用于生产具有人可变区的抗体的可育的转基因动物

摘要

本发明尤其涉及可用于生产具有人可变区的抗体的可育的非人脊椎动物例如小鼠和大鼠，其中的内源性抗体链表达已经失活。这一失活导致定位于啮齿类重链基因座内的ADAM6基因丢失，所述基因对育性是至关重要的。导入所述ADAM6基因的功能性拷贝使得可育的小鼠可以产生。

说明书

本发明尤其涉及可用于生产具有人可变区的抗体的可育的非人脊椎 动物例如小鼠和大鼠，其中的内源性抗体链表达已经失活。

背景技术

包含一或多个编码可变区的转基因抗体基因座的产生抗体的非人脊 椎动物例如小鼠和大鼠通常是本领域已知的，其通过以WO2011004192、 US7501552、US6673986、US6130364、WO2009/076464和US6586251 为例的参考文献的方式产生，上述参考文献以引文形式全文并入本文。

使用胚胎干细胞(ES细胞)技术，本领域提供具有转基因抗体基因座 的非人脊椎动物，例如小鼠和大鼠，可以在以人抗原攻击(challenge)后从 其中产生人或嵌合抗体。这些抗体在其重链中，任选地也在其轻链中有 效地具有人可变区。同时，为避免内源性抗体重链表达的复杂化，通常 对这些脊椎动物的基因组进行工程化，以便使内源性重链表达失活。用 于此的技术包括删除全部或部分内源性重链VDJ区，同时或在另一步骤 中插入人VDJ基因区段(例如，见WO2009076464和WO2002066630)。 这些删除导致VH和D基因区段与中间序列一起删除。在这样的操作中， 删除了内源性ADAM6基因[1-5]。

ADAM6基因编码一种属于A解聚素和金属蛋白酶家族的蛋白质。 ADAM家族成员是跨膜糖蛋白，其含有多个保守结构域例如pro-结构域、 金属蛋白酶、解聚素、富半胱氨酸、表皮生长因子(EGF)样、跨膜和胞质 尾区结构域。在各种生物学进展中显示在细胞粘附中涉及ADAM家族。

在小鼠中，有两个ADAM6拷贝(ADAM6a，ADAM6b)，其位于第 12染色体的IgH基因座中的VH和D基因区段之间(在小鼠V_H5-1和D1-1 基因区段之间的中间区中)。这两个毗连的无内含子ADAM6基因具有 95％的核苷酸序列相同性和90％的氨基酸相同性。在人和大鼠中，只有 一个ADAM6基因。小鼠ADAM6的表达模式分析显示其专一地表达于 睾丸[6]。尽管可以在淋巴细胞中检测到ADAM6转录物，但限于细胞核， 这提示ADAM6基因的转录特别地是由于从D区的转录通读，而不是活 性信使RNA产生[7]。

成熟的ADAM6蛋白定位于顶体以及精子头部较后的区上。尤其是， ADAM6与ADAM2和ADAM3形成复合体，这是小鼠中受精所需要的 [8]。参考文献[9]暗示模型中的ADAM6，其中ADAM6被TPST2硫酸化 后与ADAM3相互作用，于是ADAM6和ADAM3从无Tpst2的精子中 丢失。研究观察到Tpst2缺陷的小鼠具有雄性不育性、精子移动性缺陷和 可能的精子-卵子膜相互作用异常。

因此，保持ADAM6在精子中表达对育性是至关重要的。因此，人 们认为其中删除了ADAM6基因的转基因雄性小鼠和大鼠不可育。这妨 碍了群体的繁殖，也妨碍了利用这些小鼠作为转基因抗体产生平台。值 得提供改良的可育产生抗体的非人转基因脊椎动物。

参考文献

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[9].Marcello et al,Lack of tyrosylprotein sulfotransferase-2activity results in altered sperm-egg  interactions and loss of ADAM3and ADAM6in epididymal sperm,J Biol Chem.2011Apr 15；286(15):13060-70.Epub2011Feb21.

发明内容

为了这一目的，本发明提供：

一种制备可育的非人脊椎动物(例如，小鼠)的方法，所述非人脊椎动 物对于转基因抗体重链基因座而言是纯合的，

所述小鼠的基因组

(a)在第12号染色体(或对所述脊椎动物而言等价的染色体)的各自 拷贝上包含各转基因重链基因座；以及

(b)内源性抗体重链表达失活；

所述方法包括以下步骤：

(c)构建转基因小鼠胚胎干细胞(ES细胞)，其包含转基因抗体重链基 因座，所述构建通过将一或多个人VH基因区段、一或多个人D基因区 段和一或多个人JH基因区段插入到第12号染色体(或对所述脊椎动物而 言等价的染色体)的DNA中进行，这样人基因区段与小鼠或人内源性重 链恒定区(任选地，Cμ和/或Cγ)的上游可操作连接；

(d)与步骤(c)同时或分别进行，删除所述第12号染色体的全部或部 分小鼠内源性重链VDJ区，以使内源性抗体重链表达失活，其中删除包 括小鼠ADAM6编码核苷酸序列；

(e)与步骤(c)或(d)同时或分别进行，将一或多个ADAM6编码核苷 酸序列插入到ES细胞基因组；以及

(f)使ES细胞发育成为可育小鼠或其子代，所述可育小鼠或其子代 的基因组对于所述转基因重链基因座而言是纯合的且编码ADAM6，其中 基因组中的两条第12号染色体的全部或部分内源性重链VDJ区已删除； 任选地，其中所述可育小鼠或子代是雄性。

在第二构型(configuration)中，本发明提供一种制备可育的非人脊椎 动物(例如，小鼠)的方法，所述非人脊椎动物对于转基因抗体重链基因座 而言是纯合的，

所述小鼠的基因组

(a)在第12号染色体(或对所述脊椎动物而言等价的染色体)的各自 拷贝上包含各转基因重链基因座；以及

(b)内源性抗体重链表达失活；

所述方法包括以下步骤：

(c)构建转基因小鼠胚胎干细胞(ES细胞)，其包含转基因抗体重链基 因座，所述构建通过将一或多个人VH基因区段、一或多个人D基因区 段和一或多个人JH基因区段插入到第12号染色体的DNA中进行，这样 人基因区段与小鼠或人内源性重链恒定区(任选地，Cμ和/或Cγ)的上游可 操作连接；

(d)与步骤(c)同时或分别进行，删除所述第12号染色体的全部或部 分小鼠内源性重链VDJ区，以使内源性抗体重链表达失活，其中删除包 括小鼠ADAM6编码核苷酸序列；

(e)使ES细胞发育成为幼鼠或其子代，所述幼鼠或其子代基因组包 含所述转基因重链基因座；

(f)从所述小鼠获得第二ES细胞并在所述第二ES细胞基因组中插入 一或多个ADAM6编码核苷酸序列；以及

(g)使所述第二ES细胞发育成为可育小鼠或其子代，所述可育小鼠 或其子代的基因组对于所述转基因重链基因座而言是纯合的并且编码 ADAM6，其中基因组中的两条第12号染色体的全部或部分内源性重链 VDJ区已删除；任选地，其中所述可育小鼠或子代是雄性。

在第三构型中，本发明包含一种制备可育的非人脊椎动物(例如，小 鼠)的方法，所述非人脊椎动物对于转基因抗体重链基因座而言是纯合的，

所述小鼠的基因组

(a)在第12号染色体(或对所述脊椎动物而言等价的染色体)的各自 拷贝上包含各转基因重链基因座；以及

(b)内源性抗体重链表达失活；

所述方法包括以下步骤：

(c)构建转基因小鼠胚胎干细胞(ES细胞)，其包含转基因抗体重链基 因座，所述构建通过将一或多个人VH基因区段、一或多个人D基因区 段和一或多个人JH基因区段插入到第12号染色体的DNA中进行，这样 人基因区段与小鼠或人内源性重链恒定区(任选地，Cμ和/或Cγ)的上游可 操作连接；

(d)与步骤(c)同时或分别进行，删除所述第12号染色体的全部或部 分小鼠内源性重链VDJ区，以使内源性抗体重链表达失活，其中删除包 括小鼠ADAM6编码核苷酸序列；

(e)使ES细胞发育成为幼鼠或其子代，所述幼鼠或其子代基因组包 含所述转基因重链基因座；以及

(f)通过使用所述幼鼠(或子代)以及另外的小鼠(其基因组包含一或 多个ADAM6编码核苷酸序列)进行繁殖，产生可育小鼠或其子代，所述 可育小鼠或其子代的基因组对于所述转基因重链基因座而言是纯合的并 且编码ADAM6，其中基因组中的两条第12号染色体的全部或部分内源 性重链VDJ区已删除；任选地，其中所述可育小鼠或子代是雄性。

在第四构型中，本发明提供可育的非人脊椎动物(任选地，雄性)，其 对于转基因重链基因座而言是纯合的，所述脊椎动物的基因组

(i)包含第一染色体的各自拷贝上的各转基因重链基因座；以及

(ii)内源性抗体重链表达失活；

其中所述基因组的各第一染色体包含

(iii)转基因抗体重链基因座，其包含一或多个人VH基因区段、一 或多个人D基因区段和与小鼠或人内源性重链恒定区(任选地，Cμ和/或 Cγ)的上游可操作连接的一或多个人JH基因区段；

(iv)所述染色体的全部或部分内源性重链VDJ区的删除以使内源性 抗体重链表达失活，其中该删除包括ADAM6；以及

其中该基因组包含

(v)一或多个可表达的ADAM6编码核苷酸序列的插入。

因此，在野生型可育的非人脊椎动物中，ADAM6存在于每个所述第 一染色体上，但内源性重链表达的失活牵涉与删除的重链基因区段共定 位于同一染色体上的ADAM6的删除。例如，如现有技术中使用同源重 组以人VDJ基因区段精确地取代内源性重链VDJ删除内源性ADAM6， 从而影响育性。在小鼠中，这发生在删除第12号染色体上的全部或部分 内源性重链VDJ区以使内源性重链表达失活的时候。在大鼠中，这发生 在删除第6号染色体上的全部或部分内源性重链VDJ区以使内源性重链 表达失活的时候。本发明将ADAM6插入到所述脊椎动物基因组中以恢 复育性。

在第四构型的一个方面中，所述脊椎动物是小鼠且各第一染色体是 第12号染色体。

因此，在第四构型的一个方面中，所述脊椎动物是大鼠且各第一染 色体是第6号染色体。

本发明提供一种制备可育的非人脊椎动物(例如，小鼠或大鼠)的方 法，所述非人脊椎动物对于转基因重链基因座而言是纯合的，所述方法 通过在ES细胞中实施步骤(a)到(d)和使用ES细胞基因组技术产生最终的 非人脊椎动物而提供，所述非人脊椎动物具有包含插入的ADAM6编码 核苷酸序列(纯合或杂合状态)且纯合状态的所述重链基因座的基因组，其 中内源性ADAM6已被删除。本发明还提供通过这一方法制备的可育的 非人脊椎动物(例如，小鼠或大鼠)或其可育的雄性或雌性子代。

附图说明

图1a和1b：内源性IgH通过易位失活和保留Adam6的原理图；

图2：同源重组以人基因区段取代内源性(小鼠)IgH基因座基因区段 以及伴随Adam6基因的删除的原理图；

图3：RMGR以人基因区段取代内源性(小鼠)IgH基因座基因区段以 及伴随Adam6基因的删除的原理图；

图4：删除载体的创建和靶向的原理图；

图5：含有Adam6基因的靶向载体的创建的原理图；

图6：含有Adam6基因的IgH BAC的创建的原理图。

发明详述

本发明提供一种制备可育的非人脊椎动物(例如，小鼠)的方法，所述 非人脊椎动物对于转基因重链基因座而言是纯合的。在一个实施方式中 该方法产生的最终的小鼠是雄性，所以作为基因组操作的结果，本发明 改进现有技术的不育的雄性转基因小鼠。可育的小鼠产生能够使来自雌 性小鼠的卵子受精的精子。例如，通过成功地繁殖以产生小鼠胚胎或幼 崽可以容易地确定育性。在另一实施方式中，本发明的方法制备最终的 雌性小鼠。当然，这些雌性可用于繁殖以产生携带ADAM6且可育的雄 性子代。

本发明的这一方面的方法中，最终的小鼠的基因组包含的基因组在 第12号染色体的各自拷贝上包含转基因重链基因座。野生型小鼠中的重 链基因座发现于第12号染色体上，并且，如以下每个解释，本发明详述 了在同一染色体上建立转基因基因座。在一个实施例中，该转基因基因 座是嵌合基因座，其包含插入小鼠内源性恒定区(至少是小鼠的Cμ和/或 Cγ)的上游的人VDJ基因区段。本发明中人基因区段与该恒定区可操作连 接，所以，在小鼠中分化为B细胞后代之后，所述B细胞能够表达嵌合 抗体，其包含具有人可变区和小鼠恒定区的嵌合抗体。在本发明任一构 型的另一方面中，各转基因重链基因座包含所述与人中龙恒定区可操作 连接的人VDJ基因区段，例如，人Cμ(任选地，与具有人Cμ的小鼠或人 Sμ)和/或人γ，而不是小鼠(或非人)恒定区。

为了这一目的，该方法包括下列步骤：构建转基因小鼠胚胎干细胞 (ES细胞)，其包含转基因抗体重链基因座，所述构建通过将一或多个人 VH基因区段、一或多个人D基因区段和一或多个人JH基因区段插入到 第12号染色体的DNA中进行，这样人基因区段与小鼠内源性重链恒定 区(任选地，Cμ和/或Cγ)的上游可操作连接。任选地，该人基因区段在内 源性小鼠Sμ转换(switch)和Cμ的上游插入。这可用于利用小鼠内源调节 的控制，其用于在以感兴趣的抗原免疫最终的小鼠后，从IgM到其他类 型(例如，IgG)抗体的体内分类转换。在实施例中，生成的ES细胞对转 基因重链基因座而言是杂合的，即该转基因基因座存在于细胞中的一条 第12号染色体上。另一条第12号染色体可以，例如，具有内源性重链 基因座，并且任选地，这是失活的(例如，通过插入功能性标记(例如，neo 或hprt)或通过删除全部或部分基因座，例如全部或部分内源性VDJ区)。 杂合的ES细胞能够以预期的过程发育成为小鼠，其对于该重链转基因基 因座而言是杂合的，而且用繁殖和与其它也含有转基因重链基因座的小 鼠杂交，能够获得的生成的子代相对于该转基因重链转基因是纯合的。 可以将一或多个ADAM6编码核苷酸序列插入(如下面所进一步描述的) 到杂合祖先小鼠的一或两者的基因组中(例如，通过将ADAM6插入到各 自ES细胞中，所述ES细胞是祖先小鼠的祖先)；或者通过小鼠的繁殖， 其中一只小鼠具有ADAM6，这样，生成的子代就是具有ADAM6的祖先 小鼠之一。或者，对于所述重链转基因而言是纯合的但不具有ADAM6 的子代小鼠可以与基因组含有ADAM6基因的小鼠杂交，使用繁殖方法 可以获得对于所述重链转基因而言是纯合的且还含有ADAM6基因(在杂 合或纯合状态)的子代。除了只使用繁殖方法，ES细胞基因组操作可用于 将ADAM6编码核苷酸序列插入到来源于对于所述重链转基因而言纯合 的子代小鼠的ES细胞，并且随后由该ES细胞(或其子代)发育为小鼠， 这样，最终的小鼠基因组对于所述重链转基因而言是纯合的且还包含 ADAM6基因。动物饲养、杂交、繁殖，还有ES细胞(例如，IPS细胞) 基因组操作的技术是本领域容易获得的且为技术人员所熟悉。

在本发明的方法中，与将人基因区段插入到ES细胞基因组同时或分 别进行的是，删除所述第12号染色体的全部或部分小鼠内源性重链VDJ 区，以使内源性抗体重链表达失活，即在源于该ES细胞的最终的子代小 鼠中，内源性抗体重链表达是失活的。在一个实施方式中，内源性VDJ 删除与人VDJ的插入同时进行。例如，可以在技术中使用同源重组以人 VDJ基因区段精确地取代全部小鼠VDJ区(或其包括ADAM6编码核苷酸 序列的部分)。一种方法(例如，见WO2002066630)是使用多个各具有一 或多个人VH和/或D和/或JH区段的同源重组载体(例如，细菌人工染色 体，BAC)，其中载体具有侧面为一或多个人VH基因区段的置于所述转 基因重链基因座5’末端的同源臂(homology arm)。在这个载体中，5’同源 臂可以是直接对应于小鼠基因组序列内源性重链基因座的5’的序列。使 用标准同源重组，精确地插入人基因区段以取代内源性重链基因座5’位 置内源性小鼠基因区段。另一个载体包含侧面为一或多个人JH基因区段 (和任选地，全部或部分小鼠J-C内含子)的置于所述转基因重链VDJ3’ 末端的同源臂。在这个载体中，3’同源臂可以是直接对应于小鼠基因组序 列内源性重链Cμ(或另一下游内源性恒定区)的5’的序列；或者，3’同源 臂可以是对应于全部或部分内源性J-C内含子的序列。使用标准同源重 组，精确地插入人基因区段以取代内源性重链基因座3’位置内源性小鼠 基因区段。在一个实施方式中，多个BAC具有重叠同源臂，并且可以用 于以人VDJ基因区段取代内源性VDJ(例如，见WO2009076464)。在另 一个实施方式中，通常可以使用一或多个这些同源重组技术，其具有如 下修饰：将人VDJ直接插入内源性VDJ区的下游(3')(例如，插入内源性 J-Cμ内含子)，并且在一或多个后续步骤中，删除了内源性VDJ(或其包 含所述ADAM6编码核苷酸序列的部分)，例如，使用标准位点特异性重 组(例如，cre/lox)、转位子(例如，piggyBac转位子)或同源重组技术。在 另一实施方式中，人VDJ插入第一小鼠VH基因区段的5'(例如，直接到 5'或距5'100kb以内)，并且在一或多个后续步骤中，内源性VDJ(或其包 含所述ADAM6编码核苷酸序列的部分)被删除。

在任一构型的一个实施方式中，在本发明的方面或实施方式中(例如， 本发明的方法和脊椎动物)，内源性VDJ(或其包含所述ADAM6编码核 苷酸序列的部分)通过易位到不同种类的染色体而从染色体删除。例如， 不同的染色体是第15号染色体。小鼠中第12和15号染色体之间的易位， 例如，是值得进行的，因为从发表的观察结果可知，在第12号染色体上 的重链基因座和第15号染色体上的c-myc之间的易位是可能的(见，例如， Science24December1982:Vol.218no.4579pp.1319-1321；“Mouse c-myc  oncogene is located on chromosome15and translocated to chromosome12in  plasmacytomas”；Crews et al)。因此，在一个所述脊椎动物是小鼠的实施 例中，所述内源性VDJ(或其部分)通过易位到第15号染色体而从第12 号染色体删除。在另一个所述脊椎动物是大鼠的实施例中，所述内源性 VDJ(或其部分)通过易位到第15号染色体而从第6号染色体删除。因此， 在本发明的最终的可育小鼠或小鼠子代中，内源性重链表达通过将至少 部分内源性重链基因座VDJ易位到非野生型染色体(即，不是第12号染 色体)而失活。因此，在本发明的最终的可育大鼠或大鼠子代中，内源性 重链表达通过将至少部分内源性重链基因座VDJ易位到非野生型染色体 (即，不是第6号染色体)而失活。在这种情况中，易位的内源性VDJ(或 部分)保持在动物的基因组中，但导致内源性重链表达无功能。这是有利 的，因为内源性ADAM6基因从野生型染色体位置删除而产生失活，但 是其随后通过易位插入到完全不同的染色体种类(即，不具有抗体重链基 因组的染色体)上的基因组其他位置，所述易位以使插入的ADAM6基因 有功能(并因此在下游动物中产生育性)而不用再激活内源性重链表达的 方式进行。因此，易位使失活可以伴随着保留内源性、野生型ADAM6 基因以为生成的动物的育性做准备。这完美地将ADAM6基因剪裁(tailor) 到所述动物的基因组(因为其是内源性序列)，并且在一个实施方式中，还 使各插入的内源性ADAM6基因与其内源性启动子(和任何其它控制元件 例如增强子)可以一起转移。因此，在一个实施方式中，失活通过删除包 含包括各自启动子的一或多个ADAM6基因的染色体序列(例如，小鼠第 12号或大鼠第6号染色体的序列)而进行，并且该序列通过易位插入到不 包含重链基因座的染色体(例如，小鼠出第12号染色体之外的染色体；大 鼠出第6号染色体之外的染色体)。例如，这可以通过易位至少其侧翼直 接连接内源性VH基因区段最3’和内源性D区段最5’的DNA来达成。 在一个实施例中，所述非人脊椎动物是小鼠，易位的DNA包含来自小鼠 VH5-1到D1-1基因区段，或由其组成。在一实施方式中，全部内源性VD 区被易位；在另一实施方式中，全部VDJ区被易位，在任一情况中，这 还将使内含的内源性ADAM6基因易位。

本文描述的关于小鼠的所有技术还应用于其他非人脊椎动物,其中 ADAM6将与内源性VDJ一起删除，例如，其中ADAM6嵌入内源性VDJ 区。例如，所述技术可以应用于另一个转基因鼠类物种。所述技术可以 应用于转基因大鼠。自始至终，公开内容应考虑这些来理解，这样关于 转基因小鼠的讨论等同于可应用于制备其他非人转基因动物。因此，例 如，提到小鼠第12号染色体的地方和制备转基因小鼠，本文公开的内容 还可以理解为制备转基因大鼠，以及在大鼠的情况下意指第6号染色体。

在所有情况中，染色体上的内源性VDJ区内的删除优选地包括所有 ADAM6编码核苷酸序列的删除。因此，当所述脊椎动物是小鼠时， ADAM6a和ADAM6b被删除。例如，侧翼直接连接内源性VH基因区段 最3’和内源性D区段最5’的DNA被删除。在一个实施例中，所述非人 脊椎动物是小鼠，从小鼠V_H5-1到D1-1基因区段的DNA被删除。

本发明通过实施提供一种制备可育非人脊椎动物(例如，小鼠或大鼠) 的方法，所述非人脊椎动物对于转基因抗体重链基因座而言是纯合的， 所述方法通过在ES细胞中实施步骤(a)到(d)和使用ES细胞基因组技术产 生最终的非人脊椎动物而提供，所述非人脊椎动物具有包含插入的 ADAM6编码核苷酸序列(纯合或杂合状态)且纯合状态的所述重链基因座 的基因组，其中内源性ADAM6已被删除。本发明还提供通过这一方法 制备的可育的非人脊椎动物(例如，小鼠或大鼠)或其可育的雄性或雌性子 代。

一方面，与插入人VDJ和删除内源性VDJ(或其部分)同时或分别进 行，所述方法包括

-将一或多个ADAM6编码核苷酸序列插入到ES细胞基因组；以及

-将所述ES细胞发育为可育小鼠或其子代，其基因组对于转基因重 链基因座而言是纯合的，其中基因组中的两条第12号染色体的全部或部 分内源性重链VDJ区皆已删除；任选地其中所述可育小鼠或子代是雄性。

另一方面，在插入人VDJ区和删除内源性VDJ(或其部分)后，所述 方法包括

-将所述ES细胞发育为幼鼠或其子代，其基因组包含一或多个所述 转基因重链基因座(例如，对于所述转基因重链基因座而言是纯合的)；

-从所述小鼠得到第二ES细胞，并将一或多个ADAM6编码核苷酸 序列插入到所述第二ES细胞基因组；以及

-将所述第二ES细胞发育为可育小鼠或其子代，其基因组对于所述 转基因重链基因座而言是纯合的并编码ADAM6，其中基因组中的第12 号染色体的全部或部分内源性重链VDJ区已删除；任选地其中所述可育 小鼠或子代是雄性。

另一方面，在插入人VDJ区和删除内源性VDJ(或其部分)后，所述 方法包括

-将所述ES细胞发育为幼鼠或其子代，其基因组包含所述转基因重 链基因座(例如，对于所述转基因重链基因座而言是纯合的)；以及

-通过使用所述小所幼崽(或子代)与另一小鼠进行繁殖，所述另一 小鼠的基因组包含一或多个ADAM6编码核苷酸序列，产生可育小鼠或 其子代，其基因组对于所述转基因重链基因座而言是纯合的并编码 ADAM6，其中基因组中的第12号染色体的全部或部分内源性重链VDJ 区已删除；任选地其中所述可育小鼠或子代是雄性。

在这方面，任选地，所述另一小鼠对于ADAM6而言是纯合的，例 如，小鼠基因组以纯合的状态包含ADAM6a和ADAM6b。任选地，所述 小鼠是统一小鼠品系的。

技术人员知道用于得到胚胎干细胞的技术。例如，可以使用用于ES 细胞产生的任何标准技术从胚胎(例如，囊胚状态)产生所述第二ES细胞。 例如，参见Proc Natl Acad Sci1997May27；94(11):5709-12；“The origin  and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse”；Brook FA& Gardner RL，其公开的内容以引文并入本文。胚胎可以是所述幼鼠或其子 代胚胎。可以使用其他标识ES细胞产生技术。在另一实施方式中，所述 第二ES细胞是IPS细胞(诱导型多能干细胞)，其得自所述幼鼠或其子代。 参见WO2007069666、WO2008118820、WO2008124133、WO2008151058、 WO2009006997和WO2011027180，其提供关于IPS技术和合适的方法的 指导，其公开内容全部并入本文。在一个实施例中，IPS细胞可以使用标 准方法从所述幼鼠或其子代小鼠的体细胞直接产生(即，不需要繁殖)。

精通ES细胞技术的技术人员会很容易地知道怎样从基因组被操作 的转基因ES细胞产生后代。例如，将非人(例如，小鼠)ES细胞(例如包 含转基因重链基因座的ES细胞)移植到供体囊胚中(例如，与该ES细胞 同一品系的脊椎动物的囊胚)。然后将该囊胚移植到养母体内，其在该处 发育为后代(胚胎或出生的后代)。以这种方式，可以产生多个后代，其来 自各个修饰的后代ES细胞。同胞小鼠可以一起培养以进行杂交提供一或 多个生成的子代，其对于所述转基因重链基因座而言是纯合的。

在一个实施例中，通过下述步骤将本发明任何构型、方面或实施例 的小鼠ES细胞发育为后代或子代：

(f)将所述ES细胞转移到供体小鼠囊胚或更早期胚胎(例如，前桑椹 胚期)中；

(g)将所述囊胚或胚胎移植到小鼠养母中；以及

(h)将所述囊胚或胚胎发育为可育的幼鼠或其子代，其基因组对于所 述转基因重链基因座而言是纯合的并编码ADAM6。

本发明的构型的另一方面，ADAM6编码核苷酸序列的插入位置不限 于最初的染色体(例如，小鼠的第12号染色体或大鼠的第6号染色体)； 可以插入到另一染色体，或者在原始染色体上但与野生型ADAM6基因 位置相间隔。在一个实施例中，将ADAM6基因插入到原始染色体种， 例如，当制备转基因小鼠时，将ADAM6编码核苷酸序列插入到第12号 染色体；当制备转基因大鼠时，将ADAM6编码核苷酸序列插入到第6 号染色体。在一个实施例中，将ADAM6编码核苷酸序列插入到距一或 全部两个转基因重链基因座20、15、10、5、4、3、2、1或0.5Mb以内。 这可用于最大化插入的ADAM6和所述转基因基因座之间的连接，最小 化随后呃减数分裂和杂交过程中(例如子代繁殖过程中)的基因分离。因 此，最终的小鼠及其子代可以保持本发明的育性优势，而允许有用的后 续繁殖和杂交以产生新的动物品系。在另一实施方式中，将ADAM6编 码核苷酸序列插入到一或全部两个转基因重链基因座以内，例如，在人 VH基因区段最3’和人D区段最5’的DNA内，所述DNA天然具有 ADAM6。

在本发明构型的任何方面，通过ES细胞技术和/或通过繁殖将一或 多个(例如，两个)ADAM6编码核苷酸序列掺入到脊椎动物基因组。插入 的ADAM6编码核苷酸序列不需要来自与受者非人脊椎动物相同的物种。 例如，该脊椎动物是小鼠和大鼠或灵长类(例如，人)，插入了ADAM6编 码核苷酸序列。例如，该脊椎动物是大鼠和小鼠或灵长类(例如，人)， 插入了ADAM6编码核苷酸序列。

在一个实施方式中，所述脊椎动物是小鼠，且ADAM6编码核苷酸 序列插入到一或全部两个第12号染色体上。例如，小鼠ADAM6a和 ADAM6b或大鼠ADAM6插入到一或全部两个第12号染色体上。例如， 小鼠ADAM6编码核苷酸序列插入在人VH基因区段最3’和人D区段最 5’之间。

在一个实施方式中，所述脊椎动物是大鼠，且ADAM6编码核苷酸 序列插入到一或全部两个第6号染色体上。例如，小鼠或大鼠ADAM6 插入到一或全部两个第6号染色体上。例如，小鼠ADAM6编码核苷酸 序列插入在人VH基因区段最3’和人D区段最5’之间。

在本发明构型的任何方面，各ADAM6是可表达的。例如，插入插 入的ADAM6编码核苷酸序列，这样其与启动子(以及任选地，增强子或 其它调控元件)可操作连接以表达。所述启动子可以是所述非人脊椎动物 内源性的，例如，小鼠启动子(例如，野生型小鼠中驱动ADAM6表达的)， 或其可以是外源性的(来自不同物种)。例如，基因组中插入的ADAM6是 大鼠ADAM6核苷酸序列，其与内源性小鼠ADAM6启动子可操作连接。 或者，基因组中插入的ADAM6是小鼠ADAM6核苷酸序列，其与内源 性大鼠ADAM6启动子可操作连接。

在一个实施方式中，插入ADAM6核苷酸序列，其选自SEQ ID NO: 1、2、3和4(见下面的序列表)。

在本发明的方法的一个实施方式中，人免疫球蛋白基因区段插入到 染色体以取代全部或部分内源性重链VDJ区，这样人基因区段的插入和 内源性VDJ DNA从染色体或基因组删除同时进行；任选地，其中全部内 源性VDJ区被取代。例如，人基因的插入使用同源重组和/或位点特异性 重组(例如，重组酶介导的盒(cassette)交换)以执行精确取代而进行。内源 性VDJ(尤其是全部内源性VDJ)从基因组删除有利于完全消除与恒定区 基因区段重组的可能性，从而必然会完全消除内源性重链表达。

在本发明方法的一个实施例中，其中所述脊椎动物是小鼠，插入小 鼠ADAM6a和ADAM6b编码核苷酸序列，这样最终的可育小鼠能够表 达ADAM6a和ADAM6b蛋白。

在本发明方法的一个实施例中，最终的可育小鼠或子代的基因组对 于各插入的ADAM6编码核苷酸序列而言是纯合的。任选地，所述基因 组包含多于两个拷贝的小鼠ADAM6a和/或ADAM6b编码核苷酸序列。 任选地，作为供替代的选择，所述基因组包含两个拷贝的ADAM6a和一 个拷贝的(杂合的)ADAM6b；或一个拷贝的ADAM6a和两个拷贝的(杂合 的)ADAM6b。

在另一构型中，本发明提供可育的非人脊椎动物(任选地，雄性)，其 对于转基因抗体重链基因座而言是纯合的，所述脊椎动物的基因组

(i)在第一染色体的各自拷贝上包含各转基因重链基因座；以及

(ii)内源性抗体重链表达失活；

其中所述基因组的各第一染色体包含

(iii)转基因抗体重链基因座，其包含与小鼠重链恒定区(任选地，Cμ 和/或Cγ)的上游可操作连接的一或多个人VH基因区段、一或多个人D 基因区段和一或多个人JH基因区段；

(iv)所述染色体的全部或部分内源性重链VDJ区的删除以使内源性 抗体重链表达失活，其中该删除包括ADAM6；以及

其中该基因组包含

(v)一或多个可表达的ADAM6编码核苷酸序列的插入。

例如，所述非人脊椎动物是鼠类。例如，所述非人脊椎动物是小鼠 或大鼠。

一方面，本发明提供非人脊椎动物例如小鼠(任选地，雄性小鼠)，其 对于转基因抗体重链基因座而言是纯合的，所述小鼠的基因组

(i)在第12号染色体(或对于所述脊椎动物而言等价的染色体)的各自 拷贝上包含各转基因重链基因座；以及

(ii)内源性抗体重链表达失活；

其中所述基因组的各第12号染色体包含

(iii)转基因抗体重链基因座，其包含与重链恒定区(任选地，Cμ和/ 或Cγ)的上游可操作连接的一或多个人VH基因区段、一或多个人D基因 区段和一或多个人JH基因区段；

(iv)所述第12号染色体的全部或部分小鼠内源性重链VDJ区的删除 以使内源性抗体重链表达失活(分化为小鼠/B细胞之后)，其中所述删除包 括小鼠ADAM6编码核苷酸序列(即，基因组中没有保留功能性内源 ADAM6基因)；以及

其中该基因组包含

(v)一或多个可表达的ADAM6编码核苷酸序列的插入。

以上大体考虑了在本发明的动物中怎样和在哪里插入ADAM6序列。

恒定区是，例如，小鼠恒定区，例如，内源性恒定区。因此，当所 述脊椎动物是小鼠时，所述恒定区是内源性小鼠恒定区，例如小鼠Cμ和 /或小鼠Cγ，任选地，其具有内源性小鼠或大鼠Sμ转换。

另一方面，本发明提供非人大鼠(任选地，雄性大鼠)，其对于转基因 抗体重链基因座而言是纯合的，所述大鼠的基因组

(i)在第6号染色体的各自拷贝上包含各转基因重链基因座；以及

(ii)内源性抗体重链表达失活；

其中所述基因组的各第6号染色体包含

(iii)转基因抗体重链基因座，其包含与重链恒定区(任选地，Cμ和/ 或Cγ)的上游可操作连接的一或多个人VH基因区段、一或多个人D基因 区段和一或多个人JH基因区段；

(iv)所述第6号染色体的全部或部分大鼠内源性重链VDJ区的删除以 使内源性抗体重链表达失活(分化为小鼠/B细胞之后)，其中所述删除包括 大鼠ADAM6编码核苷酸序列(即，基因组中没有保留功能性内源ADAM6 基因)；以及

其中该基因组包含

(v)一或多个可表达的ADAM6编码核苷酸序列的插入。

恒定区是，例如，大鼠恒定区，例如，内源性恒定区。因此，当所 述脊椎动物是大鼠时，所述恒定区是内源性大鼠恒定区，例如大鼠Cμ和 /或大鼠Cγ，任选地，其具有内源性小鼠或大鼠Sμ转换。

在本发明的纯合小鼠或大鼠的一个实施例中，插入的ADAM6编码 核苷酸序列在(i)第12号染色体上，其中所述动物是小鼠；或(ii)第6号染 色体上，其中所述动物是大鼠。

在本发明的纯合小鼠或大鼠的一个实施例中，插入的ADAM6编码 核苷酸序列插入至(i)一或全部两个转基因重链基因座以内；或(ii)距一或 全部两个转基因重链基因座20Mb以内。

在本发明的纯合小鼠或大鼠的一个实施例中，人基因区段取代各重 链基因座内的全部或部分内源性VDJ区。

在本发明的纯合小鼠或大鼠的一个实施例中，所述基因组包含插入 的可表达的小鼠ADAM6a和ADAM6b编码核苷酸序列。

在本发明的纯合小鼠或大鼠的一个实施例中，所述基因组包含插入 的可表达的大鼠ADAM6编码核苷酸序列。

在本发明的纯合小鼠或大鼠的一个实施例中，所述基因组对于各插 入的ADAM6编码核苷酸序列而言是纯合的。任选地，所述基因组包含 多于两个拷贝的ADAM6编码核苷酸序列，其选自大鼠ADAM6、小鼠 ADAM6a和小鼠ADAM6b编码核苷酸序列。任选地，所述基因组包含两 个拷贝的ADAM6a和一个拷贝(杂合的)的ADAM6b；或一个拷贝的 ADAM6a和两个拷贝的(杂合的)ADAM6b。

在本发明的纯合小鼠或大鼠的一个实施例中，所述基因组包含一或 多个转基因轻链基因座，其包含一或多个人轻链V基因区段和与轻链恒 定区(例如，内源性小鼠或大鼠Cκ恒定区)的上游可操作连接的一或多个 轻链J基因区段。

通过易位的内源性抗体链表达的失活

在一个构型中，本发明提供：

非人脊椎动物(任选地，小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(任选地， 小鼠或大鼠细胞)，其基因组

(i)包含一或多个转基因抗体基因座，其能够表达包含人可变区的抗 体(任选地，在抗体基因重排之后)；以及

(ii)内源性抗体表达失活；

其中

(iii)内源性可变区基因区段易位到在野生型非人脊椎动物中不含有 抗体可变区基因区段的染色体种类(例如，第15号染色体)，从而使内源 性抗体表达失活。

所述脊椎动物可以是本文公开的任何非人脊椎动物物种。所述转基 因抗体基因座可以是根据任何本文公开的物种获得。

在一个实施例中，所述内源性可变区基因区段易位到在野生型所述 非人脊椎动物中不含有抗体可变区基因区段的染色体种类(例如，第15 号染色体)，所述易位在祖先细胞中进行(例如，ES细胞)，本发明的脊椎 动物或细胞起源于所述祖先细胞。

本发明还提供：

小鼠或小鼠细胞，其基因组

(i)包含一或多个转基因抗体基因座，其能够表达包含人可变区的抗 体(任选地，在抗体基因重排之后)；以及

(ii)内源性小鼠抗体表达失活；

其中

(iii)多个内源性小鼠可变区基因区段从基因组中的第12号染色体缺 失，但所述基因区段(彼此之间)以种系构型存在于一或多个非第12号染 色体的染色体上(例如，所述基因区段在第15号染色体上)，从而使内源 性小鼠抗体表达失活。

此外，本发明提供：

大鼠或大鼠细胞，其基因组

(i)包含一或多个转基因抗体基因座，其能够表达包含人可变区的抗 体(任选地，在抗体基因重排之后)；以及

(ii)内源性大鼠抗体表达失活；

其中

(iii)多个内源性大鼠可变区基因区段从基因组中的第6号染色体缺 失，但在所述基因区段(彼此之间)以种系构型存在于一或多个非第6号染 色体的染色体上(例如，所述基因区段在第15号染色体上)，从而使内源 性大鼠抗体表达失活。

当本发明涉及细胞，例如ES细胞时，内源性抗体表达的失活涉及分 化的产生抗体的子代细胞或表达内源性抗体(即，其可变区只是所述非人 脊椎动物类型(例如，小鼠或大鼠抗体)而不是人可变区的抗体)的非人脊 椎动物失去功能。因此，在本发明中，所述脊椎动物、小鼠、大鼠及表 达包含人可变区的转基因抗体而不(或基本不)表达内源性抗体。在一个实 施例中，所述转基因抗体基因座可以经历体内重排，例如，在以预先确 定的抗原免疫所述脊椎动物、小鼠或大鼠之后。重排之后，所述生物体 能够从所述重排的基因座表达抗体链，这些链形成包含人可变区的抗体。

在一个实施方式中，所述脊椎动物、小鼠、大鼠或细胞基因组包含 转基因抗体重链基因座(处于杂合或纯合状态)，所述基因座包含与非人脊 椎动物(例如，小鼠或大鼠)恒定区(任选地，Cμ和/或Cγ)的上游可操作连 接的一或多个人VH基因区段、一或多个人D基因区段和一或多个人JH 基因区段；且所述内源性可变区基因区段选自内源性

(a)VH；

(b)D；

(c)JH；

(d)VH和D；

(e)D和JH；以及

(f)VH、D和JH。

在(a)到(f)中，可以包括基因区段之间的中间序列。

在这一实施方式的一个实施例中，所述恒定区是内源性恒定区，例 如，内源性Cμ和/或Cγ，例如内源性小鼠Cμ和/或内源性小鼠Cγ。

在一个实施方式中，所述脊椎动物、小鼠、大鼠或细胞基因组包含 可表达的ADAM6基因或ADAM6编码核苷酸序列。

在一个实施方式中，所述脊椎动物、小鼠、大鼠或细胞是雄性脊椎 动物、小鼠、大鼠或细胞，例如，其基因组包含内源性ADAM6基因。

在一个实施方式中，基本上全部内源性VDJ(或其包括ADAM6编码 核苷酸序列的部分)通过异位到不同的染色体种类而从该染色体删除。例 如，所述不同的染色体是第15号染色体。例如，小鼠中第12和15号染 色体之间的易位值得进行，因为从发表的观察结果可知，在第12号染色 体上的重链基因座和第15号染色体上的c-myc之间的易位是可能的(见， 例如，Science24December1982:Vol.218no.4579pp.1319-1321；“Mouse  c-myc oncogene is located on chromosome15and translocated to  chromosome12in plasmacytomas”；Crews et al)。因此，在一个所述脊椎动 物是小鼠的实施例中，所述内源性VDJ(或其部分)通过易位到第15号染 色体而从第12号染色体删除。在另一个所述脊椎动物是大鼠的实施例中， 所述内源性VDJ(或其部分)通过易位到第15号染色体而从第6号染色体 删除。因此，在本发明的最终的可育小鼠或子代中，内源性重链表达通 过将至少部分内源性重链基因座VDJ易位到非野生型染色体(即，不是第 12号染色体)而失活。因此，在本发明的最终的可育大鼠或子代中，内源 性重链表达通过将至少部分内源性重链基因座VDJ易位到非野生型染色 体(即，不是第6号染色体)而失活。在这种情况中，易位的内源性VDJ(或 部分)保持在动物的基因组中，但导致内源性重链表达无功能。这是有利 的，因为内源性ADAM6基因从野生型染色体位置删除而产生失活，但 是其随后通过易位插入到完全不同的染色体种类(即，不具有抗体重链基 因组的染色体)上的基因组其他位置，所述易位以使插入的ADAM6基因 有功能(并因此在下游动物中产生育性)而不用再激活内源性重链表达的 方式进行。因此，易位使失活可以伴随着保留内源性、野生型ADAM6 基因以为生成的动物的育性做准备。这完美地将ADAM6基因剪裁(tailor) 到所述动物的基因组(因为其是内源性序列)，并且在一个实施方式中，还 使各插入的内源性ADAM6基因与其内源性启动子(和任何其它控制元件 例如增强子)可以一起转移。因此，在一个实施方式中，失活通过删除包 含包括各自启动子的一或多个ADAM6基因的染色体序列(例如，小鼠第 12号或大鼠第6号染色体的序列)而进行，并且该序列通过易位插入到不 包含重链基因座的染色体(例如，小鼠出第12号染色体之外的染色体；大 鼠出第6号染色体之外的染色体)。例如，这可以通过易位至少其侧翼直 接连接内源性VH基因区段最3’和内源性D区段最5’的DNA来达成。 在一个实施例中，所述非人脊椎动物是小鼠，易位的DNA包含来自小鼠 VH5-1到D1-1基因区段，或由其组成。在一实施方式中，全部内源性VD 区被易位；在另一实施方式中，全部VDJ区被易位，在任一情况中，这 还将使内含的内源性ADAM6基因易位。

因此，本发明提供：

一种制备非人脊椎动物细胞(任选地，小鼠或大鼠细胞)或非人脊椎动 物(例如，小鼠或大鼠)的方法，所述方法包括

(i)将一或多个包含人可变区基因区段的转基因抗体基因座插入到 非人ES细胞基因组中；以及

(ii)通过将内源性可变区基因区段(例如，全部内源性重链VDJ区) 易位到在野生型所述非人脊椎动物中不含有抗体可变区基因区段的染色 体种类(例如，第15号染色体)使内源性抗体表达失活；

由此，产生非人脊椎动物ES细胞，其能够产生子代细胞(例如B细 胞或杂交瘤)，在所述子代细胞中，内源性抗体表达失活，并且其中所述 子代能够表达包含人可变区的抗体；以及

(iii)任选地，将所述ES细胞分化为所述子代细胞或包含所述子代细 胞的非人脊椎动物(例如，小鼠或大鼠)。

在一个实施例中，将种系构型中包括中间序列的全部(或基本上全部) 内源性重链VDJ区易位。任选地，所述细胞/脊椎动物的基因组对于此易 位而言是纯合的。作为选择或另外，将轻链VJ区易位，例如，将种系构 型中包括中间序列的全部(或基本上全部)内源性轻链(例如，κ)VJ区易位。

本发明的非人脊椎动物可用于在以感兴趣的目标抗原或表位免疫后 产生抗体。有效地，产生的抗体具有人重链(和任选地也具有轻链)可变区。 重链(和任选地也具有轻链)恒定区是所述非人脊椎动物的，例如所述动物 内源性的，这使得可以利用内源性抗体表达和B细胞发育控制机制，从 而增强抗体产生。抗原免疫后的进行分离，此后，所选的抗体可以通过 用常规技术将所述恒定区交换为人恒定区而格式化(formatted)以提高给 人施用的相容性。

从本发明的动物分离的抗体(或衍生的抗体)具有使其包含人重链可 变区的格式(format)。例如，本发明适用于4-链抗体，其中各抗体含有2 个重链和2个轻链。或者，本发明可以应用于具有人V区的H2抗体(重 链抗体)，并且其缺乏CH1和轻链(与骆驼科动物(Camelid)H2抗体等价的： 见，例如，Nature.1993Jun3；363(6428):446-8；Naturally occurring  antibodies devoid of light chains；Hamers-Casterman C,Atarhouch T, Muyldermans S,Robinson G,Hamers C,Songa EB,Bendahman N,Hamers  R)。这些抗体能特异性结合抗原，这样的抗体与骆驼科动物(例如，无峰 驼、骆驼、羊驼)血液中发现的那些类似。这些具有人VH对的抗体可以 合成地产生以提供治疗和预防的药物(例如，见WO1994004678、 WO2004041862、WO2004041863)。转基因小鼠也可以产生这样的抗体， 并且体内产生所述抗体使所述小鼠的免疫系统可以选择人VH-VH配对， 有时选择其中由小鼠体内导入突变的配对以容纳所述配对 (WO2010109165A2)。因此，在本发明的一个实施方式中，所述重链转基 因缺乏CH1基因区段并且所述基因组不包含功能性抗体轻链基因座。或 者，检测抗体是抗体片段，例如，Fab或Fab2，其包含恒定区和人重链可 变区。

技术人员熟悉用于以抗原免疫的常规方法和方案，例如，使用初始 免疫和加强(prime and boost)免疫方案。合适的方案是RIMMS(见 Hybridoma1997Aug；16(4):381-9；“Rapid development of affinity matured  monoclonal antibodies using RIMMS”；Kilpatrick et al)。对于免疫本发明的 脊椎动物，合适的人靶位或表位可以来自任何合适的来源，例如，通过 克隆来自人供体的血液或组织样品的DNA获得。

贯穿本文，以及应用于本发明的任何构型、方面、实施方式或实施 例，术语“内源性”(例如，内源性恒定区)涉及非人脊椎动物或细胞、其 元件或特征(例如，“内源性ADAM6”或“内源性恒定区”)，该术语说 明所述元件是一类通常发现于非人椎动物或细胞株系的元件(与外源性恒 定区、ADAM6或序列通常未发现于这样的脊椎动物或细胞中的其它元件 相反)。

在一个实施例中，各小鼠或ES细胞具有129小鼠遗传背景。在一个 实施例中，所述小鼠或ES细胞具有AB2.1小鼠遗传背景。在另一实施例 中，所述小鼠或ES细胞具有选自129、C57BL/6N、C57BL/6J、JM8、 AB2.1、AB2.2、129S5或129Sv的小鼠品系的遗传背景。

从本发明的脊椎动物分离的抗体可以随后，例如，通过添加(例如通 过化学缀合)标签或毒素、PEG或其它部分进行衍生，以制备药物产物。 例如，当值得给开发自抗体的药物添加额外的功能时，衍生是有益的。 例如，对于癌症指示，值得添加额外的帮助细胞杀伤的部分。在另一实 施方式中，从所述脊椎动物分离的抗体的恒定区是体内或体外亲和力成 熟的(例如，通过噬菌体展示、核糖体展示、酵母展示等)。在另一实施方 式中，从所述脊椎动物分离的抗体的恒定区是体内或体外突变的(例如， 通过随机或定向的、特异性突变和通过噬菌体展示、核糖体展示、酵母 展示等任选的)。所述恒定区可以突变以失去(ablate)或增强Fc功能(例如 ADCC)。

在一个实施方式中，最终的脊椎动物的基因组包含一或多个轻链抗 体基因座，其包含VJ基因区段，例如，如WO2011004192、US7501552、 US6673986、US6130364、WO2009076464和US6586251任一者所描述的， 上述文献公开的内容以引文全部并入本文。在一个实施例中，所述最终 的脊椎动物包含

(a)重链基因座，各包含位于内源性非人脊椎动物(例如，内源性小 鼠或大鼠)恒定区(例如，Cμ和/或Cγ)上游的一或多个人重链V基因区段、 一或多个人重链D基因区段和一或多个人重链JH基因区段；

(b)κ轻链基因座(任选地处于纯合状态)，其包含位于内源性非人脊椎 动物(例如，内源性小鼠或大鼠)κ恒定区上游的一或多个人κ链V基因 区段和一或多个人κ链Jκ基因区段；以及任选地

(c)λ轻链基因座(任选地处于纯合状态)，其包含位于内源性非人脊椎 动物(例如，内源性小鼠或大鼠)λ恒定区上游一或多个人λ链V基因区段 和的一或多个人λ链Jλ基因区段；以及

(d)其中所述脊椎动物在所述基因座重排和以抗原免疫后，能够产生 嵌合抗体。

如本领域常规技术，提供产生IPS细胞的方法。例如，小鼠胚胎成 纤维细胞可以从小鼠胚胎以及随后使用任何标准技术产生的IPS细胞产 生。例如，参见Proc Natl Acad Sci；2011Oct11；“Rapid and efficient  reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells by retinoic  acid receptor gamma and liver receptor homolog1”；Wang et al，其公开的内 容以引文并入本文。可以使用其他标准IPS产生技术。

在本发明任一方面的一个实施方式中，当使用IPS细胞时，所述IPS 细胞时小鼠胚胎成纤维细胞。

人DNA(例如，作为重链和/或轻链基因区段来源)很容易从商业途径 和学术文库(例如，含有人DNA的细菌人工染色体(BAC)文库)获得。例 如人RPCI-11和-13文库(Osoegawa et al,2001–see below； http://bacpac.med.buffalo.edu/11framehmale.htm)和“CalTech”人BAC文库 (CalTech Libraries A,B,C and/or D, http://www.tree.caltech.edu/lib_status.html)。

CalTech人BAC文库D：

见：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clone/library/genomic/16/

加利福尼亚理工学院的Hiroaki Shizuya实验室开发了3个不同的人 BAC文库(可从Open Biosystem获得)。Cal Tech B(CTB)和Cal Tech C (CTC)文库一起代表15X的基因组覆盖。Cal Tech D(CTD)文库代表人基 因组的17X的覆盖。整个保藏(collection)和单个克隆都是可得的。关于构 建这些文库的详细信息可在 http://informa.bio.caltech.edu/idx_www_tree.html找到。

文库概述

文库名称：CalTech人BAC文库D

文库缩写：CTD

生物体：智人

经销商：Invitrogen、Open Biosystem

载体类型：BAC

#克隆Clone DB：226,848

#末端序列Clone DB：403,688

#插入序列Clone DB：3,153

#具有两端序列的克隆：153,035

文库详细信息

DNA来源： 性别 细胞类型     雄 精子   文库构建 文库区段 载体名称 载体克隆位点   1 pBeloBACII HindIII   2-5 pBeloBACII EcoRI 文库统计 文库区段 Avg插入(kb) 盘(plate)范围   1 129 2001to2423   2 202 2501to2565   3 182 2566to2671   4 142 3000to3253   5 166 3254to4869

RPCI-11BAC

参考文献

·Osoegawa K,Mammoser AG,Wu C,Frengen E,Zeng C,Catanese JJ,de  Jong PJ；Genome Res.2001Mar；11(3):483-96；“A bacterial artificial  chromosome library for sequencing the complete human genome”；

·Osoegawa,K.,Woon,P.Y.,Zhao,B.,Frengen,E.,Tateno,M.,Catanese,J.J, and de Jong,P.J.(1998)；“An Improved Approach for Construction of  Bacterial Artificial Chromosome Libraries”；Genomics52,1-8；

·http://bacpac.chori.org/hmale11.htm，其描述以下BAC。

BAC可用性

RPCI-11BAC可自Invitrogen购得(见 http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/bac_clones_man.pdf)。

例如BAC或PAC的载体可以通过标准分子生物技术(例如重组工程， 见http://www.genebridges.com；EP129142和EP1204740)体外复制。例如， 重组工程可用于创建载体，其中编码感兴趣的人DNA的核苷酸序列侧翼 是一或多个序列，例如同源臂或位点特异性重组位点(例如，lox、frt或 rox)。在一个实施方式中，所述同源臂与来自用于产生所述脊椎动物的非 人脊椎动物基因组的DNA伸展(stretch)同源或相同。以这种方式创建的 载体可用于以将人DNA精确插入到非人脊椎动物基因组(例如，精确取 代所述脊椎动物基因组中的直系同源或同源DNA)的方法进行同源重组 (见，例如，US6638768，其公开内容以引文并入本文)。

其他有用的DNA和基因组操作技术是技术人员容易得到的，包括 US6461818(贝勒医学院)、US6586251(Regeneron)和WO2011044050(例 如，见实施例)中描述的技术。

用于构建其基因组包含转基因(例如，含有人V、J和任选地D区的 转基因抗体基因座)的非人脊椎动物和脊椎动物细胞的技术是本领域众所 周知的。例如，参见WO2011004192、US7501552、US6673986、US6130364、 WO2009/076464和US6586251，其公开内容以引文全部并入本文。

所有对于小鼠的核苷酸坐标(coordinate)来自关于小鼠C57BL/6J品系 的NCBI m37,April2007ENSEMBL Release55.37h。人核苷酸来自 GRCh37,Feb2009ENSEMBL Release55.37以及大鼠来自RGSC3.4 Dec2004ENSEMBL release55.34w。

在本发明的脊椎动物的一个实施方式中，所述脊椎动物是哺乳动物， 例如，啮齿动物。本发明的脊椎动物的一个实施方式中，所述脊椎动物 是小鼠、大鼠、兔、骆驼科动物(例如，无峰驼、羊驼或骆驼)或鲨鱼。

一方面，所述转基因抗体基因座包含受宿主调控序列或其他(非人、 非宿主)序列控制的人V、D和/或J编码区。一方面关于人V、D和/或J 编码区包括人内含子和外显子，或另一方面仅外显子无内含子，这可能 是在cDNA形式中。

或者，可以使用重组工程，或其他重组DNA技术，以将非人脊椎动 物(例如，小鼠)启动子或其他控制区，例如V区的启动子，插入到含有 人Ig区的BAC中。然后所述重组工程步骤将一部分人DNA置于小鼠启 动子或其他控制区的控制之下。

本发明还涉及细胞系(例如，ES或IPS细胞系)，其生长自或起源自 本文描述的细胞或脊椎动物，包括永生化的细胞系。所述细胞系可以通 过与肿瘤细胞融合而永生化以提供产生抗体的细胞和细胞系，或通过直 接细胞永生化制备。

在本发明任一构型的一方面，所述非人脊椎动物能够产生至少1×10⁶个不同的功能性嵌合抗体序列组合的多样性。

任选地，在本发明任一构型中，恒定区是所述脊椎动物内源性的， 以及任选地包含内源性转换。在一个实施方式中，所述恒定区包含Cγ区 和/或Sμ转换。转换序列是本领域已知的，例如，见Nikaido et al,Nature 292:845-848(1981)以及WO2011004192、US7501552、US6673986、 US6130364、WO2009/076464和US6586251，例如US7501552公开的SEQ ID NOs:9-24。任选地，所述恒定区包含内源性Sγ转换和/或内源性Sμ 转换。

在一个任选的方面，所述脊椎动物是小鼠，人抗体基因DNA(例如人 VDJ区)的插入靶向小鼠基因组IgH基因座中的J4外显子和Cμ基因座之 间的区域。一方面其插入于坐标114,667,090和114,665,190之间，适当 地，位于坐标114,667,091。一方面，人轻链κVJ的插入靶向小鼠第6号 染色体坐标70,673,899和70,675,515之间，适当地，位于70,674,734位， 或第16号染色体上的小鼠λ基因座中的等价位置。

参考非人脊椎动物恒定区上游的可变区的位置，意味着有合适的可 变和恒定的两个抗体部分的相关位置，使得可变和恒定区可以在所述脊 椎动物中体内形成嵌合抗体或抗体链。因此，插入的人抗体DNA和宿主 恒定区彼此可操作连接，用于抗体或抗体链生产。

一方面，插入的人抗体DNA能够通过同种型转换与不同的宿主恒定 区一起表达。一方面同种型转换不要求或包括反式转换。人可变区基因 插入在于相关宿主恒定区相同的染色体上意味着不需要反式转换以产生 同种型转换。

本发明中，任选地在功能性排列中以非人脊椎动物恒定区保持至少 一个非人脊椎动物增强子或其它控制序列，例如转换区，这样所述增强 子或其它控制序列的作用，如在宿主脊椎动物中所见，在所述转基因动 物中全部或部分发挥。设计这种方法以便可以对所述人基因座的完全多 样性(full diversity)进行取样，从而达到与用非人脊椎动物控制了例如增强 子所会达到的同样的高表达水平，这样在B细胞中的信号传导，例如用 转换重组位点的同种型转换，仍然使用非人脊椎动物序列。

具有这样的基因组的非人脊椎动物会产生具有人可变和非人脊椎动 物恒定区的嵌合抗体，但这些是容易人源化的，例如在以响应的人恒定 区取代小鼠恒定区的克隆步骤中。

一方面，在种系构型中，插入的人IgH VDJ区包含所有来自人的V、 D和J区以及中间序列。任选地，删除无功能的V和/或D和/或J基因区 段。例如，删除反向的或假基因VH。

一方面，将人IgH VDJ区的800-1000kb插入到非人脊椎动物IgH基 因座中，以及一方面插入940、950或960kb片段。适当地，这包括来自 人地14号染色体的105,400,051到106,368,585碱基(所有坐标参靠人基因 组的NCBI36，ENSEMBL Release54和小鼠基因组的NCBIM37，与小鼠 品系C57BL/6J有关)。

一方面，插入的IgH人片段由第14号染色体的105,400,051到 106,368,585碱基组成。一方面，插入的人重链DNA，例如由第14号染 色体的105,400,051到106,368,585碱基组成的DNA，插入到小鼠第12 号染色体小鼠J4区末端和Eμ区之间，适当地，在坐标114,667,091和 114,665,190之间，适当地，在坐标114,667,091。

一方面，在种系构型中，插入的人κVJ区包含全部来自人的V和J 区和中间序列。任选地，删除无功能的V和/或J基因区段。

适当地，这包括人第2号染色体的88,940,356到89,857,000碱基， 适当地，大约917kb。另一方面，轻链VJ插入物可以只包含V区段和J 区段最接近的簇。这样的插入物大约473kb。

一方面，人轻链κDNA，例如人第2号染色体第88,940,356位到第 89,857,000位碱基的人IgK片段，适当地插入到小鼠第6号染色体坐标 70,673,899和70,675,515之间，适当地，在70,674,734位。

一方面，在种系构型中，人λVJ区包含全部来自人的V和J区和中 间序列。适当地，这包括来自人第2号染色体选作κ片段的碱基的类似 碱基。任选地，删除无功能的V和/或J基因区段。

本文描述的所有特异性人抗体片段长度可变，并且例如可以比以上 限定的更长或更短，例如500碱基、1KB、2K、3K、4K、5KB、10KB、 20KB、30KB、40KB或50KB或更多，适当地，其包含全部或部分人V(D)J 区，同时优选地，酌情保持要求最终的插入物包含编码如本文所述的完 整重链区和轻链区的遗传材料。

一方面，最后插入的人抗体序列的3'末端，通常是最后的人J序列， 插入在与人/非人脊椎动物(例如，人/小鼠或人/大鼠)连接区距离小于2kb 的位置，优选地，小于1kb。

任选地，所述基因组在所述重链基因座和一或全部两个Igλ和Igκ基 因座是纯合的。

另一方面，所述基因组在一或多个轻链抗体基因座可以是杂合的， 例如对于编码嵌合抗体链和天然(宿主)抗体链的DNA而言是杂合的。一 方面，所述基因组对于能够编码2个不同的由本发明的免疫球蛋白转基 因编码的抗体链(例如，包含2个不同的嵌合重链或2个不同的嵌合轻链) 的DNA而言可以是杂合的。

在本发明任一构型的一个实施方式中，修饰所述脊椎动物的基因组 以防止或降低完全内源性抗体的表达。进行这样操作的合适的技术的例 子可在WO2011004192、US7501552、US6673986、US6130364、 WO2009/076464、EP1399559和US6586251中找到，其公开内容以引文 并入本文。在一个实施方式中，失活内源性重链免疫球蛋白基因座的非 人脊椎动物VDJ区，以及任选地，内源性轻链免疫球蛋白基因座(λ和/ 或κ基因座)VJ区。例如，通过在哺乳动物内源性重链疫球蛋白基因座中 进行倒置失活全部或部分非人脊椎动物VDJ区，任选地，所述倒置通过 将反向区移至内源性Ig基因座上游或下游进行。例如，通过在哺乳动物 内源性κ链免疫球蛋白基因座中进行倒置失活全部或部分非人脊椎动物 VJ区，任选地，所述倒置通过将反向区移至内源性Ig基因座上游或下游 进行。在一个实施方式中，所述内源性重链基因座以种方式失活，一或 全部两个内源性κ和λ基因座也是如此。

另外或可选地，所述脊椎动物在防止产生成熟的宿主B和T淋巴细 胞的遗传背景下产生，任选地RAG-1缺陷和/或RAG-2缺陷背景。产生 RAG-1缺陷动物的技术见US5859301。

在本发明任一构型的一个实施方式中，通过全部或部分人IgH基因 座提供人V、J和任选的D区；任选地，其中所述全部或部分人IgH基 因座包括基本上全部人IgH V、D和J区以及中间序列的库。人IgH基因 座的合适的部分在WO2011004192中公开。在一个实施方式中，所述人 IgH部分包括来自人第14号染色体的第105,400,051位到第106,368,585 位碱基(来自NCBI36的坐标)，或任选地，由其组成。另外或可选地，任 选地，其中所述脊椎动物是小鼠或所述细胞时小鼠细胞，所述人V、J和 任选的D区插入到小鼠第12号染色体对应于坐标114,667,091和 114,665,190之间位置的位置，任选地，在坐标114,667,091处(来自 NCBIM37的坐标，与小鼠品系C57BL/6J有关)。

在本发明的脊椎动物或细胞的任一构型的一个实施方式中，当所述 脊椎动物是小鼠时，(i)小鼠基因组的各转基因重链基因座包含恒定区， 其包含小鼠或大鼠Sμ转换和任选地，小鼠Cμ区。例如利用小鼠内源性 恒定区提供所述恒定区，例如，通过插入人V(D)J区与小鼠基因组或小 鼠细胞基因组的内源性恒定区可操作连接提供。

在本发明的脊椎动物或细胞的任一构型的一个实施方式中，当所述 脊椎动物是大鼠时，(i)大鼠基因组的各转基因重链基因座包含恒定区， 其包含小鼠或大鼠Sμ转换和任选地，大鼠Cμ区。例如利用大鼠内源性 恒定区提供所述恒定区，例如，通过插入人V(D)J区与大鼠基因组或大 鼠细胞基因组的内源性恒定区可操作连接提供。

在本发明的脊椎动物或细胞(系)的任一构型的一个实施方式中，所述 基因组包含λ抗体转基因，所述转基因包含全部或部分人Igλ基因座，所 述基因座包括至少一个人Jλ区和至少一个人Cλ区，任选地，二或多个J_λ1、 J_λ2、J_λ6和J_λ7，任选地，所有J_λ1、J_λ2、J_λ6和J_λ7。所述人λ免疫球蛋白 基因座包含由连续的J-C簇构成的唯一基因。为利用这一特征，本发明 在任选的方面中采用一或多个这种人J-C簇在所述转基因中与恒定区不 可操作连接，例如，所述转基因中恒定区是所述非人脊椎动物或非人脊 椎动物细胞(系)内源性的。因此，任选地，所述转基因包含至少一个人J_λ-C_λ簇，任选地，至少J_λ7-C_λ7。可以通过使用全部或部分人λ基因座协助这 样的转基因的构建，这样在种系构型中，所述转基因包含一或多个J-C 簇，有利地，还包括人基因座中簇之间和/或临近的J和C区之间的中间 序列。这保留了中间序列中任何调控元件，所述调控元件可以涉及VJ和 /或JC重组并且可以被AID(activation-induced deaminase)或AID同系物 识别。

当内源性调控元件涉及所述非人脊椎动物中的CSR(class-switch  recombination)时，这些调控元件可以通过再转基因中包括恒定区而保留， 所述恒定区是所述非人脊椎动物内源性的。在本发明的第一构型中，可 以通过使用所述脊椎动物内源性的AID或AID同系物或其功能性突变进 行匹配。这样设计的元件有利于使SHM(somatic hypermutation)的酶谱和 /或CSR最大化，从而使抗体多样性的潜力最大化。

任选地，所述λ转基因包含人Eλ增强子。任选地，所述κ转基因包 含人Eκ增强子。任选地，所述重链转基因包含人重链增强子。

在本发明任一构型的一个实施方式中，所述或各抗体转基因的恒定 区是所述非人脊椎动物内源性的或源自这样的恒定区。例如，所述脊椎 动物是小鼠或所述细胞时小鼠细胞，并且所述恒定区是小鼠内源性的。 例如，所述脊椎动物是大鼠或所述细胞时大鼠细胞，并且所述恒定区是 大鼠内源性的。

在本发明任一构型的一个实施方式中，各重链转基因包含多个人IgH V区、多个人D区和多个人J区，任选地，基本上全部人IgH V、D和J 区的库。

在本发明任一构型的一个实施方式中，对于所述脊椎动物：

(i)各重链转基因包含基本上全部人IgH V、D和J区的库；以及

(ii)所述脊椎动物基因组包含基本上全部人IgκV和J区的库和/或基 本上全部人IgλV和J区的库。

一方面提供B细胞、杂交瘤或干细胞，任选地，胚胎干细胞或造血 干细胞，其源于本发明任一构型的脊椎动物。在一个实施方式中，所述 细胞是BALB/c、JM8或AB2.1或AB2.2胚胎干细胞(见WO2011004192 中合适的细胞的讨论，尤其是JM8和AB2.1细胞，其公开内容以引文并 入本文)。

一方面所述ES细胞源自小鼠BALB/c、C57BL/6N、C57BL/6J、129S5 或129Sv品系。

一方面所述非人脊椎动物是啮齿动物，适当地，是小鼠，并且本发 明的细胞(细胞系)是啮齿动物细胞或ES细胞，适当地，是小鼠ES细胞。

本发明的ES细胞可以用于使用本领域众所周知的技术产生动物，所 述技术包括将ES细胞注射入囊胚，然后将嵌合型囊胚移植到雌性体内以 产生后代，其可繁殖并选择具有需要的插入的纯合重组体。一方面，本 发明涉及包含ES细胞来源的组织和宿主胚胎来源的组织的转基因动物。 一方面，本发明涉及遗传改变的后代动物，其包括具有对于VDJ和/或 VJ区而言纯合的重组体的动物。

一方面提供分离抗体或编码所述抗体的核苷酸序列的方法，所述方 法包括

(a)以人目标抗原免疫(见例如Harlow,E.&Lane,D.1998,第5版, Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Lab.Press,Plainview, NY；and Pasqualini and Arap,Proceedings of the National Academy of Sciences(2004)101:257-259)本发明任一构型或方面的脊椎动物，这样所 述脊椎动物产生抗体；以及

(b)从所述脊椎动物分离特异性结合所述抗原的抗体和/或编码所述 抗体至少重链和/或轻链可变区的核苷酸序列；

任选地，其中所述抗体的可变区随后与人恒定区连接。这样的连接 可以被本领域容易获得的技术影响，例如使用常规重组DNA和RNA技 术，这对技术人员而言是显然的。见例如Sambrook,J and Russell,D.(2001, 第3版)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Lab. Press,Plainview,NY)。

适当地，给予产生免疫性的剂量的人表位或目标抗原。本发明还涉 及检测人表位或目标抗原的方法，其包括用次级检测剂检测如上所述产 生的测试抗体，所述检测剂识别该抗体的部分。

步骤(b)中的抗体分离可以使用常规抗体选择技术实施，例如筛选 (panning)针对固定在固态支持物上的抗原的抗体，任选地，以提高的严 格性进行多个相互作用轮次，这对技术人员而言是显然的。

作为另一个任选的步骤，在步骤(b)之后，突变抗体的重链和/或轻链 可变区的氨基酸序列以提高与所述抗原结合的亲和力。突变可以通过常 规技术产生，所述常规技术对技术人员而言是显然的，例如，通过易于 出错的PCR。可以通过常规技术测定亲和力，所述常规技术对技术人员 而言是显然的，例如，通过表面等离子体共振，例如，使用Biacore^TM。

另外或可选地，如另一个任选的步骤，在步骤(b)之后，突变检测抗 体重链和/或轻链可变区的氨基酸序列以改良所述抗体的一或多种生物物 理学特性，例如，熔解温度、溶液状态(单体或二聚体)、稳定性和表达(例 如，在CHO中或大肠杆菌(E.coli)中)中的一或多种。

一方面提供本发明的抗体，任选的用于医学用途，例如，用于在病 人(例如，人)中治疗和/或预防医学病症或或疾病。

一方面提供编码本发明抗体的核苷酸序列，任选地，其中所述核苷 酸序列时载体的部分。适当的载体对技术人员而言是显然的，例如，常 规昂提表达载体，其包含与一或多个表达控制元件可操作连接的所述核 苷酸序列。

一方面提供药物组合物，其包含本发明的抗体和稀释剂、赋形剂或 载剂，任选地，其中所述组合物位于IV容器(例如，IV袋)或与IV注射 器连接的容器内。

一方面提供本发明的抗体在生产用于在病人(例如，人)中治疗和/或 预防疾病或病症的药物的用途。

另一方面，本发明涉及根据本发明产生或测定的人源化抗体和抗体 链(嵌合的和完全人源化形式的抗体和抗体链)以及所述抗体的医学用途。 本发明还涉及包含这样的抗体的药物组合物和药物可接受载剂或其它赋 形剂的药物组合物。

本文考虑通过存在人蛋白质编码区的功效来人源化含有人序列的抗 体链，例如嵌合的人-非人抗体链。从编码本发明的嵌合抗体链的DNA 开始，使用标准技术可以产生完全人抗体。

产生单克隆和多克隆抗体的方法是本领域众所周知的，而本发明涉 及多克隆和单克隆嵌合的或完全人源化的抗体，所述抗体应答抗原攻击 (challenge)而在本发明的非人脊椎动物中产生。

在又再一个方面，操作本发明中产生的嵌合抗体或抗体链，适当地， 在DNA水平，以产生具有抗体样性质或结构的分子，例如来自缺失恒定 区的重或轻链的人可变区，例如结构域抗体；或具有任何来自相同或不 同物种的重或轻链的恒定区的人可变区；或具有非天然存在恒定区人可 变区；或与其他融合伴侣一起的人可变区。本发明涉及所有这样的嵌合 抗体衍生物，其源自根据本发明鉴定、分离或测定的嵌合抗体。

可以理解，本文描述的特别的实施方式是为了说明而非限制本发明。 本发明的主要特征可以在各实施方式中采用，而不脱离本发明的范围。 仅适用于常规研究，本领域技术人员将认识，或能够确定许多本文描述 的特定方法的等价物。这样的等价物被认为在本发明范围内，并被权利 要求书覆盖。说明书中提到的所有出版物和专利申请是象征本发明所属 领域技术人员的技术水平的。所有出版物和专利申请以引文并入本文， 其程度与各出版物和专利申请以引文并入特别和单独表明的相同。当在 权利要求书和/或说明书中用于与术语“包含”连接时，词语“一个(a)” 或“一个(an)”的使用可以意味着“一个(one)”，但其也意味着“一或多 个”、“至少一个”和“一或多于一个”。权利要求书中术语“或”的使用 意味着“和/或”，除非明确说明仅涉及二者选一或二者是相互排斥的，尽 管公开的内容支持仅涉及二者选一和“和/或”的限定。贯穿本申请，术 语“大约”用于说明一个值包括对以下特征的固有的误差变化。

如在本说明书和权利要求中所用，词语“包含(comprising)”(以及其 任何形式，例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)” (以及其任何形式，例如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)” (以及其任何形式，例如“包括(include)”和“包括(includes)”)或“含有 (containing)”(以及其任何形式，例如“含有(contain)”和“含有(contains)”) 是包括性或开放性并且不排除另外的、没有列举的元件或方法步骤。

如本文所用，术语“或其组合”涉及该术语之前所列举的条目的所 有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”意指包括A、B、C、AB、 AC、BC或ABC，以及如果顺序在特定上下文中是重要的，好包括BA、 CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。以此例子继续，明显地包 括含有一或多个条目或术语的重复的组合，例如BB、AAA、MB、BBC、 AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等等。本领域技术人员会理解，典 型地，任何组合中的条目或术语的数量是没有限制的，除非上下文另外 明确。

此公开内容的任何部分可以与所述公开内容的任何其它部分结合理 解，除非上下文另外明确。

本文公开的和要求保护的所有组合物和/或方法可以根据本发明公开 内容无需过度实验而制备和实行。当本发明的组合物和方法以优选的实 施方式的术语描述时，对本领域技术人员而言显然的是以本文描述的方 法的步骤或步骤的序列可以对所述组合物和/或方法应用变异，而不脱离 本发明的概念、精神和范围。所有这样的相似的对本领域技术人员而言 显然的替换和修饰视为在所附的权利要求限定的本发明的精神、范围和 概念的范围内。

本发明在下列非限制性范例中更详细地描述。

实施例

下列实施例有助于证明本发明。

内源性IgH基因的失活和ADAM6功能的保持

实施例1：易位

参加图1a，显示第12号染色体具有转基因重链基因座。在该图中， 显示插入的人V_H基因区段(但为了清楚，人D和J_H，小鼠Eμ增强子和 其它J-C内含子元件以及恒定区没有显示，但这些处于人V_H基因区段下 游，即在V_H左侧)。还显示了第12号染色体上人V_H和小鼠VDJ区之间 的loxP位点(在这种情况中，loxP由“着陆垫(landing pad)”提供)；见， 例如WO2011004192，其公开内容以引文并入本文)。带有与着陆垫中loxP 位点方向相同的loxP位点的盒以非第12号染色体的染色体的端粒区为目 标；在这种情况中，如图1a所示靶向第15号染色体。带有Cre重组酶 基因的载体被导入细胞。在诱导Cre重组酶表达之后，loxP位点和端粒 之间的区交换，这导致内源性小鼠V_H、D和J_H基因区段与其增强子和C 区分离(图1b)，以及因此，失活内源性重链。在此方法中，Adam6a和 Adam6b的上游和下游基因组序列(其包括这两个基因相关的调控元件)扔 保持完整。因此，在这种情况中，第15号染色体上的内源性Adam6基 因保持功能(图1b)。

实施例2：Adam6基因的删除和插入

产生转基因抗体的小鼠的产生

用ES细胞技术和遗传操作产生转基因小鼠以导入与内源性小鼠重 链和κ恒定区分别直接可操作连接的人抗体重链和κ链V、D和J区段。 在如此产生的重链转基因基因座中提供小鼠μ转换和μ恒定和γ区。失 活内源性小鼠重链和κ链表达；任选地，通常使小鼠λ链表达失活5％或 更少。用本领域已知的同源重组和/或重组酶接到的盒交换(RMCE)将人抗 体基因区段导入小鼠ES细胞。可以用本领域已知的BAC和重组工程技 术操作人DNA。含有人抗体基因DNA的BAC可以从Invitrogen获得。 适当的ES细胞是129、AB2.1或AB2.2(可以从贝勒医学院获得)。

转基因ES细胞随后移植到来自养母小鼠的囊胚中(例如，129或 C57BL/6N小鼠品系)。可以产生并杂交重链和κ链品系以提供产生抗体 的小鼠，其具有纯合的和人可变区一起的转基因重链和κ链(HK小鼠)。

使用相似的方案，产生λ链品系，并且通过杂交产生HKL小鼠，其 具有纯合的和人可变区一起的转基因重、λ和κ链。

进一步的指导公开于WO2011004192、US7501552、US6673986、 US6130364、WO2009/076464和US6586251，其公开内容以引文全文并 入本文。

为通过同源重组导入人重链基因区段，使用标准技术例如重组工程 产生一或多个BAC。通过BAC修饰构建含有基因组IGH基因区段(V_Hs、 Ds和J_Hs)、选择标记和两个与内源性IGH序列同源的侧翼重组臂(5'和3') 的巨大的DNA靶向载体(图2；h1＝含有人基因区段的第一BAC；m1＝小 鼠VDJ区的同源区；诸如此类h1、h2、m2和m3)。所述巨大的靶向载 体通过电穿孔导入小鼠ES细胞。用药物或其它常规的用做选择标记的标 记选择所靶向的ES细胞。通过同源重组的正确靶向通过以定量或定向 PCR为基础的方法确认。正确靶向的基因座导致侧翼为那两个同源重组 臂的内源性基因组DNA的取代，其中内源性基因座的这一部分由人基因 组IGH基因区段和选择标记取代。

所述人抗体重链基因区段(图3中的“h”)还可以使用标准的重组酶 介导的基因组取代插入(图3)。在这样一种方法中，一个loxP位点和突变 型loxP位点(例如lox511)随后靶向到小鼠IGH基因座。通过BAC修饰 构建含有人基因组IGH基因区段(V_Hs、Ds和J_Hs)和选择标记的，侧翼为 一个loxP位点和另一个突变型loxP拷贝的巨大的DNA靶向载体。所述 巨大的靶向载体与Cre表达载体共同电穿孔入ES细胞。正确靶向通过以 定量或定向PCR为基础的方法进一步确认。正确靶向的基因座导致侧翼 为那两个loxP的内源性抗体基因座基因组DNA的取代，其中所述内源 性基因座的这一部分(图3中的“m”)以人基因组IGH基因你和选择标记 取代。

在这两个取代过程中(通过同源重组或RMGR取代)，删除了VH5-1 和D1-1基因区段之间的内源性小鼠Adam6基因。通过ES细胞或受精卵 中的靶向或随机插入将含有Adam6外显子(Adam6a-2507bp； Adam6b-2271bp)还有其各自至少5kb上游序列和5kb下游序列的基因组 DNA插入到小鼠基因组以挽救如实施例3的Adam6删除的小鼠的雄性育 性。

实施例3：删除内源性IGH后将Adam6基因插入到基因组的方法

自细菌人工染色体(BAC)，RP23-393F3(Invitrogen)恢复小鼠Adam6a (第12号染色体：坐标114777119-114789625)和小鼠Adam6b(第12号染 色体：坐标114722756-114735229)基因组DNA。通过以下步骤产生ES 细胞靶向载体。

1、用阳性选择标记盒删除小鼠Adam6a和Adam6b之间的序列。

a.通过使用RP23-393F3作为模板的PCR创建位于Adam6a上 游约5kb的5'臂和位于Adam6b基因下游约5kb的3'臂。这两个同 源臂都在200bp到300bp之间，随后将这两个同源臂克隆到基于 pBlueScript II SK(+)的质粒中以建立删除载体，所述pBlueScript II SK(+)含有阳性选择标记杀稻瘟素(Bsd)，其侧翼为两个AscI位点。

5'臂：

5'-tatgttgatggatttccatatattaaaccatccctgcatccctggga tgaagcctacttggtcatgatagacgattgttttgatgtgttcttggat tcagttagtgagaaatatattgagtatttttacatcgatattcataagg gaaattggtctgaagttctctttctttgttgggtctttatgtggtttag ttatca-3'

3'臂：

5'-tgattccaccagaggttcttttatccttgagaagagtttttgctatc ctaggttttttgttattccacatgaatttgcagattgctctttctaatt ccttgaagaattgagttggaatttgatggggattgcattaaatctgtag attccttttggcaagacagccatttttacaatgttaatcctgccaatcc atgagcatgg-3'

b.通过将Bsd盒靶向到RP23-393F3删除小鼠Adam6a和 Adam6b之间的序列(图4c)。在这样的重组工程的产物中，还保留 了Adam6a和Adam6b的各约5kb上游序列和约5kb下游序列以维 持其在小鼠细胞中的表达的特异性调控。

2、通过同源重组将Adam6a和Adam6b恢复到IGH BAC的5'修饰载 体。

a.通过使用RP23-393F3作为模板的PCR创建位于Adam6a上 游约5kb的5'臂和位于Adam6b基因下游约5kb的3'臂(图5a)。

5'臂：

5'-tttatgtactataccatctcagaaagtcaggttagtctcactagcat cgtaaaagctctgtctgggcttttccatctgctctgctttttgtctctg tgtctaaaaatatataaaccaatgttgtccagccaaaaaaaaaaaatta aagagcaaaaggaggtaaaatggatacaaattggaaaagaagaaatcaa aatatcactacttgaagatagtataatatatttaactgaccacaaaaat tccaccagaaaactcctaaacctgataaacaaactcagaaaaatggcta gatataaactta-3'

3'臂：

5'-acccatagagagaaaacaggtgagttagtgcattaaaggggctgagc agggagttctcatcgctccccagcaccagaaataagagcctctccggag ctgctgggacatggaatgcagatgattcggaccatcagccccacagaga cctttcccactctggctcagaaagaggcactggaccacagttggagagg agaatcgaaagctgatatctctgtattcacttagcctgttacccaccca tgcacccaagtccaaggtgggagaaacactgagggtctaaacacagccc cagagcaactgccagtattaaat-3'

b.将两个同源臂克隆到5'修饰载体中(所述载体基于pBR322)。 此5'修饰载体具有sopC基因(确保各子代细胞得到一个拷贝质粒 所需的)、同源臂、loxP、Neo盒、loxP2272、PGK启动子、PB5'LTR 和最终人IGH BAC的序列如下的同源臂：

5'-attcaggcagttaattgttgggttcatgttttacaactaaagaataa attcaggccagatgcagtggatcatcgctataatcacaccactttcaga agcaaaaatgagggaaatcccgtgagacgaggcaatcgaagccaacctg agcaacataaagagatgctatttctctgaaaaaatattttaaagaataa gcaggtgaggggtggcgttcccctctacttctagatactcaggaagcaa agatgggaagattatgtgagccaggtgttcaaaattacagtgagctttg atcatacaactgttcttcaaactgtgcaacagggtgagagcctgtctct aaaaacaaataaaaaagaatcaat-3'

c.通过标准的重组工程将从Adam6a上游约5kb到Adam6b基 因下游约5kb的BAC序列恢复到IGH BAC的5'修饰载体(图5c)。

d.恢复之后，通过移除Bsd基因构建靶向载体，所述移除通过 AscI消化和自连进行(图5d)。

3、通过标准重组工程奖具有5'修饰盒的恢复的Adam6a和Adam6b (图6a)靶向到IGH BAC中以产生最终的IGH BAC(图6c)。

通过重组酶介导的盒交换(RMCE)将连同最终的人IGH BAC的小鼠 Adam6a和Adam6b插入到小鼠基因组中，如图7a到7c所示，并且如 WO2011004192(其以引文形式并入本文)所述。依据本发明，插入的 Adam6a和Adam6b可以挽救Adam6缺陷表型。

实施例4：包含ADAM6基因的可育小鼠和子代

使用重组工程和ES细胞基因组操作，将小鼠AB2.1胚胎干细胞基因 组工程化以将不同的库的人可变区基因区段插入内源性IgH基因座中的 内源性小鼠恒定区的上游，从而功能性取代内源性小鼠可变区。从IgH 基因座中删除内源性VDJ区，从而从该基因座移除Adam6a和Adam6b 基因。

将具有野生型启动子的表达性小鼠Adam6a和Adam6b基因插入到小 鼠第12号染色体上的IgH基因座上游。产生子代小鼠，其对于IgH转基 因而言是杂合的(即，其基因组具有一个拷贝转基因IgH基因座和另一个 无功能IgH基因座)。获得可育的杂合小鼠并一起繁殖以产生纯合子代。 这些子代对于具有ADAM6删除的IgH转基因而言是纯合的，并且对于 插入的小鼠ADAM6a和6b基因而言也是纯合的。此外，我们获得了可 育的雄性和雌性纯合子，其可以培养并产生子代。总结如下。

产生了3个不同的纯合品系：IgH1小鼠；IgH2小鼠和IgH3小鼠。 这些小鼠对于从ADAM6基因的删除而言是纯合的，所述删除是自内源 性小鼠IgH基因座删除；对于第12号染色体上(IgH基因座上游)的小鼠 ADAM6a和ADAM6b基因的插入而言是纯合的；以及对于下列重链转基 因而言是纯合的。

IgH1转基因：

包含人重链基因区段V_H2-5、V_H7-4-1、V_H4-4、V_H1-3、V_H1-2、V_H6-1、 D1-1、D2-2、D3-9、D3-10、D4-11、D5-12、D6-13、D1-14、D2-15、D3-16、 D4-17、D5-18、D6-19、D1-20、D2-21、D3-22、D4-23、D5-24、D6-25、 D1-26、D7-27、J_H1、J_H2、J_H3、J_H4、J_H5和J_H6。

IgH2转基因：

包含人重链基因区段V_H3-13、V_H3-11、V_H3-9、V_H1-8、V_H3-7、V_H2-5、 V_H7-4-1、V_H4-4、V_H1-3、V_H1-2、V_H6-1、D1-1、D2-2、D3-9、D3-10、 D4-11、D5-12、D6-13、D1-14、D2-15、D3-16、D4-17、D5-18、D6-19、 D1-20、D2-21、D3-22、D4-23、D5-24、D6-25、D1-26、D7-27、J_H1、J_H2、 J_H3、J_H4、J_H5和J_H6。

IgH3转基因：

包含人重链基因区段VH2-26、VH1-24、VH3-23、VH3-21、VH3-20、 VH1-18、VH3-15、V_H3-13、V_H3-11、V_H3-9、V_H1-8、V_H3-7、V_H2-5、V_H7-4-1、 V_H4-4、V_H1-3、V_H1-2、V_H6-1、D1-1、D2-2、D3-9、D3-10、D4-11、D5-12、 D6-13、D1-14、D2-15、D3-16、D4-17、D5-18、D6-19、D1-20、D2-21、 D3-22、D4-23、D5-24、D6-25、D1-26、D7-27、J_H1、J_H2、J_H3、J_H4、J_H5 和J_H6。

为评估小鼠是否能够繁殖，我们在纯合子雄性和可育的雌性小鼠之 间设置了如下的各种测交：

因此，我们可以表明对于所述重链转基因和内源性VDJ删除而言杂 合或纯合的可育的雄性和雌性小鼠的产生。此外，这些小鼠对于插入的 ADAM6而言是杂合或纯合的。

另外，测交的每窝幼崽数与用野生型雄性交配(8.1±3.1只小鼠)相比 没有显著变化(所有测交平均为7.7±3.5只小鼠)。

在进一步的实验中，我们以人抗原免疫了纯合的测试小鼠，并发现 特异性免疫应答。初始免疫-加强(prime-boost)和RIMMS免疫方案都进行 了使用。我们从这些小鼠分离了抗原特异性B细胞和抗体，还有编码这 些抗体及其链和可变区的核苷酸序列。此外，我们成功地从这些抗原特 异性B细胞生产了杂交瘤。

大鼠

褐家鼠(Rattus norvegicus)

Adam6

NCBI参考序列：NM_138906.1

SEQ ID NO:1

ATGTTATCTCTGACCTGGGGTATGAAGCTAGTGGAAAGATCTGTGGTCCCCAGGGTCCTCCTCTTGCTCTTTG CACTCTGGCTGCTCCTCCTGGTTCCAGTCCGGTGTTCTGAAGGCCACCCCACTTGGCGCTACATCTCATCAGA GGTGGTTATTCCTCGGAAGGAGATCTACCACAGCAAAGGAATTCAAACACAAGGACGGCTCTCCTATAGCTTG CGTTTTAGGGGCCAGAGACATATCATCCACCTGCGAAGAAAGACACTAATTTGGCCCAGACACTTGTTGCTGA CAACTCAGGATGACCAAGGAGCCTTACAGATGGATTACCCTTTTTTCCCTGTAGATTGTTACTATTTTGGCTA CCTAGAGGGAATCCCTCAATCCATGGTCACTGTGAATACTTGCTATGGAGGCCTGGAAGGGATCATGATGTTG GATGACCTTGCCTATGAAATCAAACCCCTCAACGATTCACAGGGGTTTGAACACATTGTTTCTCAGATAGTAT CAGAGCCTGATGTAACAGGGCCTACAAATACATGGAAACGCTTGAACCTTAATACAGGTCCTCCCTTATCCAG GACAGAGTATGCCAATGGAACTCCCAGAATGTCTAGTAAGAACTACGCTTCACATCCAGCTGCTATAAAAGGC CAATTCCAAGCAACTAATTCTATATATAAGGAAAGCAACAATATTGATACTGCGGCCAGGTATTTGTTTGAGC TCCTTAGTATAACGGACAGCTTTCTGATCACTATTCATATGCGGTACTATGCTATTCTCTTAACTGTGTTTAC CGAGAGCGATCCATTTGCACTAGAGTATACGGTACCAGGGGGCTCTATTTATAACTATTATGTGTCTAACTTT TTTAATCGGTTGAGGCCTGATGCATCAACCGTACTTAATAAAGATGGGCCCTCGGATAACGACTTTCATCCAG TTGAACAGAGTTTATGTACTCCCGCAGGCCTGACGATTGTTGGTCAACACAGACGAAGTTTTCTAGCTCTATC TGTTATGATCACCAATCGTATTGCGATGTCTTTAGGTATAAAAGCTGATGATGAGACTTACTGCATCTGCCAC AGAAGGACCACTTGCATTATGTACAAAAACCCTGAAATAACAGATGCTTTCAGCAATTGCTCCCTTGTGCAGA TAAACCAGATACTGAATACCCCTGGTACAATGTCATGCCTTTTCTATGACCACCATGTTTATCATAATATAAC AAAAACCTACAGGTTTTGTGGAAACTTCAAGATAGATATCGGTGAGCAGTGTGACTGTGGCTCACATAAGGCA TGTTACGCAGATCCCTGCTGCGGAAGTAATTGCAAGTTAACTGCTGGTAGCATTTGTGATAAAGAATTATGCT GTGCAAACTGCACCTACAGTCCTTCTGGGACACTCTGCAGACCGATCCAGAACATATGTGATCTTCCAGAATA CTGTAGTGGGAATAATATCTTTTGCCCTGCAGACACTTATCTGCAAGATGGGACGCCATGCTCAGAAGAGGGG TACTGCTATAAAGGCAACTGCACAGATCGCAGTGTGCAGTGCAAGGAAATCTTTGGTATGAATGCTAAGGGTG CTAATATCAAGTGCTATGACATCAACAAACAACGGTTTCGATTTGGGCACTGCACTAGAGCACAAGAGAGCCT CATGTTTAATGCTTGCTCTGATCATGATAAACTGTGTGGAAGGCTGCAGTGTACCAACGTCACCAATCTTCCA TTCCTGCAGGAACATGTTTCATTCCATCAATCGGTTATCTCTGGGTTTACCTGCTTTGGGCTTGATGAACATC GTGGGACAGAAACAACGGATGCTGGGCTGGTGAAACATGGTACCCCTTGCTCCCAAACTAACTTCTGCGATCG AGGAGCTTGCAATGGAAGTTTATCTCGGTTGGATTATGACTGCACCCCAGAAAAATGCAATTTTAGAGGAGTG TGTAATAATCATCGGCATTGCCATTGTCATTTAGGTTGGAAACCTCCTCTGTGCAGAGAGGAGGGGCCTAGCG GGAGCACGGACAGTGGGTCCCCTCCGAAGGAAAGGCGCACAATAAAACAGAGCAGAGAACCACTGTTATATTT AAGAATGCTCTTTGGTCGTCTTTATTTATTCATTGTCTCGCTGCTCTTTGGAGTGGCCACTCGCGCAGGAGTT ATTAAGGTCTTTAAGTTTGAAGACTTGCAAGCTGCTCTGCGGGCTGCACAAGCCAAGGCGACTTAA

兔

家兔(Oryctolagus cuniculus)

Adam6

NCBI参考序列：NM_001165916.1

SEQ ID NO:2

ATGGTGCTGGCAGAAGGACAGGTCACGCTGCTCCTGCTTGGGCTCTGGGTGCTCCTAGACCCAGGTCAGTGT TCCCCAGGCCGCCCCTCCTGGCGCTATGTCTCATCTGAGGTGGTGATTCCTCGGAAGGAGCTGCACCAGGGC AGAGGTGTTCAGGTAGCAGGCTGGCTCTCCATCAGCCTGCACTTTGGGGGCCAAAGACACGTCATCTGTATG CGGAGCAAGAAGCTTATTTGGGCCAGACACCTGATGATGATGACCCAAGATGACCAAGGAGCGTTGCAGATG GACTATCCTTACATTCCTACAGACTGTTACTACCTCGGCCACCTGGAAGACATTCCTCTGTCCACCGTCACC ATTGACACGTGCTATGGGGGCCTGGAAGGCATCATGAAGTTGGATGACCTCGCCTATGAAATCAAACCCCTC AAGGACTCCAACACATTTGAACACGTTGTGTCTCAGATCGTGGCCGACCGCAATGCCACGGGACCCATGTAC AGACTGGAACACGAGGACGATTTTGACCCCTTCTTCTCCGAGGTAAACAGTAGTGTGGCTCCCAAGCTCTCT AGTTTCAACCACATGTACCACATGGCCCAATTGAAAGGTCAAATTCAAATAGCCCACGAAATGTATACGGTA CTCAACAATATTTCAAAATGCATCCAATTTTCAATAAACATGTTTAGTATTATTGACAGTTTTCTGAGAGGA ATTGGCTTTAGGCACTATATTGCTCTCCTAAACATATACAACCAGCAAGAGCCAGTCGTTATGAATGATTTT CGGGTTCCTGGCGGTCCAATCCATGCTTATTATAAAGCGAATTTTCATGACATCTACCGCCCTTCTCCATCG ACATTGATTACAAGAAATGCACCAAATGATGATTACCAAGAACCCGCTAGGTATGGCACCTGTGGCCATCAT AACTTGCTTATCATTGGTTCCCAGGGCAGACATTATCTCCTGTTGGCTATTTTAACTACACATAAAATTGCA CGACAGATAGGGTTAGCATATGACTACAGTGTCTGTGTGTGCCAGAGAAGAGCAACCTGCTTGATGAGGAAA TTCCCTGAAATGACAGACTCGTTCAGTAACTGCTCTTTTGTCCATACACAACATATAGTTTCAAACAGATAT ATTTTTACATGCTATTACTTCACAGATAGGACGTACATGAATAAAACCCTGATACAGACGCGCTGTGGAAAC TTTTTAGTGGAAGAAAGGGAGCAATGTGATTGTGGCTCCTTCAAGCATTGTTATGCCAATGCATGCTGTCAA AGCGACTGTCGCTTCACACCTGGAAGTATTTGTGATAAACAACAATGCTGCACAAACTGCACCTACTCCCCC ACTTCAACCCTCTGCAGACCTGTCATGAACATATGTGATCTTCCAGAGTACTGTGGGGGGTCCACCTACACA TGCCCTGAAAATTTTTATTTGCAAGACGGAACCCCGTGCACTGAAGATGGTTACTGCTACAGAGGGAACTGC TCTGACCCCACTATGCACTGCAAGGAGATCTTTGGTCAAAGTGCTGAGAATGGTCCTGCGGATTGCTATGCC ATAAATCTCAACACCTTCCGATTTGGACATTGTAGAAGAGAGCAACATCAGAACGTTTACCATGCTTGTGCT GCACAAGACAAGGAGTGTGGAAGGCTACAGTGCATCAATGTCACCCAGCTTCCTCAGTTGCAGGATCATGTT TCATTCCATCAGTCTGTGTACAATGAGTTCACCTGTTTTGGACTGGATGAACACCGGTCAACAGGATCAACT GATGCTGGACGTGTGAGAGATGGTACTCCCTGTGGGGAAGGACTTTTCTGTCTTGAGAGCAGATGCAACATG ACTATGCTTAACCTGCATTACGACTGTTTCCCTGAGAAGTGCAGTTTTAGAGGACTTTGCAACAATAACAAG AATTGCCACTGCCATGTTGGCTGGGACCCCCCACTGTGCCTGAGTCCGGGTGCTGGTGGGAGCTCACAAAGC GGGCCCCCTCCAAGGAGAATGCGCACAGTCACAGATAGCATGGAGCCAATTCTTTATTTAAGAGTGGTCTTT GCTCGTGTTTATTGTTTTATTTTTGCACTGCTCTTTGGGGTAGCCACTAATGTGCGAACGATTAAGACTACC ATTGTCCAGGAACAAACAGTTAATGAGCCACAGTAA

小鼠

小家鼠(Mus musculus)

Adam6a

NCBI参考序列：NM_174885.3

SEQ ID NO:3

ATGTTATCTCTGACCTGGGGCATGAGGCTAGTGGAAAGACCTGTGGTCCCCAGGGTCCTCCTCTTGCTATTTG CACTCTGGCTGCTCCTCCTGGTTCCAGTCTGGTGTTCTCAAGGCCATCCCACTTGGCGTTACATCTCATCGGA GGTGGTTATTCCTCGGAAGGAGATCTACCATACCAAAGGACTTCAAGCACAAAGACTGCTCTCGTATAGCTTG CGTTTTCGGGGCCAGAGACATATCATCCACCTGCGGAGAAAGACACTCATTTGGCCCAGACACTTGTTGCTGA CAACTCAAGATGACCAAGGAGCCTTACAGATGGAGTACCCCTTTTTTCCTGTAGATTGTTACTATATTGGCTA CCTGGAGGGGATCCTGCAATCCATGGTCACTGTGGATACTTGTTATGGGGGCCTGTCAGGGGTCATAAAGTTG GATAACCTTACCTATGAAATCAAACCCCTCAATGATTCACAGAGCTTTGAACACCTTGTTTCTCAGATAGTAT CTGAGTCTGATGACACAGGGCCTATGAATGCATGGAAGCACTGGAGCCATAATACAGGTTCTCCCTCCTCCAG ATTGGAATATGCAGATGGAGCTCCCAGACTATCTAGTAAGAATTACGCTACACATCCAGCTGCTATAAAAGGC CACTTTCAAGCAACCCATTCTGTATATAGTGCTTCTGGAGGTGACAAACTTTCATCTACTGTTGAGTATTTGT TTAAAGTCATTAGTTTAATGGACACCTATCTGACCAATCTTCATATGCGGTACTATGTCTTTCTCATGACTGT GTATACCGAGGCTGATCCATTTTCACAAGATTTTCGAGTTCCAGGAGGGCAGGCTCATACTTTCTATGAGAGA GTATTTTATGCTCATTTTAGGCCTGATGCAGGAGCTATAATTAACAAGAATTCGCCAGGAGATGATGCTGTTA ATCCAGCTGAGAGGAGTATATGTTCTCCCTCAGCCCTAATTTGTCTTGGTCAACATGGTCGAAATCCTTTATT TTTATCTATTATAATAACCAATCGTGTTGGAAGGAGTTTAGGCCTAAAACATGATGAGGGGTACTGTATCTGC CAGAGAAGGAACACCTGCATCATGTTCAAAAATCCTCAATTAACAGATGCTTTCAGCAATTGTTCCCTTGCAG AGATAAGCAACATACTTAATACTCCTGATCTGATGCCATGTCTTTTCTATGACCGTCATGTTTATTATAATAC ATCATTGACTTATAAGTTTTGTGGAAACTTCAAAGTAGATAACAATGAGCAGTGTGACTGTGGCTCCCAAAAG GCATGTTATTCAGATCCCTGCTGTGGAAATGATTGCAGGTTAACACCTGGTAGCATTTGTGATAAAGAATTAT GCTGTGCAAATTGCACTTACAGTCCTTCTGGGACACTCTGCAGACCTATCCAGAACATATGTGATCTTCCAGA GTACTGTAGTGGCTCTAAGTTCATTTGCCCAGATGACACTTATCTGCAAGATGGGACACCATGCTCAGAAGAG GGTTACTGCTATAAAGGTAACTGCACTGATCGCAACATACAATGCATGGAAATCTTTGGTGTAAGTGCTAAGA ATGCTAATATTAAGTGCTATGACATCAACAAACAACGGTTTCGATTTGGGCATTGTACTAGAGCAGAAGAAAG CCTCACATTCAATGCTTGTGCTGATCAGGACAAGCTGTGTGGAAGGTTGCAGTGTACCAATGTCACCAATCTT CCATTTTTGCAAGAACATGTTTCATTCCATCAATCGGTTATCTCTGGGGTTACCTGCTTTGGGCTTGATGAAC ATCGTGGGACAGAAACAGCAGATGCTGGATTGGTGAGACATGGTACCCCGTGTTCAAGGGGTAAGTTCTGTGA TCGAGGAGCTTGCAATGGAAGTTTATCTCGTTTGGGTTATGACTGCACCCCAGAAAAATGCAATTTCAGAGGA GTGTGTAACAATCGTCGGAATTGCCATTGCCATTTTGGTTGGAGCCCTCCAAAGTGCAAAGAAGAGGGACACA GTGGGAGCATAGACAGTGGGTCCCCTCCGGTTCAAAGGCGCATAATAAAACAGAACCTAGAGCCAGTAGTGTA TTTAAGAATACTCTTTGGTCGTATTTACTTCCTCTTTGTTGCACTGCTCTTTGGCATTGCCACTCGTGTAGGA GTTACTAAGATATTTAGGTTTGAAGACTTGCAAGCTGCTTTACGTTCTTGGCAAGAACAAGCAAAGGACAAGT AA

小家鼠(Mus musculus)

Adam6b

NCBI参考序列：NM_001009545.1

SEQ ID NO:4

ATGTTATCTCTGACCTGGGGCATGAGGCTAGTGGAAAGACCTGTGGTCCCCAGGGTCCTCCTCTTGCTAT TTGCACTCTGGCTGCTCCTCCTGGTTCCAGTCTGGTGTTCTCAAGGCCATCCTACTTGGCGTTACATCTC ATCGGAGGTGGTTATTCCTCGGAAGGAGATCTACCATACCAAAGGACTTCAAGCACAAAGACTGCTCTCA TATAGCTTGCATTTTCGGGGCCAGAGACATATCATCCACCTGCGGAGAAAGACACTCATTTGGCCCAGAC ACTTGTTGCTGACAACTCAAGATGACCAAGGAGCCTTACAGATGGATTACCCCTTTTTTCCTGTAGATTG TTACTATATTGGCTACCTGGAGGGGATCCCACAATCCATGGTCACTGTGGATACTTGTTATGGGGGCCTG TCAGGGGTCATGAAGTTAGATGACCTTACCTATGAAATCAAACCCCTCAATGATTCACAGAGCTTTGAAC ACCTTGTTTCTCAGATAGTATCTGAGTCTGATGACACAGGGCCTATGAATGCATGGAAGCACTGGAGCCA TAATACAGGTTCTCCCTCCTCCAGATTGGAATATGCAGATGGAGCTCCCAGAATATCTAGTAAGAACTAC GCTACACATCCAGCTGCTATAAAAGGCCACTTTCAAGCAACCAATTCTGTATATAATTCTGCTGCAGGTG ACAAACTTTCATCTACTGTTGGGTATTTGTTTCAAGTCATTAGTTTAATGGACACCTATCTGACCAATCT TCATATGCGGTACTATGTCTTTCTCATGACTGTGTACACCAATTCTGATCCATTTCGACTTGAGTTTGCA GTTCCAGGAGGGTCGGCTTATAATTACTATGTGTCAGTCTTTTATAATAAATTTAAGCCTGATGCAGGAG TTTTACTTAATAAGTATGGGCCACAAGATAACCAGGTTAATCCAGCTGAGAGGAGTATATGTTCTTCCTT AGCCCTAATTTGTATTGGTAAATATGATCGAAATCCTTTATTTTTATCTCCTATAATAACCAATCGTGTT GGAAGGAGTTTAGGCTTAAAATATGATGAGGGGTACTGTGTCTGCCAGAGAAGGAACACCTGCATTATGT TCAGACATCCTCAATTAACAGATGCTTTCAGCAATTGTTCCCTTGCAGAGATAAGCAACATACTTAATAC TCCTGGTCTGATGCCATGTCTTTTCTATGACCGTCATGTTTATTATAATACATCATTGACTTATAAGTTT TGTGGAAACTTCAAAGTAGATAACGATGAGCAGTGTGACTGTGGCTCCCAAAAGGCATGTTATTCAGATC CCTGCTGTGGAAATGATTGCAGGTTAACACCTGGTAGCATTTGTGATAAAGAATTATGCTGTGCAAATTG CACTTACAGTCCTTCTGGGACACTCTGCAGACCTATCCAGAACATATGTGATCTTCCAGAGTACTGTAAT GGGACTAAATACATTTGCCCAGATGACACTTATCTGCAAGATGGGACACCATGCTCAGAAGATGGTTACT GCTATAAAGGTAACTGCACTGATCGCAACATACAATGCATGGAAATCTTTGGTGTAAGTGCTAAGAATGC TAATATTAAGTGCTATGACATCAACAAACAACGGTTTCGATTTGGGCATTGTACTAGAGCAGAAGAAAGC CTCACATTCAATGCTTGTGCTGATCAGGACAAGCTGTGTGGAAGGTTGCAGTGTACCAATGTCACCAATC TTCCATATTTGCAAGAACATGTTTCATTCCATCAATCGATTATCTCTGGGTTTACCTGCTTTGGGCTTGA TGAACATCGTGGGACAGAAACAACAGATGCTGGAATGGTGAGACATGGTACCCCCTGCTCCAAAAGTAAG TTCTGTGATCAAGGAGCTTGCAGTGGAAGTTTATCTCATTTGGGTTATGACTGCACCCCAGAAAAATGCA GTTTTAGAGGAGTGTGTAACAATCATCGGAATTGCCATTGTCATTTTGGTTGGAAGCCTCCAGAGTGCAA AGAAGAGGGACTAAGTGGGAGCATAGACAGTGGGTCCCCTCCAGTTCAAAGGCACACAATAAAACAAAAA CAAGAGCCAGTGGTGTATTTAAGAATACTCTTTGGTCGTATTTACTTCCTCTTTGTTGCACTGCTCTTTG GCATTGCCACTCGTGTAGGAGTTACTAAGATTTTTAGATTTGAAGACTTGCAAGCTACTTTACGTTCTGG GCAAGGACCAGCAAGGGACAAGCCAAAGTAA

SEQ ID NO:5

5'同源臂

tatgttgatggatttccatatattaaaccatccctgcatccctgggatgaagcctacttggtcatgatagacg attgttttgatgtgttcttggattcagttagtgagaaatatattgagtatttttacatcgatattcataaggg aaattggtctgaagttctctttctttgttgggtctttatgtggtttagttatca

SEQ ID NO:6

3'同源臂

tgattccaccagaggttcttttatccttgagaagagtttttgctatcctaggttttttgttattccacatgaa tttgcagattgctctttctaattccttgaagaattgagttggaatttgatggggattgcattaaatctgtaga ttccttttggcaagacagccatttttacaatgttaatcctgccaatccatgagcatgg

SEQ ID NO:7

5'同源臂

tttatgtactataccatctcagaaagtcaggttagtctcactagcatcgtaaaagctctgtctgggcttttcc atctgctctgctttttgtctctgtgtctaaaaatatataaaccaatgttgtccagccaaaaaaaaaaaattaa agagcaaaaggaggtaaaatggatacaaattggaaaagaagaaatcaaaatatcactacttgaagatagtata atatatttaactgaccacaaaaattccaccagaaaactcctaaacctgataaacaaactcagaaaaatggcta gatataaactta

SEQ ID NO:8

3'同源臂

acccatagagagaaaacaggtgagttagtgcattaaaggggctgagcagggagttctcatcgctccccagcac cagaaataagagcctctccggagctgctgggacatggaatgcagatgattcggaccatcagccccacagagac ctttcccactctggctcagaaagaggcactggaccacagttggagaggagaatcgaaagctgatatctctgta ttcacttagcctgttacccacccatgcacccaagtccaaggtgggagaaacactgagggtctaaacacagccc cagagcaactgccagtattaaat

SEQ ID NO:9

IgH BAC同源臂

attcaggcagttaattgttgggttcatgttttacaactaaagaataaattcaggccagatgcagtggatcatc gctataatcacaccactttcagaagcaaaaatgagggaaatcccgtgagacgaggcaatcgaagccaacctga gcaacataaagagatgctatttctctgaaaaaatattttaaagaataagcaggtgaggggtggcgttcccctc tacttctagatactcaggaagcaaagatgggaagattatgtgagccaggtgttcaaaattacagtgagctttg atcatacaactgttcttcaaactgtgcaacagggtgagagcctgtctctaaaaacaaataaaaaagaatcaat