一种可同时降解毒死蜱和萘的施氏假单胞菌

摘要

本发明提供了一种能够同时降解毒死蜱和萘的施氏假单胞菌，该菌株命名为YC-YH1，保藏编号为CGMCC No.9624。该菌能够在4天内将无机盐培养基中同时含有的100mg/L浓度毒死蜱和100mg/L浓度萘的混合物同时100％降解。本发明的施氏假单胞菌株YC-YH1能够应用于毒死蜱或萘污染环境及二者共同污染环境的生物修复，具有较好的经济价值和应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物及生物降解领域，具体地，涉及一种施氏假 单胞菌(Pseudomonas stutzeri)YC-YH1及其应用。

背景技术

毒死蜱(chlorpyrifos)，化学名称：O,O-二乙基-O-(3,5,6-三氯-2- 吡啶基)硫逐磷酸酯，是美国陶氏化学公司于1965年开发并研制出 来的一种广谱性有机磷酸酯类杀虫剂，广泛应用于叶菜类和瓜果类 蔬菜的病虫害防治，是目前全球使用最广泛的5种杀虫剂之一。随 着毒死蜱在我国产销量的逐年增加和使用范围的不断扩大，必然对 出口农产品的产生不利影响，危害人畜健康，并对水、土壤等环境 带来严重污染。因此，如何有效地处理毒死蜱的毒性和残留带来的 污染，成为人们亟待解决的问题。

萘(naphthalene)是一种结构最简单的、具有两个苯环的多环芳烃 (Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs)，是美国环保署鉴定的 优先控制的16种PAHs污染物之一，在环境中普遍存在，常用做研 究PAHs环境降解的模式化合物。萘具有较低的水溶性和较高的固 液分配系数，这使得它能够抵抗微生物的利用且促进其在土壤中的 浓度的增加。随着石油工业和消耗的增加，环境中PAHs的浓度逐 渐增加，对人类健康造成了严重威胁。

施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)是一种普遍存在的具有较 高遗传适应性的细菌，它存在于很多不同的环境中。根据国内外文 献报道，该菌株能够降解多种外源物质，如苯甲酸、苯磺酸、萘、 甲酚、菲、二甲酚、芘等，该种菌具有用于生物修复的潜力。目前 尚未见有对毒死蜱和萘两种不同物质同时具有降解作用或相关作用 的报道。

近几十年来，人们对单一污染物的生物降解进行了相当详细的 研究，并取得了许多相应的成果。事实上，在自然界中绝对意义的 单一污染是不存在的，污染多有伴生性和综合性的特点，所以单个 污染物的生物降解研究虽具有一定的参考意义，但尚不能完全解决 污染问题。在土壤及水环境的微生物生物修复实际应用中，要考虑 到所选菌株本身所具有的对多种化合物共同降解的能力，这样既能 实现生物修复的高效率，同时也能降低经济成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一株能够同时降解毒死蜱和萘的施氏假 单胞菌。

本发明从活性污泥中分离到一株能够同时降解毒死蜱和萘的菌 株。活性污泥样品采集于农药厂的排污口(河北邢台)。在无菌操作 条件下，将3～5g活性污泥样品接种到用含毒死蜱浓度为100mg/L的无 机盐培养中，在25～35℃，150～200rpm条件下培养，每培养6～10天后， 取培养体积的10％～15％转接至新鲜无机盐培养基中，且每次将毒死 蜱农药浓度提高100mg/L，连续转接5～8次，直至无机盐培养基中农 药浓度提高到500～800mg/L。用无菌水将驯化后的菌液梯度稀释10^-5、 10^-6、10^-7后分别涂布到含有200mg/L毒死蜱的无机盐培养基平板上， 30℃培养箱中培养6～10天。挑取在平板上的单菌落进行划线后培养， 重复三次，直至分离获得纯化的菌株。选择在含农药培养基上生长好、 传代稳定且降解能力较好的菌株进行斜面保存。

通过菌株形态学特征，生理生化特征和16S rRNA序列分析将该 菌株鉴定为施氏假单胞菌，命名为YC-YH1，该菌株于2014年8月29 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生 物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.9624，分类名为施 氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri。

本发明提供的施氏假单胞菌YC-YH1革兰氏染色为阴性杆菌，菌 体细长、直或微弯，无芽孢，在LB培养基上菌落为淡黄色，干燥， 扁平，边缘不整，不透明，表面粗糙，有折皱；培养48h后，菌落会 粘附于培养基上。LB培养基上菌落形态见图1。

本发明提供了含有施氏假单胞菌YC-YH1的菌剂。

本发明提供了含有施氏假单胞菌YC-YH1的生物清洁剂。

本发明提供了施氏假单胞菌YC-YH1或含有其的菌剂或含有其 的生物清洁剂在清洁环境中的应用。

进一步，本发明提供了施氏假单胞菌YC-YH1或含有其的菌剂 或含有其的生物清洁剂在降解污染物中的应用。

所述的污染物为毒死蜱和/或萘。

本发明提供了施氏假单胞菌YC-YH1在制备生物清洁剂中的应 用。

本发明提供了施氏假单胞菌YC-YH1在制备生物降解剂中的应 用。

本发明的施氏假单胞菌YC-YH1能够在4天内100％降解无机盐 培养基中含有的浓度为100mg/L萘，在5天内分别100％降解无机 盐培养基中单独含有的浓度为100mg/L的毒死蜱和甲基对硫磷，在 7天内对无机盐培养基中单独含有的浓度为100mg/L的三唑磷、氯 氰菊酯、三氟氯氰菊酯、菲和芴的降解率分别为57％、48％、39％、 62％和37％。

另外，本发明的施氏假单胞菌YC-YH1可在4天内100％降解无 机盐培养基中同时含有的浓度为100mg/L的毒死蜱和100mg/L的 萘的混合污染物，菌株YC-YH1对萘的降解促进了其对毒死蜱的降 解速率。本发明提供的施氏假单胞菌YC-YH1及其菌剂在使用过程 中无污染，无公害，能够应用于毒死蜱或萘污染环境及二者共同污 染环境的生物修复，可广泛应用于环境清洁领域，具有较好的经济 价值和应用前景。

附图说明

图1为本发明施氏假单胞菌YC-YH1在LB固体培养基上的菌落形 态。

图2为施氏假单胞菌YC-YH1的系统发育树。

图3为HPLC法检测同时含100mg/L毒死蜱和100mg/L萘的 混合物的色谱图。

图4为标准曲线图，其中图4A为萘的标准曲线图，图4B毒死 蜱的标准曲线图。

图5为施氏假单胞菌YC-YH1在无机盐培养基中同时降解100 mg/L毒死蜱和100mg/L萘的混合物的降解图。

图6为毒死蜱代谢产物的LC-MS检测扫描图谱。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在 不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所 作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂， 实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本申请使用的无机盐培养基具有以下组成：1.0g/L NH₄NO₃,0.5 g/L NaCl,0.5g/L(NH₄)₂SO₄,0.5g/L KH₂PO₄,1.5g/L K₂HPO₄和0.005 g/L酵母提取物，pH＝7.0±0.2。

斜面培养基：10.0g/L蛋白胨，5.0g/L NaCl，10.0g/L酵母提取 物，pH＝7.0±0.2。

平板培养基为相应的培养基中加入1.5％的琼脂。

实施例1施氏假单胞菌YC-YH1的分离和鉴定

1、菌株的分离

活性污泥样品采集于农药厂的排污口(河北邢台)。在无菌操作 条件下，将5g活性污泥样品接种到用含毒死蜱浓度为100mg/L的 无机盐培养基中，在30℃，180rpm条件下培养，每培养7天后，取 培养体积的10％转接至新鲜无机盐培养基中，且每次将毒死蜱农药 浓度提高100mg/L，连续转接8次，直至无机盐培养基中农药浓度 提高到800mg/L。

用无菌水将驯化后的菌液梯度稀释10^-5、10^-6、10^-7后分别涂布 到含有200mg/L毒死蜱的无机盐培养基平板上，30℃培养箱中培养 7天。挑取在平板上的单菌落进行划线后培养，重复三次，直至分离 获得纯化的菌株。在含浓度为200mg/L毒死蜱的无机盐培养基平板 上生长好、传代稳定且降解能力较好的菌株进行斜面保存。菌株命 名为YC-YH1。

2、菌株的形态学特征

该菌为革兰氏染色为阴性杆菌，菌体细长、直或微弯，无芽孢， 在LB培养基上菌落为淡黄色，干燥，扁平，边缘不整，不透明，表 面粗糙，有折皱；培养48h后，菌落会粘附于培养基上，见图1。

3、菌株生理生化特性

表1生化反应表

4、16S rDNA鉴定

将菌株YC-YH1接种到LB培养基中，30℃、180rpm条件下过 夜培养，取1ml菌液，离心收集沉淀，用细菌基因组提取试剂盒提 取基因组DNA，得到的基因DNA用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行检测， -20℃保存备用。

设计用于扩增16s rDNA序列的一对通用引物：27F 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R 5'-GGTTACCTTGTTACG ACTT-3'，用基因组DNA作为模板，加入 Premix TaqTM，进行PCR扩增，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检 测后，用DNA纯化回收试剂盒纯化，连接到pGM-T载体上，转化 至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布到含有氨苄青霉素的LB固体 培养基平板上，在37℃下培养12h，挑取白色菌落至液体LB培养 基中，37℃、180rpm振荡培养过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒， 送交上海生工生物公司进行测序。该菌株的16S rDNA序列全长为 1497 bp，将该序列在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上 进行Blast比对分析，并利用MEGA 6.0软件构建系统发育树可知， 菌株YC-YH1为施氏假单胞菌，与目前已发表的施氏假单胞菌序列 相似性达98％，见图2。

综合菌体形态、生理生化特性和16S rDNA基因序列，该菌株 YC-YH1于2014年8月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为 CGMCC No.9624，分类名为施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri。

实施例2施氏假单胞菌YC-YH1的降解性能试验

高效液相色谱法检测施氏假单胞菌YC-YH1对无机盐培养基中毒 死蜱和萘的同时降解作用

将菌株YC-YH1接种到液体LB培养基中活化，培养到对数生长期 OD₆₀₀＝0.6，按照体积比10％的接种量接种到同时含有100mg/L毒死蜱 和100mg/L萘的无机盐培养基中，30℃，180rpm摇床振荡避光培养。

以未接种菌株的同时含有100mg/L毒死蜱和100mg/L萘的无机 盐培养基作为对照组，同样在30℃下，180rpm摇床振荡避光培养。每 天定时取样一次，每次实验各重复三次。

培养液中毒死蜱和萘同时提取的方法：

定时取样后，在样品中加入等体积正己烷，超声波充分振荡抽提 10min，静置1小时，取上层有机溶剂，将有机溶剂挥发干后，用等体 积的甲醇重溶，然后用0.22μm的有机系滤膜过滤，进行HPLC-UV分 析。

HPLC-UV分析条件为：Agilent 1200高效液相色谱仪，色谱柱： Eclipse-C18(150×4.6mm×5μm)，流动相为甲醇:水＝80:20(v/v)，进样 量10μL，流速1.0mL/min，使用DAD检测器进行检测，检测波长为300 nm，在液相色谱检测图中，第一个峰代表的是萘，保留时间为 4.330min，第二个峰代表的是毒死蜱，保留时间为10.073min，当萘和 毒死蜱的浓度都分别为100mg/L时，萘的峰面积为112.97mAU·S，同 时毒死蜱的峰面积为248.80mAU·S,见图3。

降解率的计算：首先用HPLC-UV法测定浓度为0～100mg/L的毒死 蜱和萘，根据浓度与液相色谱峰面积之间的关系分别绘制毒死蜱和萘 的标准曲线，见图4A和图4B。根据标准曲线计算出毒死蜱和萘在无 机盐培养基中每天的残留浓度，再根据降解率计算公式得到毒死蜱和 萘的降解率。

降解率％＝(毒死蜱/萘的初始浓度-毒死蜱/萘某时刻的残留浓度) /毒死蜱/萘的初始浓度×100％

毒死蜱和萘的初始浓度均为100mg/L，培养4天后，接种YC-YH1 菌株的培养基中毒死蜱的残留浓度为0mg/L，萘的残留浓度也为0 mg/L，而未接种菌株的培养基中毒死蜱的残留浓度为95mg/L，萘的 残留浓度为87mg/L。

计算4天后接种菌株的无机盐培养基中毒死蜱和萘的降解率：

毒死蜱降解率％＝(100mg/L-0mg/L)/100mg/L×100％

＝100％

萘降解率％＝(100mg/L-0mg/L)/100mg/L×100％

＝100％

计算4天后未接种菌株的对照组无机盐培养基中毒死蜱和萘的降 解率分别为：5％和13％。

根据处理组及对照组中毒死蜱和萘的残留浓度与时间的关系绘 制降解曲线图，见图5。

培养液中菌株生长曲线的测定方法：定时取样的样品用分光光度 计在600nm波长下测定其在无机盐培养基中每天的吸光度，根据吸光 度值(OD₆₀₀)和时间绘制其生长曲线，见图5。从图5中可以看出， 接种菌株培养1天后，萘的残留浓度为48.5mg/L，毒死蜱的残留浓度 为70.6mg/L，而菌株生长不明显，其OD₆₀₀＝0.21，位于迟缓期；培养 2天后，萘的残留浓度为19.3mg/L，毒死蜱的残留浓度为31.2mg/L， 菌株生长的OD₆₀₀＝0.55，位于对数期；培养3天后，萘的残留浓度为 4.1mg/L，毒死蜱的残留浓度为10.8mg/L，菌株生长的OD₆₀₀＝1.02， 位于对数期；培养4天后，萘的残留浓度为0mg/L，毒死蜱的残留浓 度为0mg/L，此时二者的降解率均为100％，同时菌株生长的 OD₆₀₀＝1.36，进入稳定期；培养5天后，萘和毒死蜱的浓度仍为0mg/L， 菌株生长的OD₆₀₀＝1.41，开始进入衰亡期。未接种菌株的对照组无机 盐培养基中，培养4天后，毒死蜱和萘的降解率分别为：5％和13％。 该结果说明菌株YC-YH1能够在无机盐培养基中显著的同时降解萘和 毒死蜱，而且与单独含有毒死蜱的培养基相比，菌株YC-YH1对萘的 降解能够加快其对毒死蜱的降解效率。菌株YC-YH1对萘和毒死蜱的 混合污染物具有良好的耐受性及降解能力，使其具有能够用于毒死蜱 及萘污染位点生物修复的潜力。

2、施氏假单胞菌YC-YH1降解底物谱的检测

将菌株YC-YH1接种到液体LB培养基中活化，培养到对数生长期 OD₆₀₀＝0.6，按照体积比10％的接种量接种到分别单独含有100mg/L毒 死蜱、甲基对硫磷、三唑磷、氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯、萘、菲和芴 的无机盐培养基中。在30℃下，180rpm摇床振荡避光培养。每天取样 一次，共培养7天，检测各种化合物的残留浓度，计算其降解率。

培养液中各种化合物的提取方法：取样后，在样品中加入等体积 正己烷，超声波充分振荡抽提10min，静置1小时，取上层有机溶剂， 将有机溶剂挥发干后，用等体积的甲醇重溶，然后用0.22μm的有机系 滤膜过滤，进行HPLC-UV分析。

经测定，培养4天后，萘都被100％降解；培养5天后，毒死蜱、 甲基对硫磷被100％降解；培养7天后，三唑磷、氯氰菊酯、三氟氯氰 菊酯、菲和芴的降解率分别为57％、48％、39％、62％和37％。结果表 明施氏假单胞菌YC-YH1具有较宽的降解底物谱。

实施例3液质联用法(LC-MS)检测施氏假单胞菌YC-YH1降解 毒死蜱的代谢产物

1、毒死蜱代谢产物的提取

将菌株YC-YH1接种到液体LB培养基中活化，培养到对数生长期 OD₆₀₀＝0.6，按照体积比10％的接种量接种到含有100mg/L毒死蜱的无 机盐培养基中，在30℃下，180rpm摇床振荡避光培养。

培养1天后，将培养物放入离心管中，4000rpm离心10min，收集 上清液，去除菌体沉淀。在上清液中加入过量的氯化钠，制成氯化钠 的饱和溶液，再加入浓度为2M的盐酸，将其pH值调为2.0。然后在溶 液中加入等体积的乙酸乙酯，剧烈震荡10min，室温静置1小时，将水 相和有机相进行分离，弃去水相。将乙酸乙酯有机相在旋转蒸发仪中 进行挥发干燥，然后用色谱纯的甲醇重溶。

2、毒死蜱代谢产物的液质检测

用液质联用系统检测代谢产物组分，所用仪器为一台二元泵液相 色谱Agilent 1260连接一台三重四级杆质谱仪Agilent QQQ 6420，使 用电喷雾离子源(electrospray ionization，ESI)，在负离子模式下进行 母离子扫描检测。高效液相色谱以100％甲醇为流动相，流速为0.2 mL/min，进样体积为1μL，直接注入质谱仪中。质谱仪的毛细管电压 和碎裂电压分别设置为3500V和150V，源温度和去溶剂化温度分别设 为150℃和350℃，离子扫描范围设为80至400Da。使用软件Agilent  MassHunter收集和分析数据。

毒死蜱代谢产物的LC-MS检测结果表明，在负离子模式下有四种 母离子被检测到。其中质荷比m/z＝197.90[M-H]^ˉ的峰鉴定为三氯吡 啶酚(3,5,6-trichloro-2-pyridyl，TCP),质荷比m/z＝169.00[M-H]^ˉ的峰鉴定为二乙基硫代磷酸酯(diethylthiophosphate，DETP),质荷 比m/z＝153.00[M-H]^ˉ的峰鉴定为磷酸二乙酯(diethylphosphate，DEP), 质荷比m/z＝125.00[M-H]^ˉ的峰鉴定为磷酸单乙酯(monoethyl  phosphate，MEP)，见图6。这表明施氏假单胞菌YC-YH1可以将毒 死蜱降解为三氯吡啶酚和二乙基硫代磷酸酯，并将二乙基硫代磷酸酯 进一步彻底降解。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了 详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这 对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神 的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。