单一紫外光激发的评价昆明犬精子活性的荧光染色法

摘要

单一紫外光激发的评价昆明犬精子活性的荧光染色法，通过TCG洗精液的配制、精液洗涤、染色、显微镜检测四个步骤实现，本发明采用能被同一波长紫外光所激发的二种荧光染料对昆明犬精子进行荧光染色，不用切换光源就可准确地鉴别精子活性；而且由于这二种染料在激光激发后一种发红色荧光，另一种发蓝色荧光，故在检测活性同时还可引入发绿色荧光的染料进行精子顶体完整性的检测。本发明操作简单，结果准确，可信度高，可以用荧光显微镜或流式细胞仪对昆明犬精子活性及顶体完整性做出准确检测。

说明书

 技术领域

    本发明属于动物繁殖技术领域，具体是单一紫外光激发的评价昆明犬精子活性的荧光染色法。

 背景技术

    精子活性是评价精子质量的一个必不可少的标准，它主要通过各种染色法来进行。犬精子活性评价的染色曾经用过曙红、吉姆萨、台盼兰等非荧光染料，这类方法借助普通光学显微镜即可对精子活性做出检测，但使用起来较为繁琐，死精子比例会被估计过高且不同实验室的检测结果差异较大，因此，非荧光染色法的可信度远远不如荧光染色法。

   现在，对犬精子活性的检测通常采用碘化丙锭（propidium iodide, PI）、Hoechst 33258、羧基荧光素双醋酸盐（carboxyfluorescein diacetate, CFDA）、羧基二甲基荧光素双醋酸盐（carboxy dimethyl fluoresccein diacetate, CMFDA）等荧光探针在荧光显微镜下来进行。PI和Hoechst 33258 是死精子的特异荧光探针，它们只能进入质膜破损的精子与DNA 结合，因此只有质膜破损的精子才能被染色。CFDA和CMFDA是活精子的特异荧光探针，它们能够进入细胞膜完整的精子，CFDA和CMFDA本身是一类非荧光物质，能够进入细胞并容易被细胞内的非特异性酯酶水解，形成强荧光产物，发绿色荧光，因此具有完整细胞膜的精子发绿色荧光。用CFDA和CMFDA评价精子质膜完整性时要严格限定时间，因为细胞内荧光随着时间推移而不断增强。

   目前，所采用的方法有仅用一种染料的单染色法，也有同时使用二种染料（如PI+CFDA）的双重染色法，但PI+CFDA联用的双染色法由于二种染料激发荧光的光波不同，故染色时需要切换不同的光源，操作起来较为繁琐。此外，CFDA在激光激发下发绿色荧光，若要在检测精子活性时同时检测其顶体完整性或精子的其他指标就无法兼顾，因为检测顶体的荧光探针大多也发绿色荧光，与同样发绿色荧光的CFDA光谱重叠。本发明研发出PI/Hoechst33342 双重荧光染色法，用其对昆明犬精子进行活性检测，活精子发蓝色荧光，死精子发红色或粉红色荧光，不仅检测直接、客观，更重要的是二种荧光探针只需同一波长的紫外光激发，可以同时检测精子的死活，清楚地将死精子与活精子区分开来。同时染色不受时间影响，不存在背景染色的问题，故操作极为方便，而且，这种染色法还可引入发绿色荧光的精子顶体探针同时检测多个指标。

   昆明犬是中国唯一列入世界知名警犬的优良定型犬种，是中国独立自主培育的唯一工作犬种，在追踪、鉴别、搜毒、搜爆、巡逻、守候、警戒、消防、探雷等领域发挥着重要作用，其种质资源极为宝贵，但关于昆明犬生殖生物学研究的数据还很缺乏，目前尚未见到有关昆明犬精子荧光染色法的报道，用本发明的PI/Hoechst33342 双重荧光染色法评价昆明犬精子的活性为国际首创，迄今为止，也未见有用这种方法检测犬精子活性的报道。

 发明内容

    本发明提供用单一紫外光激发的评价昆明犬精子活性的荧光染色法，该方法用同一波长激光激发的红色和蓝色荧光染料同时对昆明犬精子进行双重染色，经荧光显微镜或流式细胞仪检测，不用切换光源就可以直接判定精子的死活，操作简便，结果准确，而且，本发明还可与第三种发绿色荧光的染料联用，如与检测精子顶体完整性的染料联用，可同时对精子活性及顶体完整性做出准确的评价。

    本发明所采取的技术方案如下：

单一紫外光激发的评价昆明犬精子活性的荧光染色法，通过以下步骤实现：

（1）缓冲液，也即TCG洗精液的配制

称取2.4 g Tris, 1.4 g 柠檬酸, 0.8 g葡萄糖, 0.06 g青霉素G钠盐以及0.1 g 硫酸链霉素加入Milli-Q超纯水中混合，混合均匀后加Milli-Q超纯水定容至100mL，用1N NaOH 或1N HCl调节pH至6.8，制成TCG洗精液；

（2）精液洗涤

将采集的新鲜精液2-3mL转至灭菌的15ml离心管中，加入10ml 水浴预热致37℃的TCG洗精液，700g离心5min，弃上清，加10ml 37℃的TCG洗精液再离心洗涤一次，沉淀用适量TCG洗精液重悬，使精子浓度为30×10⁶/mL；

（3）染色

取1ml清洗后的精液，分别加入2μL H342和8μL PI，37℃温浴15min；

（4）显微镜检测

取8μL精液于载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下检测并计数。

对冷冻的精子进行检测时，通过如下步骤实现：

（1）TCG洗精液、防冻液的配制

称取2.4 g Tris, 1.4 g 柠檬酸, 0.8 g葡萄糖, 0.06 g青霉素G钠盐以及 0.1 g 硫酸链霉素加入60mL Milli-Q超纯水中，溶解后加入20mL卵黄，混合均匀后加Milli-Q超纯水定容至100mL，于7000g离心1 h 去除卵黄颗粒，取上清液用1N NaOH 或1N HCl调节pH至6.8，制成冷冻保存的稀释液，亦即TCG洗精液；向稀释液中加入体积比为10%的甘油制成2×防冻液；

（2）精液的洗涤、保存与复苏

将2-3mL新鲜精液转移到已灭菌的15ml离心管中，加入10mL 37℃预热的TCG洗精液，700g离心洗涤2次，每次5min；所得沉淀用800μl TCG洗精液重悬，使精子浓度为400×10⁷个/ml；重悬后的精液取50μl于4mL 离心管中, 加入450μl TCG洗精液，于4℃冰浴降温2小时；将等体积、预冷至4℃的2×防冻液分5次，每次间隔6min缓慢加入降温后的精子中，继续在4℃平衡30 分钟，得到的精子分别装入0.25 mL 冷冻麦管并加热封口；将麦管置于液氮面上方5cm 处熏蒸冷冻10 分钟后投入液氮中保存；复苏时将麦管迅速放入37℃水浴中轻轻搅动2分钟；复苏后的精液用37℃预热的TCG洗精液于700g,离心洗涤两次，每次5min，沉淀用TCG洗精液稀释使精子数为30×10⁶个/mL；

（3）染色

取1ml上述复苏清洗后的精液，加入2μl H342和8μl PI，于37℃温浴15min；

（4）显微镜检测

取8μl精液于载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下检测并计数。

   所述步骤（2）离心洗涤所用TCG洗精液以水浴保温于37℃。

   所述步骤（3）中H342代表Hoechst 33342。

   所述步骤（3）中H342和PI为浓度1mg/mL的贮存液，事先用去离子水配制、分装并保存于-20℃冰箱。

   所述Tris为三羟甲基氨基甲烷的英文缩写。

所述TCG代表Tris、柠檬酸、葡萄糖的英文首字母缩写。

   本发明的优点是：

   采用能被同一波长紫外光所激发的二种荧光染料对昆明犬精子进行荧光染色，不用切换光源就可准确地鉴别精子活性；而且由于这二种染料在激光激发后一种发红色荧光，另一种发蓝色荧光，故在检测活性同时还可引入发绿色荧光的染料进行精子顶体完整性的检测。本发明操作简单，结果准确，可信度高，可以用荧光显微镜或流式细胞仪对昆明犬精子活性及顶体完整性做出准确检测。

 具体实施方式

   以下通过实施例对本发明做进一步描述。

   实施例1：

   称取2.4 g Tris, 1.4 g 柠檬酸, 0.8 g葡萄糖, 0.06 g青霉素G钠盐以及 0.1 g 硫酸链霉素加入Milli-Q超纯水中，混合均匀后加水定容至100mL，调节pH至6.8，制成TCG洗精液；将采自昆明犬的新鲜精液2mL转至灭菌的15ml离心管中，加入10 mL于37℃水浴保温的TCG洗精液，700g离心5min，弃上清，加10 mL 37℃的TCG洗精液再离心洗涤一次，沉淀用2-3mL TCG 缓冲液重悬，使精子浓度为30×10⁶/mL；取1mL稀释后的精液，分别加入2μL Hoechst 333422和8μL PI，于37℃温浴15min；取8μl精液于载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下检测并计数至少200个精子，本次实际计数了213个精子，结果为活精子172个，死精子41个，故昆明犬精子活力为81%。

   实施例2：

   称取2.4 g Tris, 1.4 g 柠檬酸, 0.8 g葡萄糖, 0.06 g青霉素G钠盐以及 0.1 g 硫酸链霉素加入60mL Milli-Q超纯水中，溶解后加入20mL卵黄，混合均匀后加Milli-Q超纯水定容至100mL，于7000g离心1 h 去除卵黄颗粒，取上清液调节pH至6.8，制成冷冻保存的稀释液，亦即后面所说的TCG洗精液；向稀释液中加入体积比为10%的甘油制成2×防冻液；将3mL新鲜精液转移到已灭菌的15ml离心管中，加入10mL 37℃预热的TCG洗精液，700g离心5min洗涤2次；所得沉淀用800μl TCG洗精液重悬，使精子浓度为400×10⁷个/ml, 取50μl于4mL 离心管中, 加入450μl不含甘油的冷冻稀释液，于4℃冰浴降温2 小时；将等体积、预冷至4℃的2×防冻液分5次，每次间隔6min，缓慢加入降温后的精子中，继续在4℃平衡30 分钟；将精子分别装入0.25 mL 冷冻麦管并用封口机加热封口；将麦管置于液氮面上方5cm 处熏蒸冷冻10 分钟后投入液氮中保存。复苏时将麦管迅速放入37℃水浴中轻轻搅动2分钟；复苏后的精液用37℃预热的TCG 洗精液于700g,离心洗涤两次，每次5min，沉淀用TCG 洗精液稀释使精子数为30×10⁶/ml，取1ml 加2μl H342和8μl PI，于37℃温浴15min；取8μl精液于载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下检测并计数至少200个精子，本次实际计数216个精子，活精子为117个，死精子为99个，故冷冻复苏后的昆明犬精子活力为54%。

上述实例仅仅是为清楚的说明本发明所作的举例，对于所述领域的普通技术人员来说，由此引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。