一株耐高温Spathaspora passalidarum突变株及其在发酵木糖产乙醇中的应用

摘要

本发明公布了一株耐高温Spathaspora passalidarum突变株及其在发酵木糖产乙醇中的应用，属于微生物发酵技术领域。为了解决一般的工业发酵微生物如酿酒酵母不能利用木糖发酵产乙醇的问题，本发明提供了一株新的酵母菌株-Spathaspora passalidarum U-30，该菌株已于2014年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No:9863。所述菌株通过原始菌株紫外诱变得来，在37℃下摇瓶发酵的乙醇产量比原始菌株提高了36.5％，其温度耐受性提高到41℃，乙醇耐受性提高到12％。

说明书

技术领域：

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一株经过紫外诱变筛选获得的耐 高温的酵母菌Spathaspora passalidarumU-30及其利用木糖生产乙醇的方法。

背景技术：

随着石油能源的濒临耗尽，以及以玉米等农作物为原料的第一代生物乙醇威 胁到粮食安全，利用来自农业，工业，林业和城市废弃物中的木质纤维素生物质 为原料生产的第二代生物乙醇越来越受到各大国的关注。木质纤维素是地球上最 丰富的可再生资源。利用木质纤维素原料生产燃料乙醇是解决能源危机、资源危 机以及环境污染的一种有效方法。木质纤维素原料中纤维素、半纤维素、木质素 所占比例约为4：3：3，其中半纤维素的主要水解产物为木糖，是木质纤维素原 料中第二大糖类。由木糖转化得到的乙醇的产率决定了木质纤维素原料转化为乙 醇的转化效率。

对于一般的工业发酵微生物如酿酒酵母并不能利用木糖发酵产乙醇。天然的 木糖发酵酵母如树干毕赤酵母，虽然可以有效的发酵木糖产乙醇，但在利用木质 纤维素生产乙醇时，菌株会被预处理木质纤维素原料所产生的化合物所抑制。更 重要的是，树干毕赤酵母在混糖发酵时，葡萄糖的存在会抑制木糖的利用。 Spathaspora passalidarum是一株最近发现可以天然利用木糖发酵的新型酵母。研 究发现，在氧气限制条件下利用木糖的速度高于利用葡萄糖的速度，可以利用木 质纤维素水解液中的葡萄糖、木糖、纤维二糖混合发酵，且葡萄糖的存在对木糖 发酵没有抑制作用。

高温发酵对于乙醇生产具有重要意义，提高发酵温度可以降低设备冷却能 耗，减少冷却水用量，从而有效降低乙醇生产成本。同时，对于糖化和发酵同步 进行的工艺而言，要求尽量提高发酵温度，使之与糖化温度匹配，具有高温发酵 能力的菌株更具工业应用潜力。

发明内容：

本发明的目的在于提供一株耐高温的Spathaspora passalidarum突变株及其 利用木糖发酵生产乙醇的方法。

以Spathaspora passalidarum NRRL Y-27907为出发菌株进行紫外诱变，诱变 后利用试管进行初筛，摇瓶发酵进行复筛，得到一株酒精耐受性及温度耐受性均 优于原始菌株的突变株U-30。

所述Spathaspora passalidarum突变株是由Spathaspora passalidarum NRRL  Y-27907为出发菌株经紫外诱变筛选后获得，具体为Spathaspora passalidarum  U-30，该菌株已于2014年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)， 保藏编号为CGMCC No:9863。

所述菌株在37℃下摇瓶发酵的乙醇产量比原始菌株提高了36.5％，其温度耐 受性提高到41℃，乙醇耐受性提高到12％。

所述菌株最适生长温度为28℃，pH为5.5。

所述菌株发酵木糖产乙醇的方法如下：

(1)种子液的获得：从斜面挑一环菌到至YPD液体培养基，30℃，180rpm 培养12h，从一级培养基中按照1％的接种量相同条件下培养至对数生长中后期 为备用种子液。

(2)摇瓶发酵培养或发酵罐发酵培养：

发酵培养基：木糖60～100g/L，玉米浆15～25g/L，磷酸二氢钾2.5g/L， 七水硫酸镁0.1g/L，pH4.5～5.5.

摇瓶发酵条件：接种量5～10％，温度30℃，摇床转速120～150rpm,装液量 80～120/250mL。

发酵罐发酵条件：接种量5～10％，温度30℃，转速120～300rpm，装液量 50～80％，通气量0.02～0.05v/v·min。

有益效果：

1、和原始菌株相比，在杜氏管试验中，原菌在40℃基本已不再产气，而U-30 在40℃产气速度较快，在41℃条件下仍能够产气，可见U-30比原菌耐高温能力 强。原菌在乙醇浓度为10％时能够产气，但当乙醇浓度为12％时就不再发酵产 气；U-30在乙醇浓度达到12％时，仍能产气。可见，U-30比原菌的乙醇耐受性 强。

2、突变株U-30在高温条件下乙醇发酵性能显著提高，在37℃下摇瓶发酵的乙 醇产量为16.45g/L,比原始菌株提高了36.5％；突变株在30℃，摇瓶发酵条件下 发酵5天，乙醇浓度达到39.04g/L，乙醇得率为0.39g/g，木糖利用率为100％， 生产速率为0.325g/L·h，而原菌的乙醇得率为0.30g/g，和原菌相比提高了30％； 突变株在30℃，5L发酵罐中，发酵时间缩短为72h，木糖利用率100％，乙醇浓 度达到39.875g/L，乙醇得率为0.40g/g，达到理论得率的87％，生产速率达到0.553 g/L·h，原菌的乙醇得率为0.32g/g。可见，突变株无论是在高温、低温、摇瓶或 发酵罐利用木糖发酵产乙醇过程中的性能均优于原始菌株。

附图说明：

图1 U-30和原菌在5L发酵罐中的木糖消耗；

图2 U-30和原菌在5L发酵罐中的乙醇产量。

具体实施方式：

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术 手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而 非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域 技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料 成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1：Spathaspora passalidarumU-30突变菌株筛选

1.以Spathaspora passalidarum NRRL Y-27907为出发菌株，紫外条件下，20W， 照射20s，取诱变后的菌液1mL转接于木糖浓度为2％的YPX液体培养基，40℃ 避光培养24h后转接于新鲜的2％YPX液体培养基，24h后再转接于新鲜2％YPX 液体培养基，直到OD₆₂₀值不再发生变化。取该菌液稀释后均匀涂布于木糖平板 上，30℃避光培养1-2d后挑取突变株。

2％的YPX培养基：木糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，pH自然。

木糖平板：木糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，琼脂2％，pH自然。

2.对1中获得的突变株进行木糖培养基试管发酵，30℃，180r/min下培养5d， 离心，DNS法测定上清液中木糖的含量，初筛出木糖利用能力比出发菌株强的 突变株。

3.对2中获得的突变株进行摇瓶发酵，发酵培养基为：100g/L木糖，20g/L蛋白 胨，10g/L酵母浸粉，pH自然。发酵条件为：装液量100mL，接种量5％，37℃， 100rpm发酵5天。离心，高效液相色谱测定上清液中乙醇的含量，复筛出乙醇 高产菌株U-30。乙醇产量较出发菌株有大幅提升，发酵结果见表1。

表1突变菌株U-30与出发菌株乙醇生成量比较

实施例2：30℃下利用木糖摇瓶发酵产乙醇

以U-30和原始菌株互为对照，进行乙醇发酵实验

(1)种子液的获得：各从斜面挑一环菌到50mLYPD液体培养基，30℃， 180rpm培养12h，从一级培养基中按照1％的接种量到50mLYPD液体培养 基的250mL摇瓶中，相同条件下培养至对数生长中后期为备用种子。

(2)发酵培养基组成成分：木糖100g/L，玉米浆15g/L，磷酸氢二钾2.5g/L， 七水硫酸镁0.1g/L，pH5.5。

(3)发酵条件：接种量为7％，发酵时摇床转速为120rpm，发酵时装液量为100mL。

(4)发酵5天，取上清利用高效液相法检测发酵液中的木糖以及乙醇浓度。

结果表明，U-30发酵5天后乙醇浓度达到39.04g/L，乙醇得率为0.39g/g， 木糖利用率为100％，生产速率为0.325g/L·h，而原菌发酵5天后乙醇浓度为 30.43g/L，木糖剩余18.72g/L，乙醇得率为0.30g/g，和原菌相比，U-30的乙醇得 率提高了30％。

实施例3：30℃5L发酵罐发酵产乙醇

以U-30和原始菌株互为对照，利用5L发酵罐扩大培养进行乙醇发酵实验。

发酵培养基为：木糖100g/L，玉米浆15g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，七水硫酸 镁0.1g/L，pH5.5。

发酵条件为：接种量7％，温度30℃，转速150rpm，通气量0.1L/min。

结果如附图1、图2，可以看出，在5L发酵罐中，U-30的发酵时间比在摇 瓶中明显缩短，发酵周期为72h，木糖全部利用完，而且乙醇产量也达到 39.857g/L，达到理论产量的86.6％。原菌到84h仍有部分糖没有利用完全，乙 醇产量也只达到32.73g/L，继续延长发酵时间木糖基本不消耗，乙醇浓度反而 有所下降。

实施例4：乙醇耐受性比较

(1)将原菌和U-30分别接入到5mLYEPD液体试管中，30℃，180rpm培养过 夜，作为备用种子液。

(2)在倒置放有杜氏管的无菌试管中分别按照表1中的要求加入各种成分， 取1mL种子液于试管中，轻轻振荡混匀。在30℃下静置培养，每24h观察产气 并记录，结果见表2。

表1

酒精浓度(％，v/v) 2 4 6 8 10 12 15°Brix浓麦汁(ml) 4 4 4 4 4 4 无水乙醇(ml) 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 水(ml) 4.8 4.6 4.4 4.2 4 3.8 种子(ml) 1 1 1 1 1 1

表2

注：“—”代表不产气，“+”代表产气，“+”的多少表示不同的产气量，“++++”表示气泡 充满。

从表2中可以看出，原菌在乙醇浓度为10％时能够发酵产气，但当乙醇浓度 为12％时就不再发酵产气；U-30在乙醇浓度达到12％时，仍能产气。可见，U-30 比原菌的乙醇耐受性强。

实施例5：温度耐受性比较

(1)将原菌和U-30分别接入到5mLYEPD液体试管中，30℃，180rpm培养 过夜，作为备用种子液。

(2)在倒放有杜氏管的无菌试管中分别加入4mL15°Brix浓麦汁、5mL无 菌水和1mL种子液于试管中，轻轻振荡混匀，分别在30℃、35℃、37℃、39℃、 40℃、41℃下静置培养，每12h观察产气并记录，结果见表3。

表3

注：“—”代表不产气，“+”代表产气，“+”的多少表示不同的产气量，“++++”表示气泡 充满。

从表3中可以看出，原菌在40℃基本已不再产气，而U-30在40℃产气速 度较快，在41℃条件下仍能够发酵产气。可见U-30比原菌耐温性强。