下午4时调查每个单株上的虫数，每次调查后进行驱虫，使其尽量均匀分布。环境温度保持在26±2℃，自然光照。5天后计算每个品种每个单株上的平均虫数，作为排驱性测验值，结果如表三。

由表三排趋性实验结果可以发现，五个大豆品种对烟粉虱的排趋性由强到弱依次为滑皮豆>狼子尾>鲁豆12号>齐黄28>鲁豆10号。对比表二可以发现，滑皮豆在大田抗病表现优于狼子尾的主要原因是滑皮豆对烟粉虱的排趋能力要强于狼子尾，而种质抗病能力要远远不如狼子尾，对烟粉虱排趋性强的品种虽然会在田间自然发病鉴定中抗病表现更为优秀，但若利用对烟粉虱排趋性强的大豆作为抗源培育烟粉虱病毒病抗性品种后，规模种植导致烟粉虱被迫选择而使得大豆对烟粉虱因排趋性而产生的病毒病抗性表现消失，将可能给农业生产带来较大的损失。因此，在大豆黄花叶抗性育种中滑皮豆不能作为大豆黄花叶病抗源品种使用。

通过实施例二可以发现，本技术路线使得大豆对烟粉虱病毒病抗性的接种鉴定结果可以有效排除田间自然发病鉴定中排趋性的影响，其结果比大田自然鉴定更加准确，值得进一步推广利用。

以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。