一种乙酰胆碱在提高微藻多不饱和脂肪酸以及α-亚麻酸积累中的应用

摘要

一种乙酰胆碱在提高微藻多不饱和脂肪酸以及α-亚麻酸积累中的应用，本发明公开了一种在微藻生长的过程中添加乙酰胆碱以提高微藻油脂中多不饱和脂肪酸以及α-亚麻酸含量的方法，属于微藻生物技术领域。具体操作步骤为：(1)在微藻生长的不同时期，添加不同浓度的神经递质乙酰胆碱；(2)分析不同浓度和不同时期加入的神经递质乙酰胆碱对微藻油脂中多不饱和脂肪酸以及α-亚麻酸含量的影响。本发明首次提出在微藻的生长过程中添加神经递质乙酰胆碱提高微藻油脂中多不饱和脂肪酸以及α-亚麻酸的含量，为使用化学方法促进微藻油脂中多不饱和脂肪酸以及α-亚麻酸积累提供了一条新思路。

说明书

技术领域

本发明属于微藻生物培养技术领域，具体涉及一种乙酰胆碱在提高微藻多不饱和脂 肪酸以及α-亚麻酸积累中的应用。

背景技术

多不饱和脂肪酸(PUFA_S)是指含有两个或两个以上双键，且碳链长度为18-22个 碳原子的直链脂肪酸，根据PUFA_S中第一个不饱和键出现在碳链甲基端的位置，可以主 要分为3类：n-3(或ω-3)PUFA_S，以DHA(C22：6n-3)、EPA(C20:5n-3)和α-亚麻酸(C18:3 n-3)为代表；n-6(或ω-6)PUFA_S，如花生四烯酸(C20:4n-6)和γ-亚麻酸(C18:3n-6)；第 3种n-9类PUFA_S。其中ω-3多不饱和脂肪酸在营养和医学上都具有很重要的作用：α- 亚麻酸具有调节血脂、预防心肌梗塞和脑梗塞、降低血粘度、抗炎、保护视力、增加智 力等作用；EPA具有增进血液循环，提高组织供氧而消除疲劳、防止脂肪在血管壁的沉 积、预防动脉粥样硬化的形成和发展、预防脑血栓、脑溢血、高血压等心血管疾病等作 用；DHA具有增进大脑发育、减少产后忧郁症、治疗癌症等作用，是人类及动物生长 所必需的营养物质。

目前关于α-亚麻酸生产的专利主要集中于利用各种陆生植物为原料来生产，生产 DHA和EPA生产的专利主要集中在以鱼油为原料进行生产，而以这些传统的物质作为 PUFAS的原料会造成与粮争地、供不应求等问题。因此我们需要寻找一种新的原料。

微藻生长速度快，PUFA_S含量高；细胞结构简单，其生物化学成分受培养盐组成和 环境条件改变的影响较大，如氮缺乏容易刺激微藻的油脂尤其是三酰甘油的积累、温度 降低会促进微藻多不饱和脂肪酸的积累等，可以通过改变外界环境促进微藻PUFA_S的积 累；容易利用光反应器进行大规模生产；脂肪酸组成简单，PUFA_S的提纯工艺简单，是 非常良好的PUFA_S原料。

培养盐组成和环境条件对微藻油脂中多不饱和脂肪酸含量影响的研究较多，而植物 激素等活性分子的化学调节对微藻油脂中多不饱和脂肪酸含量影响的研究较少，从植物 激素对高等植物生长影响的研究结果中可以看出植物激素对高等植物的生长具有很强 的调节作用，因此研究其对微藻油脂中多不饱和脂肪酸含量影响，对于提高微藻油脂中 多不饱和脂肪酸含量具有重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种在微藻培养基中添加乙酰胆碱促进微藻多不 饱和脂肪酸和α-亚麻酸积累的方法。

为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：

乙酰胆碱在提高微藻α-亚麻酸积累中的应用在本发明的保护范围之内。

其中，在微藻的培养基中添加乙酰胆碱，添加时间为微藻生长的调整期、对数期、 稳定期中的任一时期。优选在微藻OD₆₈₀值为0～0.5时(调整期)添加乙酰胆碱，最优 选在微藻OD₆₈₀值为0时(调整期)添加乙酰胆碱；或者优选在微藻OD₆₈₀值为1.2～1.6 时(对数期)添加乙酰胆碱，最优选在微藻OD₆₈₀值为1.5时(对数期)添加乙酰胆碱； 或者优选在微藻OD₆₈₀值为2.5～3.0时(稳定期)添加乙酰胆碱，最优选在微藻OD₆₈₀值为2.5时(稳定期)添加乙酰胆碱。

其中，微藻生长的调整期乙酰胆碱添加量为0.1～10μg/L，优选为0.5～1μg/L；最优 选为1μg/L。

其中，微藻生长的对数期乙酰胆碱的添加量为0.1～10μg/L，优选为0.5～5μg/L；最 优选为5μg/L。

其中，微藻生长的稳定期乙酰胆碱的添加量为0.1～10μg/L，优选为0.25～1μg/L；最 优选为1μg/L。

其中，微藻培养的温度为25～30℃，优选为30℃。

其中，光照强度为2000～4000lux，优选为3000lux。

乙酰胆碱在提高微藻多不饱和脂肪酸积累中的应用在本发明的保护范围之内。

其中，在微藻的培养基中添加乙酰胆碱，添加时间为微藻生长的调整期、对数期、 稳定期中的任一时期。优选在微藻OD₆₈₀值为0～0.5时(调整期)添加乙酰胆碱，最优 选在微藻OD₆₈₀值为0时(调整期)添加乙酰胆碱；或者优选在微藻OD₆₈₀值为1.2～1.6 时(对数期)添加乙酰胆碱，最优选在微藻OD₆₈₀值为1.5时(对数期)添加乙酰胆碱； 或者优选在微藻OD₆₈₀值为2.5～3.0时(稳定期)添加乙酰胆碱，最优选在微藻OD₆₈₀值为2.5时(稳定期)添加乙酰胆碱。

其中，微藻生长的调整期乙酰胆碱的添加量为0.1～10μg/L，优选为0.25～5μg/L；最 优选为0.5μg/L。

其中，微藻生长的对数期乙酰胆碱的添加量为0.5～10μg/L，优选为1～10μg/L；最优 选为5μg/L。

其中，微藻生长的稳定期乙酰胆碱的添加量为0.1～10μg/L，优选为0.25～10μg/L； 最优选为1μg/L。

其中，微藻培养的温度为22～30℃，优选为30℃。

其中，光照强度为2000～4000lux，优选为3000lux。

乙酰胆碱在提高微藻多不饱和脂肪酸积累和微藻α-亚麻酸积累中的应用在本发明 的保护范围之内。

其中，在微藻的培养基中添加乙酰胆碱，添加时间为微藻生长的调整期、对数期、 稳定期中的任一时期。优选在微藻OD₆₈₀值为0～0.5时(调整期)添加乙酰胆碱，最优 选在微藻OD₆₈₀值为0时(调整期)添加乙酰胆碱；或者优选在微藻OD₆₈₀值为1.2～1.6 时(对数期)添加乙酰胆碱，最优选在微藻OD₆₈₀值为1.5时(对数期)添加乙酰胆碱； 或者优选在微藻OD₆₈₀值为2.5～3.0时(稳定期)添加乙酰胆碱，最优选在微藻OD₆₈₀值为2.5时(稳定期)添加乙酰胆碱。

其中，微藻生长的调整期乙酰胆碱的添加量为0.1～10μg/L，优选为0.25～5μg/L；最 优选为1μg/L。

其中，微藻生长的对数期乙酰胆碱的添加量为0.5～10μg/L，优选为1～10μg/L；最优 选为5μg/L。

其中，微藻生长的稳定期乙酰胆碱的添加量为0.1～10μg/L，优选为0.25～10μg/L； 最优选为1μg/L。

其中，微藻培养的温度为22～30℃，优选为30℃。

其中，光照强度为2000～4000lux，优选为3000lux。

本发明所述的调整期的定义为：当微生物进入到一个新的环境中，由于要适应这个 与它原来不同的生境条件，繁殖速度很慢，维持在一个较低的水平；调整期优选微藻 OD₆₈₀值为0～0.5范围内。

本发明所述的对数期的定义为：微生物适应了新的环境，开始大量快速繁殖，数量 快速增长，呈对数或指数曲线形状，也称指数期；对数期优选微藻OD₆₈₀值为1.2～1.6 范围内。

本发明所述的稳定期的定义为：微生物数量增长到了一定的程度，由于养分等的消 耗和有害代谢产物的积累使其数量不能再大量增长，增长数大致等于死亡数，处于动态 平衡时期；稳定期优选为微藻OD₆₈₀值在2.5～3.0范围内。

有益效果：

本发明具有如下显著特点和效果：

(1)本发明首次提出在微藻的生长过程中添加神经递质乙酰胆碱，为使用神经递 质乙酰胆碱以促进微藻油脂中多不饱和脂肪酸积累提供了一条新思路。

(2)通过补充微量的神经递质乙酰胆碱，促进了微藻油脂中多不饱和脂肪酸尤其 是α-亚麻酸的积累，其积累的量是未添加时的1.50±0.10倍，为利用神经递质乙酰胆碱 可以促进微藻油脂中多不饱和脂肪酸的积累提供了实验基础。

附图说明

图1在微藻生长的调整期，加入0.5μg/L的乙酰胆碱，小球藻中多不饱和脂肪酸的 变化。其中，横坐标为不同小球藻，依次是小麦根腐小球藻(C.sorokiniana)、凯斯勒 小球藻(C.kessleri)、普通小球藻(C.vulgaris)、原始小球藻(C.protothecoides)；纵坐 标为小球藻的多不饱和脂肪酸含量变化，数据为3次平行取样的平均值。

图2在微藻生长的调整期，加入0.5μg/L的乙酰胆碱，小球藻中α-亚麻酸的变化。 其中，横坐标为不同小球藻，依次是小麦根腐小球藻(C.sorokiniana)、凯斯勒小球藻 (C.kessleri)、普通小球藻(C.vulgaris)、原始小球藻(C.protothecoides)；纵坐标为小 球藻的α-亚麻酸含量变化，数据为3次平行取样的平均值。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的 本发明。

以下实施例中微藻按照以下方法培养：将新鲜微藻细胞按照5％的体积分数接种到 装有100ml新鲜的Tap培养基的250ml三角瓶中，静置培养，并在微藻生长的不同时期 添加乙酰胆碱，其间，每天摇动三角瓶3～5次，当微藻细胞增殖到最大密度的稳定期时 采收微藻细胞，藻液离心浓缩，用去离子水洗涤、离心，去除微藻细胞培养盐，制备成 无培养盐的湿藻，作为萃取油脂之用。

以下实施例中Tap培养基的配方(每升)如下：400.00mg NH₄Cl，50.00mg  CaCl₂·2H₂O，100.00mg MgSO₄·7H₂O，98.80mg Na₂HPO₄，61.73mg KH₂PO₄，50.00mg  Na₂EDTA·2H₂O，22.00mg ZnSO₄·7H₂O，11.40mg H₃BO₃，5.10mg MnCl₂·4H₂O，5.00mg  FeSO₄·7H₂O，1.60mg CoCl₂·6H₂O，1.16mg CuSO₄·5H₂O，1.10mg(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O， 2420.00mg Trisma Base，1ml Glacial Acetic。

以下实施例中藻油通过以下方法得到：向所得的1g微藻干品中加入5ml浓盐酸(质 量浓度36％-38％)，混匀，70℃水浴中放置20min，加入5ml无水乙醇，静置冷却后再 向体系中加入5mL的乙醚，振荡1min，4000rpm离心2min，获得上层乙醚相和下层沉 淀，将上层乙醚相移出，向下层沉淀中加入5mL的乙醚，振荡1min，4000rpm离心2min， 再将上层乙醚相移出，合并所有上层乙醚相，减压浓缩脱除溶剂，获得藻油。

以下实施例中藻油通过如下方法进行甲酯化，向所得到的藻油加入CHCl₃，将藻油 充分溶解，转入1.5ml Agillient玻璃瓶中，加入1ml 1mol/L的硫酸甲醇溶液，充N₂密 封，于100℃反应1h，自然冷却，加入200μL去离子水，混匀，用200μL正己烷萃取3 次，合并有机相，用200μL去离子水反萃取洗涤3次，取有机相，转入1.5ml Agillient玻 璃瓶中，N₂吹干，称重。

以下实施例中脂肪酸甲酯的定量分析条件如下：

采用Aglient公司生产的7890型气相色谱仪(GC)。

GC分析条件：DB-WAX毛细管色谱柱(30m×0.32mm×0.50μm)。柱升温程序： 从50℃升至200℃，保持5min；然后以10℃/min升至250℃，保持3min。载气： 氮气；流量：3ml/min。检测器：氢火焰检测器，氢气：30ml/min；空气：300ml/min。 进样口温度：280℃；检测器温度300℃。

实施例1：

特定培养基的制备，为了考察神经递质乙酰胆碱对小球藻油脂中多不饱和脂肪酸尤 其是α-亚麻酸的影响，我们配置的特定培养基是在基础Tap培养基中加入不同浓度的乙 酰胆碱，控制培养基中乙酰胆碱的浓度为0μg/L、0.125μg/L、0.25μg/L、0.5μg/L、1μg/L、 5μg/L、10μg/L。

在上述各组培养液中分别以体积分数5％的接种量接种新鲜的小球藻(小球藻为实 验室自行筛选)，在25℃，3000lux的恒温光照培养箱中培养至稳定期后，获得藻液。培 养过程中，每隔24h取藻液，于680nm下测定藻液的吸光度，得到小球藻的生长曲线。

将上述藻液离心浓缩，用去离子水洗涤、离心，去除微藻细胞培养盐，制备成无培 养盐的湿藻，作为萃取油脂之用。

小球藻生长调整期加入不同浓度乙酰胆碱对其油脂脂肪酸组成的影响见表1所示。 结果显示相对于对照组(乙酰胆碱的浓度为0μg/L)，在小球藻生长的调整期加入乙酰胆 碱能够明显提高小球藻油脂中多不饱和脂肪酸尤其是α-亚麻酸含量，小球藻油脂中多不 饱和脂肪酸尤其是α-亚麻酸含量的提高程度与乙酰胆碱的浓度有很大的关系，乙酰胆碱 浓度为0.5μg/L时，小球藻油脂中多不饱和脂肪酸尤其是α-亚麻酸含量都达到最高，分 别为对照组的1.18倍和1.61倍。

表1 小球藻生长调整期加入不同浓度乙酰胆碱对其油脂脂肪酸组成的影响

实施例2：

以与实例1相似的方法进行试验，除了培养初期不加入神经递质乙酰胆碱，培养 至微藻生长的对数初期再加入浓度为0μg/L、0.125μg/L、0.25μg/L、0.5μg/L、1μg/L、5μg/L、 10μg/L的乙酰胆碱之外，其他参数不变。

小球藻生长对数期加入不同浓度乙酰胆碱对其油脂脂肪酸组成的影响见表2所示。 结果显示相对于对照组(乙酰胆碱的浓度为0μg/L)，在小球藻生长的对数期加入乙酰胆 碱能够在一定程度上提高小球藻油脂中多不饱和脂肪酸尤其是α-亚麻酸的含量，但增加 的幅度略低于在小球藻生长的调整期加入不同浓度乙酰胆碱。随着乙酰胆碱浓度的提 高，小球藻藻油中多不饱和脂肪酸脂肪酸尤其是α-亚麻酸的含量呈现一个先增加后基本 保持不变的一个趋势，综合考虑乙酰胆碱加入成本以及其用量对小球藻藻油中多不饱和 脂肪酸脂肪酸尤其是α-亚麻酸含量的影响，选择乙酰胆碱浓度5μg/L，作为小球藻生长 和油脂积累的最适宜浓度，此时小球藻藻油中多不饱和脂肪酸尤其是α-亚麻酸的含量分 别为对照组的1.15倍和1.16倍。

表2 小球藻生长对数期加入不同浓度乙酰胆碱对其油脂脂肪酸组成的影响

对数期在小球藻的培养基中添加0.5μg/L的乙酰胆碱对不同种小球藻多不饱和脂肪 酸积累的影响见图1，对数期在小球藻的培养基中添加0.5μg/L的乙酰胆碱对不同种小 球藻α-亚麻酸积累的影响见图2。从图中可以看出，乙酰胆碱能够显著促进不同种小球 藻多不饱和脂肪酸和α-亚麻酸的积累。

实施例3

以与实例1相似的方法进行试验，除了培养初期不加入神经递质乙酰胆碱，培养至 微藻生长的稳定期再加入浓度为0μg/L、0.125μg/L、0.25μg/L、0.5μg/L、1μg/L、5μg/L、 10μg/L的乙酰胆碱之外，其他参数不变。

表3 小球藻生长稳定期加入不同浓度乙酰胆碱对其油脂脂肪酸组成的影响

小球藻生长稳定期加入不同浓度乙酰胆碱对其油脂脂肪酸组成的影响见表3所示。 结果显示相对于对照组(乙酰胆碱的浓度为0μg/L)，在小球藻生长的稳定期加入乙酰胆 碱能够在一定程度上提高小球藻油脂中多不饱和脂肪酸尤其是α-亚麻酸的含量。随着乙 酰胆碱浓度的提高，小球藻藻油中多不饱和脂肪酸脂肪酸尤其是α-亚麻酸的含量呈现一 个先增加后下降趋势，综合考虑乙酰胆碱用量对小球藻藻油中多不饱和脂肪酸脂肪酸尤 其是α-亚麻酸含量的影响，选择乙酰胆碱浓度1.0μg/L，作为小球藻生长和油脂积累的 最适宜浓度，此时小球藻藻油中多不饱和脂肪酸尤其是α-亚麻酸的含量分别为对照组的 1.31倍和1.40倍。