一种茯苓NADPH氧化酶编码基因Nox及其应用

摘要

本发明公开了一种茯苓NADPH氧化酶编码基因及其应用，本申请首次利用第二代SolexaHiSeq2000进行茯苓的转录组测序及Denovo拼接，分析找到茯苓中编码NADPH氧化酶的候选基因Nox并进行体外克隆表达，获得的基因序列为SEQIDNO.1所示，编码的蛋白质为SEQIDNO.2所示。将其通过转基因技术在茯苓中过表达，发现其可加快茯苓菌核的形成及提高菌核产量。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，主要涉及茯苓中NADPH氧化酶编码基因Nox(PcWNox)及其编码产物与应用。 

背景技术

药用茯苓是指多孔菌科真菌茯苓(Poria cocos(Schw.)Wolf)的菌核，它是我国常用的大众药材品种之一，具有极高的药用价值和膳食营养价值，入药能够利水渗湿、益脾和胃、宁心安神。由于茯苓特殊的生态习性，其菌核的生长发育主要依赖于对松木的寄生并吸取其中的碳源、氮源以及其它一些必需的物质，为探索不依赖松木资源的新栽培技术、精准调控菌核形成条件及提高产量，研究茯苓菌核形成相关基因的功能及作用机理具有重要意义。 

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶的非吞噬细胞氧化酶(non-phagocytic cell oxidase，NOX)家族是许多非吞噬细胞中活性氧(reaction oxygen species，ROS)的主要来源。通过该途径产生的ROS作为信号分子可参与细胞分化，增殖，凋亡等的调节。ROS信号转导途径在植物病原真菌的生长、发育和致病性调节方面占有非常重要的地位。PcWNox基因属于ROS信号通路中的一个基因，PcWNox基因被沉默的菌株中ROS含量明显降低，并且无法发育形成菌核。 

本申请首次利用第二代Solexa HiSeq2000进行茯苓的转录组测序及De novo拼接。分析找到茯苓中编码NADPH氧化酶的候选基因并进行体外克隆表达，将其通过转基因技术在茯苓中过表达，发现其可加快茯苓菌核的形成及提高产量。 

在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的PcWNox基因及其氨基酸序列。此基因编码的酶在茯苓菌核形成过程中有重要的作用。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种茯苓NADPH氧化酶编码基因Nox(PcWNox)，其序列为SEQ ID NO.1所示。Nox在菌核形成过程中起着必不可少的作用，该基因能够加快茯苓菌核的形成。 

本发明另一个目的是提供Nox基因编码的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.2所示。 

本发明的最后一个目的在于提供一种茯苓NADPH氧化酶编码基因Nox(PcWNox)在加快茯苓菌核形成中的应用，还包括在增加药用茯苓产量中的应用。 

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施： 

一种茯苓NADPH氧化酶编码基因Nox(PcWNox)(以下或称PcWNox基因)，其制备方法如下： 

以茯苓cDNA作为模板，设计引物P1：5'-ATGGGCGAGAGTTGGTT-3'；P2：5'-TTAGAAGTGTTCCTTTGCGA-3'进行PCR扩增，PCR条件如下： 

3min,95℃；30s 94℃；and 30s 57℃,1min 72℃35个循环；10min,72℃；1min,25℃。 

最终获得了PcWNox基因，其序列为SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白质为SEQ ID NO.2所示。 

一种茯苓NADPH氧化酶编码基因Nox(PcWNox)在加快茯苓菌核形成(提高菌核产量)中的应用，其应用过程如下： 

将茯苓NADPH氧化酶编码基因Nox(SEQ ID NO.1所示)通过农杆菌介导遗传转化转入茯苓原生质体中，然后按常规方式进行茯苓的接种及培养，可获得高产茯苓菌核的转基因茯苓菌株。 

本发明的所要保护的内容还包括： 

编码SEQ ID NO.2所示氨基酸的核苷酸序列；优选SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。 

含有本发明的茯苓NADPH氧化酶编码基因Nox(PcWNox)或其ORF序列的的重组载体，如原核类载体，真核类表达载体及RNAi载体均属于本发明的保护范围，包括但不限于pRS 314载体，PE×p3300，pBARGPE1,pAN7-1,pAN52-1,pBC-hygro。 

含有本发明的茯苓NADPH氧化酶编码基因Nox(PcWNox)全序列或其ORF序列的宿主细胞，如含有上述的重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围，包括但不限于大肠杆菌细胞、农杆菌细胞EA101,EA105,LBA4404、毕赤酵母。 

本发明的茯苓NADPH氧化酶编码基因Nox(PcWNox)的应用，包括用所述的重组载体，如植物表达载体转化植物细胞；或者用所述的茯苓NADPH氧化酶编码基因Nox(PcWNox)全序列或其ORF序列转化获得转基因生物体，包括烟草，拟南芥，酵母，竹节参发根。 

本发明中宿主细胞为原核细胞或者真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌；常用 的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。 

与现有技术相比，本发明具有以下优点： 

本发明所提供的茯苓NADPH氧化酶编码基因Nox(PcWNox)是首次从茯苓植物中克隆制备所得，利用本发明的技术对茯苓等真菌进行基因工程改造，通过转基因来加快茯苓菌核的生长速度，同时增加其产量。NADPH氧化酶编码基因Nox(PcWNox)参与茯苓菌核的形成，因此本发明为茯苓菌核形成的进一步研究和工业化生产提供理论依据。 

附图说明

图1为茯苓RNA及cDNA克隆的PCR扩增电泳图。 

左图M1为菌核形成初期，M2为菌核形成期，M3为菌核成熟期；右图为PcWNoxPCR扩增电泳图。 

图2为PcWNox功能域预测分析示意图。 

具体实施方式

本发明所述方案如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂如未特别说明，均购自生化商店。 

实施例1： 

茯苓转录组测序及数据分析 

1、样品采集 

茯苓样本采集于大别山区茯苓种植基地，取其菌核立即置于液氮中速冻后，于-80℃冰箱中冷冻保存。 

2、茯苓总RNA的分离和检测 

取茯苓(P.cocos)菌核样品0.1g，在研钵中用液氮快速研磨成粉末，快速转移至1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，混匀，放置10分钟后离心10分钟，弃上清；加入200ul氯仿，震动15秒，放置2-3分钟；4℃，12000g离心15分钟，,弃上清液400ul加入600ul异丙醇，轻混后放置10分钟；4℃，12000g离心10分钟；弃上清，1ml75％乙醇清洗；4℃，7500g离心5分钟；弃上清，1ml75％乙醇清洗；弃上清，沉淀室温干燥10分钟后溶于25-30ul蒸馏水，用1.0％琼脂糖电泳检测RNA的完整性，用GenQuant核酸定量仪测定A260、A280比值和浓度。置于-80℃冰箱备用。 

3、转录组测序 

用oligo(dT)的磁珠从总RNA中富集mRNA，接加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并被EB缓冲液洗脱之后进行末端修复、加poly(A)并连接测序接头，琼脂糖凝胶电泳分离并选择片段大小，PCR扩增构建测序文库，利用第二代SOlexa HiSeq2000进行RNA测序，及De novo拼接。 

4、候选基因初步筛 

通过GO注释，Blast比对分析以及MEGA5.0构建系统发育树等软件分析初步找到茯苓NADPH氧化酶编码基因的候选基因。 

实施例2： 

茯苓PcWNox基因的克隆 

分析候选基因读码框范围，以茯苓cDNA为模板，利用正向引物P1：5'-ATGGGCGAGAGTTGGTT-3'；反向引物P2：5'-TTAGAAGTGTTCCTTTGCGA-3'克隆候选基因全长序列，链接到克隆载体TOPO TA载体上并转化到大肠杆菌感受态细胞E.coli DH5α中，步骤如下： 

a)从-80℃超低温冰箱中取100μL感受态细胞悬液，解冻后置于冰上； 

b)加入5μL连接产物，用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30min； 

c)42℃热激90s，迅速置冰上5min； 

d)向EP管中加入1mL LB液体培养基(不含抗生素)，37℃200rpm 45min； 

e)摇菌后取100μL菌液涂布于含抗生素的平板上，37℃培养箱过夜； 

f)挑取单菌落于4mL含抗生素的LB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养过夜选取阳性克隆送样测序。 

至此获得了茯苓NADPH氧化酶编码基因Nox，其序列为SEQ ID NO.1所示。 

实施例3： 

Nox基因的生物信息学分析 

本发明涉及的茯苓NADPH氧化酶编码基因Nox(PcWNox)全长cDNA的长度为1674bp，其序列为SEQ ID NO.1所示，其中开放读码框位于1-1674bp，编码的蛋白质序列为SEQ ID NO.2所示。将茯苓全长cDNA序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translation+PDB+Swissprot+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸同源性检索。该基因具有典型的FNR_like superfamily、FAD_bindi ng_8 superfamily和NAD_binding_6superfamily结构域，如图2。 

实施例4： 

PcWNox基因功能的研究 

1、表达载体的构建 

依据PcWNox基因全长序列(SEQ ID NO.1)的ORF，设计扩增完整开放阅读框的引物，分别在正、反向引物上分别引入限制性酶切位点kpnI和salI，利用正向引物P1：5'-GGTACCATGGGCGAGAGTTGGTT-3'；反向引物P2：5'-GTCGACTTAGAAGTGTTCCTTTGCGA-3'进行PCR反应，琼脂糖凝胶电泳，半小时后照相，观察胶图，扩增片段为1686bp，TA克隆，提取质粒。以kpnI和salI酶切扩增产物2小时，利用回收试剂盒(Takara公司，中国)纯化酶切产物。同时利用kpnI和salI酶在37℃下酶切pRS314载体2小时，加入5ul溴酚蓝进行琼脂糖凝胶电泳，观察胶图，并利用试剂盒回收大小约4758bp的片段。 

二者经连接酶在16℃连接过夜。转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选重组子。PCR检测阳性菌斑，提取阳性克隆质粒，进行限制性内切酶酶切电泳鉴定，保存且有正确目标的重组质粒pRS314-PcWNox用于表达转化。该表达载体命名为pRS314-PcWNox。 

2、蛋白的诱导表达 

以pRS314-PcWNox质粒转化部分酶解酵母宿主菌AB1380，培养5天后筛选阳性酵母于2ml含2％葡萄糖的USM培养基上，4-5天后挑取单克隆2ml USM液体培养基中，30℃剧烈震荡培养过夜。5000rpm离心培养5min，弃上清，以含2％葡萄糖的USM液体培养基稀释20倍，30℃剧烈震荡培养24h。提取培养细胞总蛋白。选取高表达转化子以50ml含2％葡萄糖的USM液体培养基30℃剧烈震荡培养20h后，接种到1L不含葡萄糖的USM液体培养基30℃剧烈震荡培养40h，回收菌体，分离微粒体，纯化蛋白。 

3、酶促反应鉴定 

用NBT染色真菌菌丝的方法检测其产生的过氧化物，过氧化物跟NBT反应会形成深蓝色的不溶于水的甲瓒。用DAB染色真菌菌丝来检测细胞内的H₂O₂，二甲酚橙在酸性条件下会使Fe²⁺变成Fe³⁺，在吸光度540到620nm之间产生紫色斑点，以此来进一步检测过氧化氢。为了检测和定量细胞内的H₂O₂，真菌菌丝在玻璃纸琼脂完全培养基上培养3天，取1g新鲜菌丝，加入液氮研磨，向研磨好的样品中加入3mL磷酸盐缓冲液(100mM，pH7.0)悬浮。将悬浮蛋白质样品(50mL)添加到500mL反应体系中：(250mM)硫酸亚铁铵，25mm硫酸，100mM山梨糖醇，125mM二甲酚橙)反应15min。然后在595nm处检测溶液中 H₂O₂的含量，细胞外的H₂O₂含量在240nm处测定其吸光度值。将真菌菌丝置于液体完全培养基中培养3天，再一次用分光光度计检测H₂O₂的含量。用已公布的数据建立标准曲线来计算H₂O₂的浓度，用H₂DCFDA法测定ROS。 

结果显示，在菌核形成阶段，NADPH oxidase基因的表达量显著上升，并且超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性也都明显升高，在菌丝细胞壁和细胞膜周围可观测到H₂O₂的积累。 

实施例5： 

Nox基因在加快茯苓菌核形成和/或增加菌核产量中的应用，其过程如下： 

通过本领域的常规技术将茯苓Nox基因(SEQ ID NO.1所示)转入茯苓原生质中，获得过表达茯苓Nox基因的原生质体，然后按常规方式进行茯苓的接种及栽培，可获得高产茯苓菌核的转基因茯苓。 

本实施例的受体材料茯苓采自大别山区茯苓种植基地。 

1.表达载体的构建 

依据PcWNox基因全长cDNA序列(SEQ ID NO.1)的ORF，在扩增编码区的正反方向引物引入限制性内切酶酶切位点ApaI和XBaI，正向引物序列：5'-GGGCCCATGGGCGAGAGTTGGTT-3'；反向引物序列：5'-TCTAGATTAGAAGTGTTCCTTTGCGA-3'。以茯苓(Wolfiporia cocos)全长cDNA片段为模板，经PCR扩增，进行琼脂糖凝胶电泳，扩增片段大约为1080bp。用ApaI和XBaI 37℃酶切扩增产物3h，利用回收试剂盒(Takara公司，中国)纯化酶切产物，并将酶切产物连接到超表达载体pEXP3300上(该载体以pCAMBIA3300为模板，以灵芝的磷酸脱氢酶基因的启动子(NCBI Accession:DQ404345.1)替代原载体上的CaMV 35S启动子，并将筛选用的潮霉素hygromycin基因克隆至该载体上)。PCR扩增检测目的片段，进行酶切和测序验证，保存且有正确目标的重组质粒用于表达转化。该表达载体命名为pEXP-PcWNox。 

2 茯苓原生质体制备： 

(1)在250ml三角瓶中装入100mlPDB液体培养基，接入茯苓菌丝碎片，于28℃，150rmp摇培2-3天； 

(2)用三层灭菌擦镜纸过滤收集菌丝，再用0.6M甘露醇溶液冲洗菌丝至团状后，转至灭菌的50ml离心管中，加入溶壁酶溶液(1g溶壁酶溶解到50ml的0.6M甘露醇溶液中，依照每g菌丝加入1ml的溶壁酶溶液计算)，于30℃，80rmp酶解2.5-3小时； 

(3)酶解后经三层灭菌擦镜纸过滤，用0.6M甘露醇溶液反复冲洗，收集滤液，于4℃，3 000rmp离心15分钟(或者不过滤直接离心)；弃上清，沉淀用5mlMTC(0.6M甘露醇；10mMTris-HCl，pH7.5；50mM氯化钙)溶液重悬； 

(4)4℃，3000rmp离心15分钟，得到的沉淀即为原生质体；用300ulMTC溶液将原生质体溶解并镜检原生质体数目，将原生质体浓度调至1×10⁸个/ml，即可用于转化(制得的原生质体中加DMSO，使DMSO的浓度为10％，混匀后可于-80℃长期保存)。 

3 PEG介导的原生质体转化： 

(1)将原生质体分装到灭菌的50ml离心管中，每管为150ul。加入超表达载体pEXP-PcWNox(依照每管加入2ug质粒计算)，补足MTC至每管300ul，冰上放置20分钟； 

(2)逐滴加入2mlPTC(60％PEG3350或PEG4000、10mMTris-HCl，pH7.5；50mM氯化钙)溶液，冰上静置20分钟； 

(3)每管加入30ml预冷的MTC(0.6M甘露醇；10mMTris-HCl，pH7.5；50mM氯化钙)，混匀，3000rmp，4℃离心15分钟； 

(4)弃上清，每管加入3ml液体再生培养基，28℃静置培养2-3天； 

(5)将培养物倒入培养皿中，加入约10ml固体再生培养基(冷却至50℃左右)，混匀。待其凝固后，上面再铺约10ml的固体再生培养基(含20ug/ml的潮霉素)，3-4天后观察茯苓的生长状况，能生长出的菌落即为转化子，对转化子进行荧光定量PCR，引物P1：5'-ATGGGCGAGAGTTGGTT-3'，P2：5'-TTAGAAGTGTTCCTTTGCGA-3'，以茯苓18S rRNA基因为内参(Pr1：5'-GCCGTTCTTAGTTCGTGGAT-3'，Pr2：5'-TCGCTGGCTCTGTCAGTGTAG-3')，扩增程序为：95℃预变性10min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环。。实验结果表明，所获得的转化子中，与未转基因的野生型茯苓相比，Nox基因的表达量显著升高。 

液体再生培养基：每L培养基中200g土豆，20g葡萄糖，1g蛋白胨，1g酵母，0.6M甘露醇。 

固体再生培养基：每L培养基中200g土豆，20g葡萄糖，1g蛋白胨，1g酵母，0.6M甘露,；每200ml中加入2g琼脂。 

将生长出的转化子接种到松木培养基上，观察其菌核生长情况。 

4 茯苓的接种及栽培为本领域的常规方法，具体如下： 

小松木段片装瓶(塑料)消毒，加适量培养基PDB，接上原生质体所形成的菌丝，在瓶内长出白色旺盛的菌丝，用镊子将瓶内长有菌丝的松木段片取出，接种到松木上进行栽培。设置3个实验组。同时将不含pEXP-PcWNox载体的茯苓菌丝作为对照组，接种到松木上进 行栽培。设置3个对照组。 

结果：3个对照组菌核形成时间平均为90天。3个实验组的菌核形成时间明显缩短，平均为60天。6个月后，3个实验组的菌核重量是对照组重量的2倍。 

PDB培养基：每L培养基中200g土豆，20g葡萄糖，1g蛋白胨，1g酵母。 

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  朱闻君 赵小龙 杨涛 汤进 陈平 张绍鹏  张西锋 汪琪 李长玲 邓琛

 

<120>  一种茯苓NADPH氧化酶编码基因Nox及其应用

 

<130>  一种茯苓NADPH氧化酶编码基因Nox及其应用

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  1674

<212>  DNA

<213>  茯苓（Poria cocos(Schw.)Wolf）

 

<400>  1

atgggcgaga gttggttccg acgcgagttc ctgacccccc ggcgggcagt cttcaatgtc     60

 

ctcttctatg gcctgcagct ggccttcttt gcttatgggt ggtgggcgca ggaaacgaac    120

 

aagaaattgt ctgctctcaa tgcgctcaag tggtctgtct gggtgtctcg tggtgctggt    180

 

cttgtcctgg cgttcctcgc tggctgcatg ctcttgccca tgttgcgcaa tgtaattcgc    240

 

gtcatccgcc cgaaagtggc cttcctcttt ccggcggacg agaacatctg gttccacaga    300

 

caggccgcgt acgcgatggc gttctggtcc atggtgcatg ccaccgctca ctatgtaaat    360

 

ttctacaatg tcgagcgcac acaggtccgg ccggagttcg cgctcgacgt ccactacaca    420

 

caggcgggcg gcatcactgg acacttcatg ctcctgatca tggtcctcat gtacacaacc    480

 

gcccaccaca agatccgcca ccagtgcttc gaggcattct ggtacacgca ccaccttgca    540

 

ttcttcttct tcatcgcgct gtggacccac gccgacgggt gcttcgtgcg cgacagtact    600

 

ggacctgctt acacggacac attcccgttc tacgacccaa agttctgctt gggctatgag    660

 

agctggcgct tcactatctg gccgggcatc gcgtacttct tcgaacgcgt ctggagggag    720

 

atcagggcta gaagggcaac cagattgtcg aaggtcttgg tgcacccaag cggtgccatg    780

 

gagctgcgta tcgtcaagcc cagcttcaaa tatgttgccg gacagtggct gttcatccaa    840

 

atccctgaag tctcgcgtta ccagtggcac ccgttcacca tcacgtcagc gccagaggac    900

 

ccgtacgtct cggtccatat ccgtcaagtt ggtgattgga catacgcgct gggcgaccgc    960

 

atcggtgcgg gaccctctgt ggtgtctgct atgactaagg cggctatggc tggcgcggag   1020

 

aaggacgact ccatctacgg catgcgtggc gacttcgtcg aggtcgacac gtccgtacgc   1080

 

tcgctgcctg aggtccgcat cgacggtccc tacggtgcgc cggccgagga tgtcttcaac   1140

 

gtcgaggtcg ctgtgctggt tggggctggt attggtgtca ctcctttcgc ctccatcctc   1200

 

aagcacatct ggtaccgcca gaagaagggt gcccttcagt ccctcaagcg cgtcgagttc   1260

 

ttctgggtct gccgtgacgc gccgtctttc ggttggttcc agacactact gcaggaagtc   1320

 

gaggccgccc aggtcgatcc caacttcctg cgcattaaca tctacctcac ccagaaggtg   1380

 

aacgaagaca tgatgtggaa catcgcggtc aacgacgccg gtgcagagta cgacccattg   1440

 

actctgctcc gcacgcgcac catgttcggc cgtccggact ggcagggtat ctacgctcgc   1500

 

atgaggcaag cgattgaggt tggtcagtac ctgcccggta tcaacgagca gctcaagacc   1560

 

accgtcggga cttatttctg tggacctcct gtcctcggga gggccatcca tgaggcgtgc   1620

 

aaggaaaaca ctaccgccaa cattaacttc accttcgcaa aggaacactt ctaa         1674

 

 

<210>  2

<211>  557

<212>  PRT

<213>  茯苓（Poria cocos(Schw.)Wolf）

 

<400>  2

 

Met Gly Glu Ser Trp Phe Arg Arg Glu Phe Leu Thr Pro Arg Arg Ala

1               5                   10                  15     

 

 

Val Phe Asn Val Leu Phe Tyr Gly Leu Gln Leu Ala Phe Phe Ala Tyr

            20                  25                  30         

 

 

Gly Trp Trp Ala Gln Glu Thr Asn Lys Lys Leu Ser Ala Leu Asn Ala

        35                  40                  45             

 

 

Leu Lys Trp Ser Val Trp Val Ser Arg Gly Ala Gly Leu Val Leu Ala

    50                  55                  60                 

 

 

Phe Leu Ala Gly Cys Met Leu Leu Pro Met Leu Arg Asn Val Ile Arg

65                  70                  75                  80 

 

 

Val Ile Arg Pro Lys Val Ala Phe Leu Phe Pro Ala Asp Glu Asn Ile

                85                  90                  95     

 

 

Trp Phe His Arg Gln Ala Ala Tyr Ala Met Ala Phe Trp Ser Met Val

            100                 105                 110         

 

 

His Ala Thr Ala His Tyr Val Asn Phe Tyr Asn Val Glu Arg Thr Gln

        115                 120                 125            

 

 

Val Arg Pro Glu Phe Ala Leu Asp Val His Tyr Thr Gln Ala Gly Gly

    130                 135                 140                 

 

 

Ile Thr Gly His Phe Met Leu Leu Ile Met Val Leu Met Tyr Thr Thr

145                 150                 155                 160

 

 

Ala His His Lys Ile Arg His Gln Cys Phe Glu Ala Phe Trp Tyr Thr

                165                 170                 175    

 

 

His His Leu Ala Phe Phe Phe Phe Ile Ala Leu Trp Thr His Ala Asp

            180                 185                 190        

 

 

Gly Cys Phe Val Arg Asp Ser Thr Gly Pro Ala Tyr Thr Asp Thr Phe

        195                 200                 205            

 

 

Pro Phe Tyr Asp Pro Lys Phe Cys Leu Gly Tyr Glu Ser Trp Arg Phe

    210                 215                 220                

 

 

Thr Ile Trp Pro Gly Ile Ala Tyr Phe Phe Glu Arg Val Trp Arg Glu

225                 230                 235                 240

 

 

Ile Arg Ala Arg Arg Ala Thr Arg Leu Ser Lys Val Leu Val His Pro

                245                 250                 255    

 

 

Ser Gly Ala Met Glu Leu Arg Ile Val Lys Pro Ser Phe Lys Tyr Val

            260                 265                 270        

 

 

Ala Gly Gln Trp Leu Phe Ile Gln Ile Pro Glu Val Ser Arg Tyr Gln

        275                 280                 285            

 

 

Trp His Pro Phe Thr Ile Thr Ser Ala Pro Glu Asp Pro Tyr Val Ser

    290                 295                 300                

 

 

Val His Ile Arg Gln Val Gly Asp Trp Thr Tyr Ala Leu Gly Asp Arg

305                 310                 315                 320

 

 

Ile Gly Ala Gly Pro Ser Val Val Ser Ala Met Thr Lys Ala Ala Met

                325                 330                 335    

 

 

Ala Gly Ala Glu Lys Asp Asp Ser Ile Tyr Gly Met Arg Gly Asp Phe

            340                 345                 350         

 

 

Val Glu Val Asp Thr Ser Val Arg Ser Leu Pro Glu Val Arg Ile Asp

        355                 360                 365            

 

 

Gly Pro Tyr Gly Ala Pro Ala Glu Asp Val Phe Asn Val Glu Val Ala

    370                 375                 380                 

 

 

Val Leu Val Gly Ala Gly Ile Gly Val Thr Pro Phe Ala Ser Ile Leu

385                 390                 395                 400

 

 

Lys His Ile Trp Tyr Arg Gln Lys Lys Gly Ala Leu Gln Ser Leu Lys

                405                 410                 415    

 

 

Arg Val Glu Phe Phe Trp Val Cys Arg Asp Ala Pro Ser Phe Gly Trp

            420                 425                 430        

 

 

Phe Gln Thr Leu Leu Gln Glu Val Glu Ala Ala Gln Val Asp Pro Asn

        435                 440                 445            

 

 

Phe Leu Arg Ile Asn Ile Tyr Leu Thr Gln Lys Val Asn Glu Asp Met

    450                 455                 460                

 

 

Met Trp Asn Ile Ala Val Asn Asp Ala Gly Ala Glu Tyr Asp Pro Leu

465                 470                 475                 480

 

 

Thr Leu Leu Arg Thr Arg Thr Met Phe Gly Arg Pro Asp Trp Gln Gly

                485                 490                 495    

 

 

Ile Tyr Ala Arg Met Arg Gln Ala Ile Glu Val Gly Gln Tyr Leu Pro

            500                 505                 510        

 

 

Gly Ile Asn Glu Gln Leu Lys Thr Thr Val Gly Thr Tyr Phe Cys Gly

        515                 520                 525            

 

 

Pro Pro Val Leu Gly Arg Ala Ile His Glu Ala Cys Lys Glu Asn Thr

    530                 535                 540                

 

 

Thr Ala Asn Ile Asn Phe Thr Phe Ala Lys Glu His Phe

545                 550                 555