施氏假单胞菌ZH-1对毒死蜱的降解初探

摘要

近年来生态环境的破坏，导致农作物病虫害频繁发生，进而降低农作物产量。为减少病虫害，提高农作物产量，人们通常选择喷洒农药。由于有机磷农药在虫灾防治方面，具有高效、低成本、易操作等特点，所以一直是国内外农业生产中高生产、多使用的农药品种。有机磷农药毒性大，进入体内能抑制乙酰胆碱酯酶，从而造成体内乙酰胆碱累积，引起神经功能紊乱，严重时可因脑水肿、肺水肿、呼吸麻痹而死亡。因此，如何降解环境中的有机磷农药已成为人们关注的热点。本课题以汾河淤泥中分离出来的施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）ZH-1为研究对象，研究该菌对不同有机磷农药的降解、降解毒死蜱条件的优化、对毒死蜱降解特性、降解酶定位以及毒死蜱在模拟土壤中降解。 1.选取毒死蜱、敌敌畏、马拉硫磷、氧乐果和敌百虫等5种有机磷农药，研究P.stutzeri ZH-1对这5种有机磷农药的降解能力，结果表明该菌对这5种有机磷农药的降解率均达到50%以上（在第10d时），其中对毒死蜱的降解率高达92.48%（在第5d时）。因此，选择毒死蜱为后续研究材料。 2.通过温度、转速、接种量、pH四个因素对P.stutzeri ZH-1降解毒死蜱的单因素分析和响应面优化，结果表明当温度为36.7℃，转速为130.00rpm，接种量为7%，pH值为7.0时，在第5d毒死蜱的降解率达到了96.48%。 3.通过添加碳源、氮源、金属离子、抗生素以及不同浓度的NaCl对P.stutzeri ZH-1降解毒死蜱的影响，结果表明，当分别添加1.0%葡萄糖、0.05%氯化铵、10-4mol/L铜离子、0.5%氯化钠时，该菌对毒死蜱的降解率均达到了96%以上，当添加阿莫西林的浓度为160ug/mL时，毒死蜱的降解率仅为53.23%。 4.通过提取胞内和胞外粗酶液对毒死蜱进行降解，结果发现胞内和胞外粗酶液对毒死蜱的降解率分别为83.58%和14.41%，反映出降解酶主要存在于细胞内。P.stutzeri ZH-1在模拟土壤（灭菌和未灭菌）中对毒死蜱的降解结果表明，该菌对灭菌和未灭菌土壤中毒死蜱的降解率分别为70.79%和90.07%。当毒死蜱浓度为1000mg/L时，该菌对它的降解率为77.66%，说明P.stutzeri ZH-1具有较强的耐受性。 有机磷农药残留对环境和人的影响越来越严重，利用微生物对其进行降解，不会对环境造成二次污染，降解产物磷酸盐还可以被植物作为养分吸收利用。因此，利用微生物对有机磷农药以及其它有机污染物进行降解，是环境保护和农业生产的一大进步。本研究旨在为P.stutzeri ZH-1在农业生产中的应用提供理论依据和指导。

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Abstract

1 引言

1.1 有机磷农药的概述

1.1.1有机磷农药使用的现状

1.1.2有机磷农药的危害

1.1.3常见几种有机磷农药的简介

1.2有机磷农药的降解方式

1.2.1物理降解

1.2.2化学降解

1.2.3生物降解

1.3微生物降解有机磷农药的技术研究

1.3.1酶降解法

1.3.2基因工程技术

1.3.3固定化微生物技术

1.3.4多菌株复合体系

1.4微生物降解有机磷农药的展望

1.5研究的内容

1.6本课题研究的目的和意义

2 P. stutzeri ZH-1高效降解有机磷农药的选择

2.1.1菌种来源

2.1.2 有机磷农药

2.1.3 主要仪器

2.1.4 培养基

2.1.5 溶液的配制

2.2 实验方法

2.2.1 菌种的活化与种子液的制备

2.2.2 有机磷农药吸收光谱的测定

2.2.3 有机磷农药标准曲线的制作

2.2.4 菌株ZH-1降解有机磷农药的定性检测

2.2.5 菌株ZH-1降解有机磷农药的定量测定

2.2.6 培养液中有机磷农药的提取和检测

2.2.7 有机磷农药降解率的计算

2.2.8 数据处理

2.3 结果与讨论

2.3.1 有机磷农药检测波长的确定

2.3.2 有机磷农药液相色谱标准曲线

2.3.3 菌株ZH-1对有机磷农药降解的定性分析

2.3.4 菌株ZH-1降解有机磷农药的能力

2.4 本章小结

3 P. stutzeri ZH-1降解毒死蜱条件的优化

3.1.1 菌株来源

3.1.2 培养基

3.1.3 主要仪器

3.2 实验方法

3.2.1 单因素试验

3.2.2响应面优化

3.2.3 生物量的检测

3.2.4 毒死蜱的检测

3.2.5 数据处理

3.3 结果与讨论

3.3.1 温度对P. stutzeri ZH-1降解毒死蜱的影响

3.3.2 转速对P. stutzeri ZH-1降解毒死蜱的影响

3.3.3 接种量对P. stutzeri ZH-1降解毒死蜱的影响

3.3.4 pH对P. stutzeri ZH-1降解毒死蜱的影响

3.3.5 P. stutzeri ZH-1降解毒死蜱条件的响应面优化

3.4 本章小结

4 P. stutzeri ZH-1对毒死蜱降解特性的研究

4.1.1 菌株来源

4.1.2 培养基

4.1.3 主要仪器

4.2 实验方法

4.2.1 最佳碳源的选择

4.2.2 最佳氮源的选择

4.2.3 金属离子的选择

4.2.4 抗生素的选择

4.2.5 最佳NaCl浓度的选择

4.2.6 生物量的检测

4.2.7 毒死蜱的检测

4.3 结果与讨论

4.3.1 碳源对P. stutzeri ZH-1降解毒死蜱的影响

4.3.2 氮源对P. stutzeri ZH-1降解毒死蜱的影响

4.3.3 金属离子对P. stutzeri ZH-1降解毒死蜱的影响

4.3.4 抗生素对菌株ZH-1降解毒死蜱的影响

4.3.5 NaCl对P. stutzeri ZH-1降解毒死蜱的影响

4.4 本章小结

5 降解酶的定位及毒死蜱在模拟土壤中的降解

5.1.1 菌种来源

5.1.2 培养基

5.1.3 主要仪器

5.2 实验方法

5.2.1 粗酶液的提取

5.2.2 P. stutzeri ZH-1在模拟土壤中对毒死蜱降解的测定

5.2.3 P. stutzeri ZH-1对毒死蜱耐受性的测定

5.2.4 生物量的测定

5.2.5 毒死蜱的检测

5.3 结果与讨论

5.3.1 P. stutzeri ZH-1降解酶的定位

5.3.2 P. stutzeri ZH-1在模拟土壤中对毒死蜱降解的能力

5.3.3 底物浓度对P. stutzeri ZH-1降解毒死蜱的影响

5.4 本章小结

讨 论

结 论

参考文献

在学期间的研究成果

致 谢