检测山药块茎内源激素的超高效液相色谱-串联质谱法

摘要

本发明公开了一种检测山药块茎内源激素的超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS），包括：山药块茎鲜样经冷冻干燥机脱水冻干，粉碎后加入溶剂提取，获得粗提取液经浓缩干燥，磷酸盐缓冲液复溶，置于–40℃下冷冻，解冻后离心去杂质；进行乙酸乙酯萃取3次，收集酯相；再调水相pH为2.8～3.5，乙酸乙酯再萃取3次，收集合并酯相，浓缩蒸干后甲醇复溶，得到检测样品；采用UPLC-MS/MS对检测样品进行分析。本方法前处理过程快速简便，激素提取回收率高，UPLC-MS/MS法检测限低，精度高，线性关系良好，可以同时有效提取和定量检测山药块茎中的含量甚微的五大类激素中的7种激素。

说明书

技术领域

本发明属于检测技术领域，涉及一种检测山药块茎内源激素的超高效液相色谱-串联质谱 法。

背景技术

山药是传统的药食兼用植物，为薯蓣科植物的块茎，具有补脾养胃、补肺养肾的功效。 深入研究山药块茎，可为山药的高产优质生产提供理论基础。

植物内源激素是植物体内天然合成的有机化合物，在生长、发育以及对环境的应答等过 程中均起着重要的调控作用，其中赤霉素类(GAs)、细胞分裂素类(如ZT)、生长素(如IAA)、 脱落酸(ABA)、茉莉酸(JA)是植物体内非常重要的四大类内源激素。研究表明，植物激素 在调控贮藏器官的形成与生长中起着重要的作用，且越来越多的研究表明这种作用并不是单 一激素作用的结果，而是多种激素之间相互作用的结果，因此，同时分析不同种类植物激素 对研究它们在山药块茎的生长发育过程中相互调控作用机制有着非常重要的意义。然而，内 源激素在植物体内含量甚微，通常只有普通植物次生代谢产物的万分之一甚至更低,在 0.1～50ng·g^-1鲜重范围内，而且有些内源激素的性质不稳定，如生长素类植物激素容易氧 化或见光易分解，赤霉素类不耐高温等。同时，植物提取物又是复杂的多组分混合物，其所 含的次生代谢产物会对植物激素的定性和定量分析产生严重的干扰，因此，为鉴别和定量检 测植物激素，必需建立和优化植物激素的提取和纯化流程。目前，植物激素前处理的纯化过 程中，常使用活性炭、PVP或PVPP吸附酚类杂质和色素，但由于它们对激素本身也有较强的 吸附作用，所以在激素提取过程中不宜采用。另外，使用得较多的是纯化方法是过各种固相 萃取(SPE)小柱以去除脂类和色素类杂质，这种前处理方法不但成本高，而且因为不同种类 激素的极性、酸碱电离度等性质存在差异，纯化不同类别激素需要不同类型的柱子，不仅无 法实现多类激素的同时分析，还使激素纯化过程步骤繁锁、费时；同时导致激素在提取的过 程中损失大，回收率低。山药块茎中富含淀粉、蛋白质、糖类、黏液质、脂肪、多酚、色素、 皂甙类、尿囊素、山药素、胆碱、多胺等多种成分，激素粗提物中含有大量的脂类、多糖、 多酚、甙类、蛋白质、核酸等，利用SPE小柱纯化山药内源激素的效果不理想。目前，对山 药块茎内源激素的测定分析报道很少，而且只偏向于检测某类激素，同时提取和检测山药块 茎中多类激素的研究没见报道。

在对植物激素进行定量分析方面，一些现代分析测试技术已用于测定单种或多种激素， 包括酶联免疫吸附法(ELISA)、液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、毛细管电泳法(CE)、气 质联用法(GC-MS)等方法。但这些方法对植物内源激素的准确定性和定量均存在某些方面不 足，如酶联免疫吸附法(ELISA)不能同时对多种植物激素进行定量分析，并且具有不可避免的 交叉反应,分析结果的准确性和重现性较差；色谱法仅根据保留时间定性，在复杂植物提取物 中可能因为不同物质保留时间相同或相近而给出错误的结论，且紫外和荧光检测器不能满足 超低含量植物激素定性定量分析的要求；毛细管电泳法重现性差；质谱法是目前最可靠的植 物内源激素检测方法，但GC-MS法需要复杂的衍生化处理以提高待测物的挥发性和灵敏度，操 作繁锁，而且在气相入口处温度较高会导致一些热不稳定化合物的降解，这些问题限制了 GC-MS法的应用。与上述方法相比，超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)具有更强的定性 定量能力，原因是超高效液相色谱(UPLC)使用更小粒径(1.7μm)填料的色谱柱进行分离,具 有更强的分离能力和更快的分析速度，UPLC与串联质谱(MS/MS)的完美结合极大提高了仪器 的工作效率，它结合保留时间和母离子/子离子对植物样品中的目标物进行准确、灵敏地定性 与定量，在很大程度上克服了传统色谱技术在植物激素定性和定量分析方面的不足。因此， 寻找一种有效、快速的山药块茎内源激素的提取方法以及一种灵敏、高效的多种内源激素同 时检测的方法是开展山药块茎植物内源激素相关研究的关键。

发明内容

本发明的目的为实现山药块茎中7种内源激素同时定性和定量分析，提供一种山药块茎 样品前处理操作过程简单，成本低，激素回收率高，UPLC-MS/MS法检测速度快，灵敏度高， 检测限低，精确度高，线性关系好的快速检测山药块茎内源激素的方法

本发明是这样实现的：

一种检测山药块茎内源激素的超高效液相色谱-串联质谱法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)粗提：山药块茎鲜样经冷冻干燥机脱水冻干，粉碎后加入溶剂提取，离心后获得上 清液，再加入溶剂重复提取2次，合并内源激素的粗提取液，并浓缩干燥；

(2)纯化：采用pH8～8.3浓度为0.07mol/L的磷酸盐缓冲液对步骤(1)中的粗提取 干燥物进行超声复溶，冷冻离心去杂，得上清液；乙酸乙酯萃取3次，收集酯相；再调水相 pH为2.8～3.5，乙酸乙酯萃取3次，收集合并酯相，浓缩干燥，然后用100％甲醇复溶， 得到检测样品；

(3)检测：利用超高效液相色谱电喷雾串联质谱对检测样品进行分析，检测山药块茎中 内源激素的种类和含量；

其中，所述的溶剂为预冷的含有2mmol/L抗氧化剂2，6-二叔丁基对甲酚(BHT)的100 ％甲醇。

以上步骤(1)中所述的山药冻干粉末与溶剂的重量体积比为1:15～20。

以上步骤(1)中所述的提取条件为密封避光，剧烈涡旋振荡后，在0～4℃下,首次振 荡提取20～24h，随后的两次提取振荡2h。

以上步骤(2)中所述的,磷酸盐缓冲液与山药冻干粉末的体积质量比(ml/g)为5～8:1；

以上步骤(2)中所述的冷冻离心去杂的方法是将步骤(2)的磷酸盐缓冲液复溶物放置 在-40℃低温冰箱中1h以上，4℃解冻后离心。

以上步骤(1)和步骤(2)中所述的离心条件为：4℃，8000～12000rpm，10～15min。

以上步骤(1)和步骤(2)中所述的浓缩干燥条件为：在38℃恒温水浴中，旋转减压 蒸发至干。

以上步骤(2)中所述的乙酸乙酯萃取条件为：向上清液中加1～3倍体积的乙酸乙酯， 在0～4℃下振荡萃取30～60min。

以上步骤(2)中所述的调水相pH所用的试剂为1mol/L稀盐酸。

以上步骤(2)中的所述的复溶均采用超声波助溶30～60s。

以上步骤(3)中所述的对检测样品进行分析在进行UPLC-MS/MS分析前，样品用0.22μm 有机系滤膜过滤。

以上步骤(3)中所述的对检测样品进行分析超高效液相色谱的操作为：采用以下条件， 流动相A：100％甲醇，流动相B：0.1％的甲酸水溶液；洗脱的梯度操作条件见表1；

表1：洗脱的梯度操作条件表

时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 35 65 2 35 65 6 45 55 9 50 50 15 60 40 18 100 0 20 35 65 22 35 65

试验表明，采用该流动相及相应的洗脱梯度，各激素能够很好分离，没有重叠峰，峰形 好，没有拖尾现象。

以上步骤(3)中，所述内源激素为顺式反式玉米素混合物、赤霉素类(GA1、GA3、GA4)、 3-吲哚乙酸、脱落酸、茉莉酸。

检测时，质谱的操作条件见表2；

表2：质谱的操作条件表

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

(1)本发明优化了山药块茎内源激素的提取方法，操作步骤简单，纯化过程没有复杂繁 琐的过柱处理，不仅降低了成本，而且大大降低了激素的损失，提高了回收率，重复性好， 提取得到的样品能够满足分析要求。

(2)本发明方法通过对激素标准品的优化试验，获得了超高效液相色谱分离条件和质谱 检测条件，从而建立了山药块茎中多种内源激素的同时提取和同时检测的UPLC-MS/MS测定方 法，这种方法分析样品速度快，检测一个样只需十几分钟；特异性强，背景噪音低；灵敏度 高，检测限低；检测准确度高，线性关系好，保证了山药块茎中内源激素定性和定量结果的 可靠性。

附图说明

附图1：玉米素ZT二级质谱图(横坐标为质荷比，纵坐标为离子强度)；

附图2：赤霉素GA1二级质谱图(横坐标为质荷比，纵坐标为离子强度)；

附图3：赤霉素GA3二级质谱图(横坐标为质荷比，纵坐标为离子强度)；

附图4：3-吲哚乙酸IAA二级质谱图(横坐标为质荷比，纵坐标为离子强度)；

附图5：脱落酸ABA二级质谱图(横坐标为质荷比，纵坐标为离子强度)；

附图6：茉莉酸JA二级质谱图(横坐标为质荷比，纵坐标为离子强度)；

附图7：赤霉素GA4二级质谱图(横坐标为质荷比，纵坐标为离子强度)；

附图8：7种植物激素标准品的MRM色谱图(横坐标为保留时间min，纵坐标为丰度；各 峰的标识分别是①为玉米素ZY、②为赤霉素GA3、③为赤霉素GA1、④为3-吲哚乙酸IAA、 ⑤为脱落酸ABA、⑥为茉莉酸JA、⑦为赤霉素GA4)；

附图9a：山药块茎样品的MRM色谱图(横坐标为保留时间min，纵坐标为丰度；各峰的 标识分别是①为玉米素ZY、④为3-吲哚乙酸IAA)；

附图9b：山药块茎样品的MRM色谱图(横坐标为保留时间min，纵坐标为丰度；各峰的 标识分别是：②为赤霉素GA3、③为赤霉素GA1、⑤为脱落酸ABA、⑥为茉莉酸JA、⑦为赤霉 素GA4)。

具体实施方式

为阐明对本发明特征的理解，下面结合实施实例对本发明做进一步阐述。

实施例1

一、试验仪器、化学试剂与试验材料

1.仪器

冷冻干燥机、Agilent1290Infinity LC System色谱仪、Agilent6460Triple Quad MS 质谱仪、Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18色谱柱、超声振荡仪、旋转减压蒸发仪、 低温高速离心机、－40℃超低温冰箱和－18℃低温冰箱。

2.化学试剂

GA3(纯度约98％)、IAA(纯度约98％)和JA(纯度约98％)标准品源自德国Dr.Ehrenstorfer 公司，GA1(纯度＞90％)、GA4(纯度＞90％)、ZT(顺式、反式异构体混合物，纯度＞98％)、 和ABA(S-ABA，纯度＞98％)标准品源自捷克Olchemim公司，以上标准品均为HPLC纯度。

3.试验材料

试验所用的材料为桂淮5号山药，种植于广西大学农学院科研试验基地内，采取其膨大 期山药块茎。

二、标准溶液的配制

精确称取赤霉素1(GA1)、赤霉素3(GA3)、赤霉素4(GA4)、玉米素(ZT)、3-吲哚乙 酸(IAA)、脱落酸(ABA)、茉莉酸(JA)标准品各1.0mg，于2ml离心管中，各加入1.0ml 甲醇(色谱纯)超声溶解30s，配成浓度为1mg/ml的标准贮备液，于－40℃冰箱中贮存； 将所述标准品贮备液用色谱甲醇分别稀释，配成10^-1mg/ml、10^-2mg/ml、10^-3mg/ml、10^-4mg/ml 和10^-5mg/ml的工作液，于－18℃贮存；再配成不同浓度梯度的混标溶液，备用。

三、样品前处理

(1)粗提：山药块茎鲜样经冷冻干燥机脱水冻干，粉碎后准确称取0.500g，装入15ml 预冷的具塞塑料离心管中，加入预冷的含有2mmol/L抗氧化剂2，6-二叔丁基对甲酚(BHT) 的甲醇提取液8.0ml，密封避光，剧烈涡旋振荡后，在0～4℃下,首次振荡提取20～24h， 随后的两次提取振荡2h；4℃，12000rpm离心10min，得上清液，再向残渣中加入5ml 预冷的甲醇提取液，重复提取2次，合并3次上清液，在38℃恒温水浴中，旋转减压蒸发 至干。

(2)纯化：采用3ml pH8～8.3的磷酸盐缓冲液(0.07mol/L)对步骤(1)的粗提取 干燥物进行超声复溶30～60s，复溶物放置在-40℃低温冰箱中1h以上，4℃解冻后离心， 去除沉淀下来的杂质，得上清液；上清液采用1.5倍体积的乙酸乙酯萃取3次，收集酯相， 然后用稀盐酸(1mol/L)调水相pH为2.8～3.5，再用1.5倍体积乙酸乙酯萃取3次，萃取 条件均为0～4℃下振荡萃取30～60min，收集合并酯相；酯相在38℃恒温水浴中旋转减 压蒸发至干，用300μl100％甲醇复溶，超声助溶30～60s，得到检测样品。

(3)检测：检测样品经0.22μm有机系滤膜过滤后，利用超高效液相色谱电喷雾串联 质谱对其进行分析，检测山药块茎中内源激素的种类和含量。

四、植物内源激素检测条件的优化

采用植物内源激素标准品，对其检测条件进行了优化。

(1)色谱条件的优化

色谱柱：美国Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18，2.1mm×50mm，1.8μm；

柱温：室温(25±1)℃；

上样量：1μl；

流速：0.3ml/min；

所用的流动相及洗脱的梯度操作条件见表3；

表3：流动相及洗脱的梯度操作条件表

时间(min) 有机流动相A(％) 水相流动相B(％) 0 35 65 2 35 65 6 45 55 9 50 50 15 60 40 18 100 0 20 35 65 22 35 65

实验分别选用了甲醇和乙腈作为有机流动相A，0.1％甲酸水溶液为水相流动相B。实验 证明：当用甲醇作为有机流动相时，这7种激素13min以前出峰完毕，且能够相互分离，没 有重叠峰，质谱离子化效率好；当用乙腈作流动相时，所用的7种激素标准品在前3min内 出完峰，液相分离的效果不好，且进入质谱后的离子化效率受到不同程度的抑制，灵敏度下 降，故本试验采用甲醇作为有机流动相。

依据仪器的特性，在流动相中加入甲酸能提高质谱的离子化效率，试验对比了水相为含 0.1％甲酸水溶液和不含甲酸的纯水作为流动相B，经试验表明：0.1％甲酸水溶液作为流动 相B，各激素峰面积信号增强，灵敏度高。

(2)质谱条件的优化

离子源：电喷雾电离源(ESI)；

离子化模式：分段使用正(+)、负(-)离子扫描模式；

检测方式：多级反应监测(MRM)；

毛细管电压：正离子模式下为3.8kV，负离子模式下为3.3kV，喷嘴电压为0V。

干燥气：N2，温度为320℃，流速为8L/min；

雾化气：N2，雾化气压力为为2.5×10⁵Pa；

鞘气：N2，温度为350℃，流速为10L/min。

采用电喷雾离子源，在Scan模式下，对各激素标准品分别进行正、负离子扫描，根据母 离子的响应丰度的高低，以母离子丰度高的作为合适的扫描模式；在Product Ion模式下， 优化了碰撞电压，并选取经碰撞后所得丰度较高的子离子作为定量和定性离子；在MRM模式 下，继续优化了裂解电压和加速电压。标准品裂解二级质谱图(图1～图7)，确定了各标准 品的母离子、子离子和裂解电压、碰撞能量等质谱参数，结果见表4。

表4：内源激素的质谱操作条件表

利用优化后的色谱质谱条件，UPLC-MS/MS进行分析得到混合标准品的MRM色谱图(见附 图8)。

五、方法验证

1.标准曲线及检出限

按上述优化后的色谱条件和质谱条件，取不同浓度梯度的混合标准溶液进行 UPLC-ESI-MS/MS检测，其中IAA、ZT的浓度梯度均为1、10、100、200、500、1000ng/ml， GA1的浓度梯度为15、60、120、240、480、1000ng/ml，GA4的浓度梯度为25、50、100、 200、500、1000ng/ml，GA3和ABA的浓度梯度均为10、50、100、200、500、1000ng/ml， JA的浓度梯度为50、100、200、400、600、800、1000ng/ml，各水平重复3次，以各激素 特征碎片离子(定量离子)峰面积的平均值(Y)对被测组分的质量浓度(X，ng/ml)作图， 获得它们的标准曲线，并求出相应的线性回归方程和相关系数，以信噪比(S/N)为3确定7 种待测组分的检出限，以信噪比为5计算得到定量限。检出限的计算公式为：

检出限(LOD)＝3N/S＝3N×Q/I＝3Q×N/I；

定量限(LOQ)＝5N/S＝10N×Q/I＝10Q×N/I。

式中：N-噪音；S-检测器的灵敏度；Q-进样量；I-信号响应值。

I/N即为该进样量下的信噪比(S/N)，可通过工作站对图谱进行自动分析获得,为同一浓 度样品10次进样的平均值。信噪比的大小直接关系到检测限的大小，信噪比计算方法的不同， 其比值大小有很大不同，这与计算信噪比时基线噪声峰值的定义方式有关。此方法中基线噪 声峰值的定义为样品峰两侧的基线噪声的平均高度。定量限的计算方法与此类同，结果见表 5。

表5：7种内源激素标准品的回归方程、相关系数、线性范围、检出限和定量限

结果表明：以上7种植物内源激素在1～1000ng/ml的质量浓度范围内具有良好的线性 关系，相关系数均在0.99以上。

2.回收率和精密度的测定

山药块茎鲜样冷冻干燥机脱水冻干，粉碎后准确称取0.500g，装入15ml具塞塑料离 心管中，5个管为一组，其中5管作为空白对照，加入预冷的含有2mmol/L抗氧化剂2，6- 二叔丁基对甲酚(BHT)的甲醇提取液8.0ml，再向3组各管中加入低、中、高3个质量水 平的混合标准溶液0.5ml，空白管加0.5ml100％甲醇。按上述样品前处理方法处理，进行 UPLC-MS/MS检测。

根据各组分的峰面积，计算相应浓度的回收率和相对标准偏差。准确度以样品中添加激 素标准品的回收率衡量，精密度用同批次样品的回收率的相对标准偏差衡量。

回收率＝(加标试样测定值－未加标试样测定值)/加标量×100％。

结果表明(见表6)，本方法在3个浓度添加水平下，7种激素的平均加标回收率范围为 85.5％～103.4％，相对标准偏差(RSD)为3.8％～11.3％，能满足山药块茎中7种内源激 素的测定要求。

表6：山药块茎中7种内源激素的加标回收率及其RSD(n＝5)

实施例2方法的应用

应用实施例1优化的条件对山药膨大期的山药块茎，进行内源激素的测定，最终样品的 MRM色谱图如图9a、9b所示，7种激素的含量分别为：ZT0.044μg/g、GA10.042μg/g、GA3 0.516μg/g、GA40.052μg/g、IAA0.054μg/g、ABA0.085μg/g、JA0.043μg/g。可以看 出，本方法预处理及UPLC-MS/MS测定条件的优化，实现了山药块茎中不同种类激素的同时提 取和测定，方法的定量限、回收率和精密度均满足痕量的分析要求，方法简便、快速、高效。