留兰香精油在制备治疗过敏性皮肤病药物中的应用

摘要

本发明公开了留兰香精油在制备治疗过敏性皮肤病药物中的应用。相对于现有技术，本发明方法中，留兰香精油能够稳定肥大细胞膜，减少肥大细胞脱颗粒，抑制组织胺及β-氨基己糖苷酶释放，减少炎症反应，并且能够降低毛细血管通透性，缓解皮肤被动过敏反应的症状。

说明书

技术领域

本发明涉及留兰香精油在制备治疗过敏性皮肤病药物中的应用，属于药物新用途领 域。

背景技术

过敏性皮肤病是由过敏原引起的皮肤病，具体的过敏原包括接触过敏原、吸入过敏 原、食入过敏原和注射入过敏原。每类过敏原都可以引起相应的过敏性皮肤病，主要的 表现是多种多样的皮炎、湿疹、荨麻疹、药疹、接触性皮炎等。随着大气污染、滥用农 药、婴幼儿过早使用及滥用抗生素、食品日益丰富或精神压力增大等原因，发病人群逐 渐增多，严重影响人类健康。现有治疗药物主要是激素类，但其副作用比较明显。

发明内容

本发明的目的是提供留兰香精油治疗过敏性皮肤病的新用途。

针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了留兰香精油在制备治疗过敏性皮肤病药物中的应用。

作为优选，所述留兰香精油的提取方法如下：

(1)取留兰香，粉碎，无水乙醇和乙醚的混合溶液作为提取液，水浴加热提取， 得粗提液；

(2)上述粗提液中加入活性炭，加热至沸腾，搅拌，冷却，抽虑，收集滤液；

(3)将上述滤液中的无水乙醇和乙醚除去，即得所述留兰香精油。

进一步优选，所述无水乙醇和乙醚的体积比为2：(2-4)，提取温度为80-100℃。

作为进一步优选，所述过敏性皮肤病为化学接触、呼吸道吸入、注射药物、饮食或 者疾病所引起的接触性皮炎、湿疹、荨麻疹或者药疹。

本发明方法所述留兰香精油也可以与其它有效治疗过敏性皮肤病的化合物一起协 同使用。

本发明的有益效果主要是：

相对于现有技术，本发明方法中，留兰香精油能够稳定肥大细胞膜，减少肥大细胞 脱颗粒，抑制组织胺及β-氨基己糖苷酶释放，减少炎症反应，并且能够降低毛细血管通 透性，缓解皮肤被动过敏反应的症状。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但应注意本发明的范围并不受这些 实例的任何限制。

实施例1留兰香精油的提取

用滤纸小袋包裹15g留兰香茎粉，置于索氏提取器中，加入无水乙醇和乙醚的混合 溶液100ml，所述无水乙醇和乙醚的体积比为40:40，水浴加热至80℃。反复提取后至 烧瓶中颜色与新浸出液颜色差不多时止。转移留兰香精油粗提液于烧杯中，加入1g活 性炭，加热至沸腾，并不时地搅拌，冷却后进行抽虑，收集滤液。用连有减压泵的旋转 蒸发仪蒸发其中的溶剂，收集蒸发后剩余的液体即为留兰香精油。

实施例2留兰香精油的提取

用滤纸小袋包裹15g留兰香茎粉，置于索氏提取器中，加入无水乙醇和乙醚的混合 溶液100ml，所述无水乙醇和乙醚的体积比为40:80，水浴加热至90℃。反复提取后至 烧瓶中颜色与新浸出液颜色差不多时止。转移留兰香精油粗提液于烧杯中，加入1g活 性炭，加热至沸腾，并不时地搅拌，冷却后进行抽虑，收集滤液。用连有减压泵的旋转 蒸发仪蒸发其中的溶剂，收集蒸发后剩余的液体即为留兰香精油。

实施例3留兰香精油的提取

用滤纸小袋包裹15g留兰香茎粉，置于索氏提取器中，加入无水乙醇和乙醚的混合 溶液100ml，所述无水乙醇和乙醚的体积比为40:60，水浴加热至100℃。反复提取后 至烧瓶中颜色与新浸出液颜色差不多时止。转移留兰香精油粗提液于烧杯中，加入1g 活性炭，加热至沸腾，并不时地搅拌，冷却后进行抽虑，收集滤液。用连有减压泵的旋 转蒸发仪蒸发其中的溶剂，收集蒸发后剩余的液体即为留兰香精油。

实施例4留兰香精油对肥大细胞脱颗粒，释放组织胺及β-氨基己糖苷酶的影响：

注：以下所用留兰香精油均为本发明实施例3所得留兰香精油

1、肥大细胞脱颗粒试验

大鼠嗜碱性细胞白血病细胞株RBL-2H3，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞 资源中心。RBL-2H3具有肥大细胞的许多生物学特性，被认为是体外检测脱颗粒反应的 最佳模型。用含有10％胎牛血清的DMEM培养液，于5％CO₂，37℃条件下对细胞进 行培养。传代时用0.25％胰酶消化约3min，用少量血清终止消化，吹打细胞使其成单 个细胞。离心收集细胞，调整细胞浓度为5×10⁴/ml，种于24孔板，1ml细胞悬液/孔， 5％CO₂，37℃培养过夜使贴壁。培养24h后，每孔加入不同浓度的留兰香提取物溶液 (溶剂为二甲基亚砜DMSO，DMSO的终浓度不超过0.5％)20μl，加入相同体积的PBS 作为正常对照组，另外加入5μM的地塞米松作为阳性对照。30min后再分别加入终浓 度为10μg/ml的C48/80(本领域公知的，在细胞实验中常用的引起细胞脱颗粒的复合 物)20μl，继续培养1h后，弃去培养液，每孔中加入0.5％的中性红染液0.4ml，37℃ 染色3min，随机计数每100个肥大细胞中脱颗粒细胞数。设立3个复孔，重复3次实 验取平均值。脱颗粒细胞百分比％＝脱颗粒细胞数/(脱颗粒细胞数+未脱颗粒细胞数) ×100％。

2、组织胺释放试验

按照前述方法将RBL-2H3细胞培养在24孔板上，用PBS洗涤细胞两次，加入新的 含有10％胎牛血清的DMEM培养基1ml，继续培养30min。每孔加入不同浓度的留兰 香提取物溶液20μl(溶剂同上)，加入相同体积的PBS作为正常对照组，另外加入5μM 的地塞米松作为阳性对照。30min后再分别加入终浓度为10μg/ml的C48/80 20μl，继 续培养1h。吸取细胞培养上清50μl，加入到低荧光本底的黑底96孔板中，随后加入 50μl 0.1M的HCl，然后加入0.4M NaOH溶液25μl，振荡混匀后立即加入0.1％与邻苯 二甲醛的甲醇溶液5μl，充分混匀并置室温下反应10min，加入0.5M HCl 25μl终止反 应。所得反应产物置于Tecan多功能微孔酶标仪进行检测，激发波长为347nm发射波 长为442nm。相应地，每孔细胞通过反复冻融后收集细胞裂解液，同法检测细胞内组织 胺水平。根据标准曲线分别计算细胞上清和细胞中的组织胺含量。每孔细胞进行蛋白定 量，平衡细胞数目差异。

3、β-氨基己糖苷酶释放试验

按照前述方法将RBL-2H3细胞培养在24孔板上，用PBS洗涤细胞两次，加入新的 含有10％胎牛血清的DMEM培养基(不含酚红)0.5ml，继续培养30min。每孔加入 不同浓度的留兰香提取物溶液20μl(溶剂同上)，加入相同体积的PBS作为正常对照组， 另外加入5μM的地塞米松作为阳性对照。30min后再分别加入终浓度为10μg/ml的 C48/80 20μl，继续培养1h。吸取细胞培养上清50μl，加入到96孔板中，随后加入50μl 底物溶液(2mM的p-硝基苯-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖胺，0.2M柠檬酸，pH 4.5)，37℃ 反应2h。加入1M Tris缓冲液(pH 9)100μl终止反应，405nm波长下测定吸光度。 相应地，用0.1％Triton X-100破碎细胞后离心去除沉淀，同法测定细胞中的β-氨基己糖 苷酶。每孔细胞进行蛋白定量，平衡细胞数目差异。根据β-氨基己糖苷酶标准曲线分别 计算细胞上清中与细胞中β-氨基己糖苷酶含量，β-氨基己糖苷酶释放率＝上清的β-氨 基己糖苷酶/(上清β-氨基己糖苷酶+胞内β-氨基己糖苷酶)×100％。

4、数据处理

结果表示为平均值±标准差，分别为3复孔，重复3次实验的结果。统计学检测为 Student’s two-tailed t-test。

5、结果

RBL-2H3细胞分别用浓度(体积比)为0.1％、0.2％及0.4％的留兰香精油溶液或地 塞米松(5μM)处理，分别测定对C48/80引起的细胞脱颗粒、组织胺及β-氨基己糖苷 酶释放的影响，结果见表1

表1留兰香对RBL-2H3细胞脱颗粒、释放组织胺及β-氨基己糖苷酶的影响

注：与阴性对照组相比***P<0.001；与C48/80组(模型组)相比^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001。

由上表1结果可见，与阴性对照组相比，C48/80组的脱颗粒率、组织胺和β-氨基己 糖苷酶释放率均显著提高，表明造模成功；与C48/80组相比较，留兰香精油中剂量和 高剂量组的脱颗粒率、组织胺和β-氨基己糖苷酶释放率均显著降低，而高剂量组和阳性 对照组-地塞米松组的效果相当。

通过形态观察，培养的肥大细胞株RBL-2H3在中性红染色后可见细胞呈长梭形， 细胞膜完整，结构致密，着色浅；10μg/ml的C48/80 20μl刺激下出现细胞脱颗粒现象， 表现为细胞变圆，体积增大，边缘不整，细胞内出现空泡，着色较深；并且组织胺释放 增加，β-氨基己糖苷酶释放率上升。阳性药物地塞米松能够抑制C48/80诱导的肥大细胞 株RBL-2H3脱颗粒及释放组织胺和β-氨基己糖苷酶。而给以留兰香精油进行干预后， 也同样表现对RBL-2H3细胞脱颗粒的抑制作用及减少组织胺和β-氨基己糖苷酶释放。

实施例5留兰香精油对毛细血管通透性的影响：

1、实验方法

取Balb/c小鼠30只，按照体重随机分成3组：空白对照组、组织胺模型组和留兰 香提取物治疗组，每组10只，雌雄各半。小鼠在实验前1天，用8％硫化钠将小鼠背部 脱毛(3cm×3cm)。皮下注射0.1％的磷酸组织胺50μl，随后立即在注射部位周围涂抹 5％(体积比)的留兰香精油溶液60μl(溶剂为橄榄油)。尾静脉注射0.5％的伊文思蓝 生理盐水溶液25mg/kg。空白对照组皮下注射等量生理盐水，组织胺模型组则在注射部 位涂抹生理盐水60μl，其余操作相同。每只小鼠在注射完伊文思蓝溶液15min后脱臼 处死。取下蓝染部分的皮肤打四个孔(9mm/孔)，剪碎后浸泡于丙酮-生理盐水(7∶3) 溶液1ml中,48h后3000×g，离心10min，取上清液，用紫外分光光度计在波长610nm 处，以丙酮-生理盐水溶液空白校零，测定所取样本的吸光度值(OD)。根据伊文思蓝标 准曲线：伊文思蓝浓度(μg/ml)＝134.71×OD+10.89计算伊文思蓝浓度

2、数据处理

伊文思蓝浓度根据标准曲线计算，表格中的数字为各组平均值±标准差，n＝10。统 计学检测为Student’s two-tailed t-test。

3、结果

Balb/c小鼠背部皮肤注射组织胺后，立即给以留兰香精油处理，并尾静脉注射伊文 思蓝，随后测定皮肤中伊文思蓝的吸光度，并根据标准曲线计算伊文思蓝浓度，结果见 表2。

由表2结果显示，与空白组相比较，模型组的吸光度显著增大，伊文思蓝浓度显著 提高，表明造模成功；与模型组相比较，留兰香精油治疗组的吸光度显著减小，伊文思 蓝浓度显著降低。

表2留兰香精油对毛细血管通透性的影响

注：与空白组相比***P<0.001；与模型组相比，^###P<0.001。

Balb/c小鼠在注射组织胺后，背部皮肤出现蓝染，用紫外分光光度计测定显示有伊 文思蓝从毛细血管漏出，表明在组织胺的作用下毛细血管的通透性增加。而未用组织胺 处理的小鼠未显示有显著的蓝染。用留兰香精油处理小鼠背部皮肤能够显著抑制由组织 胺引起的毛细血管通透性增加，表现为伊文思蓝漏出减少，吸光度降低。

实施例6留兰香精油对被动皮肤过敏反应的影响

1、实验方法

制备Al(OH)₃凝胶佐剂：称取1.7g无水AlCl₃加入25ml生理盐水，搅拌使其溶解， 缓慢滴加10M的NaOH溶液，使之形成絮状沉淀，pH调至8～9。

制备抗血清：取Wistar大鼠4只皮下注射卵蛋白(ovalbumin,OVA)佐剂致敏液(20 mg/ml的OVA生理盐水溶液与Al(OH)₃凝胶佐剂按体积1∶1混合而成)，每次0.5ml， 隔日1次，连续3次，末次注射致敏后第12天，腹主动脉采血，室温静置，凝固后3000 ×g离心10min，分离血清，分装并于-20℃保存备用。

Wistar大鼠致敏：将Wistar大鼠分成3组，空白组、模型组及留兰香精油组，每组 6只。分别用戊巴比妥钠35mg/kg麻醉，背部剃毛，面积3cm×4cm。分别于剃毛处 皮内注射抗血清0.1ml，每只大鼠注射4个点，进行被动致敏。48h后，空白组大鼠尾 静脉注射生理盐水，模型组大鼠及留兰香精油组尾静脉注射终浓度为10mg/ml的OVA 及0.5％伊文思蓝混合溶液0.5ml/只。尾静脉注射结束后分别于留兰香精油组大鼠背部 涂抹留兰香精油溶液(橄榄油为溶剂)，模型组涂抹不含有留兰香精油的同剂型对照。 30min后，以25％乌拉坦1g/kg麻醉动物，直尺测量抗血清注射部位皮肤的蓝色斑点直 径，取每只大鼠背部4个点的平均值进行计算。如前述方法测定大鼠背部皮肤中伊文思 蓝的浓度。

2、数据处理

伊文思蓝浓度根据标准曲线计算，表格中的数字为各组平均值±标准差，n＝10。统 计学检测为Student’s two-tailed t-test。

3、结果

由表3结果显示，空白组大鼠背部皮肤未见蓝色斑点，OVA致敏的模型组大鼠有显 著的蓝色斑点，直径均大于5mm，并且伊文思蓝浓度显著提高，表明造模成功；与模 型组相比较，涂抹有留兰香精油的大鼠背部蓝色斑点直径较小，伊文思蓝浓度低，与模 型组相比较有显著差异。表明留兰香精油能显著抑制大鼠的被动皮肤过敏，能够用于治 疗过敏性皮肤病。

表3留兰香精油对大鼠被动皮肤过敏的影响

注：与空白组相比***P<0.001；与模型组相比，^##P<0.01，^###P<0.001。

综合实施例4、实施例5和实施例6结果所述，留兰香精油对于皮肤过敏反应有抑 制作用，能稳定肥大细胞膜，减少肥大细胞脱颗粒，抑制组织胺及β-氨基己糖苷酶释放， 减少炎症反应。并且能够降低毛细血管通透性，缓解皮肤被动过敏反应的症状。留兰香 精油可以作为一种有效的治疗药物用于多种原因引起的过敏性皮肤病。