抗体及其Fc片段的化学酶法糖基化工程

摘要

本发明提供了用于糖蛋白合成、具有降低的水解活性和提高的糖基转移活性的重组Endo-S突变体，在所述糖蛋白合成中，向核心岩藻糖基化或非岩藻糖基化的GlcNAc-蛋白受体添加所需的唾液酸化噁唑啉或合成寡糖噁唑啉。这样的重组Endo-S突变体可用于IgG1-Fc结构域的高效糖基化重塑，以提供带有结构明确的Fc N-聚糖的不同的抗体糖型。

说明书

政府在发明中的权利

本发明在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予 的资助号为GM080374和GM096973的政府支持下做出。美国政府在 本发明中具有一定权利。

与相关申请的交叉引用

本申请要求2012年2月10日提交的美国临时申请号61/597,468 的优先权，其内容为所有目的通过参考并入本文。

发明背景

发明领域

本发明涉及糖蛋白合成，并且更具体来说，涉及具有糖基转移活性 和有限的水解活性的重组和突变的Endo S、即来自于酿脓链球菌 (Streptococcus pyogenes)的内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的使用，从 而提供抗体-Fc结构域的高效糖基化重塑。

相关技术描述

IgG类型的单克隆抗体(mAb)是用于癌症、自体免疫和传染病治 疗的一类重要的治疗性蛋白(1-3)。IgG抗体由两条重链和两条轻链构 成，它们相结合形成由柔性铰链区相连的三个不同的蛋白质结构域，包 括两个可变的Fab结构域和一个恒定的(可结晶的)Fc结构域。Fab结 构域负责抗原结合，而Fc结构域参与Fc受体介导的效应子功能，例如 抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC) (2，4)。Fc结构域是在保守的N-糖基化位点(N297)处带有两个N- 聚糖的同源二聚体。所附连的寡糖为双触角复杂型，具有相当大的结构 非均质性，其中如图1中所示，N-连接的七糖核心可以用核心岩藻糖 (Fuc)、平分型N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、末端半乳糖(Gal) 和末端唾液酸(Sia)差异修饰(5-7)。X-射线晶体学和NMR结构研 究表明，Fc聚糖夹在两个CH2/CH3亚结构域之间，并与Fc结构域具 有多个非共价相互作用(8-14)。这些研究显示，不同Fc聚糖的附连 可以对Fc结构域构象具有显著影响，暗示了糖基化在维持适合于与抗 体的效应子功能相关联的相应Fc受体相互作用的Fc结构域结构中的重 要作用(8-14)。

还已证实，Fc N-聚糖的精细结构是抗体的前炎性和抗炎性活性的 重要决定因素(2，15)。例如，核心岩藻糖的缺乏以及平分型GlcNAc 组成部分的附连，极大增加抗体对负责抗体依赖性细胞性细胞毒性 (ADCC)的FcγIIIa受体(FcγRIIIa)的亲和性(11，16-18)。因此， 搜寻出低岩藻糖含量的mAb以提高体内抗癌效力(19，20)。另一方 面，末端α-2,6-唾液酸化Fc糖型，其为从数千健康献血者的血清合并的 静脉内免疫球蛋白(IVIG)的一种次要组分，最近被鉴定为在类风湿性 关节炎(RA)的小鼠模型中是IVIG的抗炎活性的活性物质(21-23)。 然而，可商购的IgG、包括单克隆抗体和IVIG，通常作为对它们的相应 治疗活性不是最适的糖型的混合物而存在。例如，目前用于癌症治疗的 单克隆抗体的主要Fc糖型被核心岩藻糖基化(core-fucosylated)，其对 活化受体FcγRIIIa具有相对低的亲和性，对于尤其是具有低亲和性 FcγRIIIa-F158等位基因多态性的患者表现出低效力(2，19，20)。

糖基化对IgG抗体的生物功能和治疗结果的影响，刺激了对开发控 制抗体的糖基化的方法的巨大兴趣。一种方法是在生产期间，在各种表 达系统、包括哺乳动物、植物和酵母宿主细胞中通过聚糖生物合成途径 工程来控制糖基化情况(24-30)。这种糖基化的控制导致产生具有提 高的ADCC活性的低岩藻糖或非岩藻糖基化的单克隆抗体。但是，可以 通过这种方法产生的糖型有限，并且在大多数情况下，完全控制成确定 的均质糖型是困难的。

最近对市场上的几种治疗性糖蛋白药物包括单克隆抗体利妥昔单 抗的分析，指出了在不同时间段生产的不同批次中存在糖基化情况的显 著变化(31)。这一分析暗示了在维持基于糖蛋白的药物的稳定生产中 的挑战，并且还提出了法规关注，因为Fc糖基化的变化最可能影响治 疗效力。

解决糖蛋白的糖基化中的不一致性和非均质性的一种可替选方法， 是通过修剪掉非均质的N-聚糖并通过酶法糖基化延伸糖链，来进行糖 基化重塑(32，33)。这样的酶法糖基化最近通过使用化学酶法进行 Fc糖基化重塑进行了描述，所述化学酶法利用了几种内切糖苷酶和它们 的糖苷合成酶(glycosynthase)突变体的糖基转移活性，使用聚糖噁唑 啉作为它们的底物(34-36)。这种重塑方法由两个步骤构成：通过内 切糖苷酶修剪掉所有非均质的N-聚糖以仅在糖基化位点处留下第一个 GlcNAc，然后通过内切糖苷酶催化的转糖基化反应整体添加回明确的 N-聚糖(32)。

最近的工作证实，IgG-Fc结构域糖基化工程可以通过Fc结构域的 酵母或CHO细胞表达及其随后通过酶脱糖基化-重新糖基化方法的化学 酶法重塑的组合来实现(34-36)。已显示，来自于原玻璃蝇节杆菌 (Arthrobacter protophormiae)的内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶EndoA， 对于使用各种合成的N-聚糖核心噁唑啉作为底物来糖基化含有GlcNAc 的Fc结构域来说，是高度有效的(34，35)。然而，这种方法的当前 状态的限制是明显的：(a)EndoA和EndoM(来自于冻土毛霉(Mucor  hiemalis)的另一种内切糖苷酶)都不能转化核心岩藻糖基化的IgG-Fc 结构域(35)，即重组mAb和IVIG的主要糖型；(b)EndoD突变体 能够将Man3GlcNAc核心附连到岩藻糖基化的GlcNAc-Fc结构域(36)， 但是EndoD、EndoA、EndoM和它们的突变体(36-39)都不能将完整 的复杂类型的N-聚糖转移到岩藻糖基化或非岩藻糖基化的GlcNAc-Fc 结构域；并且(c)具有复杂类型的N-聚糖的完整的全长IgG抗体的糖 基化重塑尚未实现。

在为糖蛋白糖基化重塑开发高效的酶脱糖基化/糖基化系统的尝试 中，注意力已转向EndoS，一种来自于酿脓链球菌(Streptococcus  pyogenes)的内切-β-Ν-乙酰氨基葡萄糖苷酶(ENGase)，其能够通过 切开N-聚糖的壳二糖核心中的β-1,4-糖苷键，来水解完整IgG抗体的 Fc N-聚糖(40-42)。Endo-S具有糖基转移活性，例如其能够使用 Man₃GlcNAc噁唑啉作为供体底物来糖基化GlcNAc受体。然而，野生 型Endo-S还具有高活性的水解活性，因此如果将野生型Endo-S用于合 成和糖基化重塑，糖基化的IgG产物也经历快速水解。

有鉴于上述Endo S的已知活性，提供表现出糖基转移活性和降低 的水解活性的突变的Endo-S，将是有利的。

发明概述

本发明提供了重组的Endo-S及其表现出降低的水解活性和提高的 糖基转移活性的筛选的突变体，用于IgG抗体及其Fc片段的合成，其 中所需糖链被添加到核心岩藻糖基化或非岩藻糖基化的GlcNAc-IgG受 体。因此，本发明允许治疗性抗体及其Fc片段的合成和重塑，以提供 某些生物活性例如延长的体内半衰期、较低的免疫原性、提高的体内活 性、增加的靶向能力和/或递送治疗剂的能力。

一方面，本发明提供了酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的内 切-β-Ν-乙酰氨基葡萄糖苷酶(SEQ ID NO：1)及其突变体的糖基转移 活性，其中所述突变体与其具有至少95％的同源性，并对核心岩藻糖基 化和非岩藻糖基化的GlcNAc-IgG受体两者表现出糖基转移活性，其中 所述内切糖苷酶能够将寡糖(采取活化的糖噁唑啉的形式)整体转移到 岩藻糖基化或非岩藻糖基化的GlcNAc-IgG(或其Fc片段)，以形成IgG (或其Fc片段)的新的糖型。

另一方面，本发明提供了显示出明显提高的糖基转移效率和降低或 消除的产物水解活性的Endo-S突变体。突变体优选地包括定点突变， 包括Asp-233处的突变。所述突变体包括但不限于D233Q(SEQ ID NO： 2)和D233A(SEQ ID NO：3)。

另一方面，本发明提供了用于制备IgG抗体的均质的核心岩藻糖基 化或非岩藻糖基化的糖型的化学酶方法，所述方法包括：

a.提供选自核心岩藻糖基化的GlcNAc-IgG、非岩藻糖基化的 GlcNAc-IgG或相应的IgG-Fc片段的受体；以及

b.将所述受体与包括活化的寡糖组成部分的供体底物，在酿脓链 球菌(Streptococcus pyogenes)的Endo-S Asp-233突变体存在下进行反 应，以将所述活化的寡糖组成部分转移到所述受体并产生所述均质的岩 藻糖基化或非岩藻糖基化的糖蛋白。

另一方面，本发明提供了一种用于制备具有预定的寡糖组成部分的 核心岩藻糖基化的IgG或IgG-Fc片段的方法，所述方法包括：

a.提供包含天冬酰胺连接的核心岩藻糖基化的N-乙酰氨基葡萄糖 (GlcNAc)残基的核心岩藻糖基化的IgG受体；以及

b.将核心岩藻糖基化的IgG受体与活化的寡糖供体在内切糖苷酶 -S D233Q(SEQ ID NO：2)和D233A(SEQ ID NO：3)突变体存在下 进行酶反应，其中所述活化的寡糖供体带有包含预定数目和类型的糖残 基的寡糖组成部分，其中所述寡糖组成部分被共价连接到所述核心岩藻 糖基化的IgG受体，由此制备具有预定的寡糖组成部分的、核心岩藻糖 基化的IgG或IgG-Fc片段。

另一方面，本发明提供了活化的寡糖组成部分例如聚糖或寡糖噁唑 啉、糖基氟化物、糖基叠氮化物或芳基糖苷，作为用于合成均质的核心 岩藻糖基化的糖蛋白或非岩藻糖基化的糖蛋白的供体底物。优选地，所 述活化的寡糖组成部分是寡糖噁唑啉。

另一方面，本发明涉及用于制备均质的岩藻糖基化或非岩藻糖基化 的单体抗体或其Fc片段的化学酶方法，所述方法包括：

提供选自岩藻糖基化或非岩藻糖基化的GlcNAc-抗体或其Fc片段 的受体；以及

将所述受体与供体底物在酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的 Endo-S Asp-233突变体存在下进行反应，其中所述供体底物包含具有确 定数目和类型的糖残基和特定连键类型的预定的寡糖组分，由此提供均 质的岩藻糖基化或非岩藻糖基化的单体抗体或其Fc片段。在一种实施 方式中，含有岩藻糖基化的GlcNAc的蛋白是α-1-6-岩藻糖基-GlcNAc- 蛋白。

另一方面，本发明涉及一种重塑具有带有预定寡糖组分的寡糖的抗 体或其Fc片段的方法，所述寡糖组分具有确定数目和类型的糖残基并 具有特定连键类型，所述方法包括：

a.提供包含Fc N-聚糖的核心岩藻糖基化的抗体或其Fc片段；

b.用水解性内切酶处理所述核心岩藻糖基化的抗体或Fc片段，以 产生Asn连接的GlcNAc组成部分；以及

c.在Endo-S突变体存在下将所述寡糖附连到所述Asn连接的 GlcNAc组成部分，所述Endo-S突变体具有选自SEQ ID NO：2和SEQ  ID NO：3的氨基酸序列，由此添加所述预定的寡糖组分。

另一方面，本发明涉及一种具有带有预定寡糖组分的寡糖的核心岩 藻糖基化或非岩藻糖基化的IgG或IgG-Fc片段的重塑方法，所述寡糖 组分具有确定数目和类型的糖残基并具有特定连键类型，所述方法包 括：

a.提供从天然或重组来源获得的带有非均质N-聚糖的核心岩藻糖 基化或非岩藻糖基化的IgG或IgG-Fc片段；

b.用内切酶(具有高效水解活性的野生型内切糖苷酶或突变的内 切糖苷酶)处理所述天然或重组的IgG或IgG-Fc片段，以水解位置最 接近于肽结构域的两个GlcNAc残基之间的键，由此形成带有核心岩藻 糖基化或非岩藻糖基化的GlcNAc-受体的脱糖基化的蛋白；以及

c.使用酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Endo-S Asp-233 突变体，通过糖基转移将所述预定的寡糖组分附连到所述GlcNAc-受 体，以重构天然的β-1,4-糖苷键，由此添加所述预定的寡糖组分以重塑 所述核心岩藻糖基化或非岩藻糖基化的IgG或IgG-Fc片段。

适用的寡糖噁唑啉包括但不限于高甘露糖型、杂合型、唾液酸聚糖 (sialoglycan)噁唑啉和复杂型N-聚糖，以及它们的选择性修饰的衍生 物，例如具有特定标签的衍生物。优选地，利用二、三、四、五、六、 七、八、九、十或十一糖噁唑啉作为供体底物，用于均质的核心岩藻糖 基化或非岩藻糖基化的IgG抗体和IgG-Fc片段的高效化学酶法合成。

另一方面，本发明涉及一种合成修饰的抗体或其片段的方法，所述 方法包括：

a.提供带有Fc N-聚糖的天然存在的IgG抗体、重组的抗体或Fc 结构域作为前体；

b.使用内切糖苷酶例如野生型Endo-S进行Fc脱糖基化，以将所 述Fc结构域脱糖基化形成GlcNAc-受体；其中所述GlcNAc-受体位于 所述抗体的Fc区上，并且所述GlcNAc-受体是核心岩藻糖基化或非岩 藻糖基化的；以及

c.在选自包括SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的Endo-S突变体 的酶的催化下，用具有预定数目的糖残基的寡糖噁唑啉或唾液酸聚糖噁 唑啉对所述天然存在的IgG抗体、重组的抗体或Fc结构域中的GlcNAc- 受体进行糖基转移，以形成所述具有预定数目的糖残基的修饰的抗体。

另一方面，本发明提供了一种重塑表现出Fc-唾液酸化糖型的静脉 内免疫球蛋白(IVIG)的方法，所述方法包括：

a.提供带有Fc N-聚糖的IVIG；

b.使用内切糖苷酶包括野生型Endo-S对所述Fc N-聚糖进行Fc脱 糖基化以形成GlcNAc-受体；其中所述GlcNAc-受体位于所述IVIG的 Fc区上，并且所述GlcNAc-受体是岩藻糖基化或非岩藻糖基化的；以及

c.在选自包括SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的Endo-S突变体 的酶的催化下，用具有预定数目的糖残基的唾液酸聚糖噁唑啉对所述 GlcNAc-受体进行糖基转移，以形成唾液酸化IVIG。

本发明的另一方面提供了一种含有IVIG制备物的组合物，其包含 至少90％的均质的唾液酸化Fc糖型以提高抗炎活性，其中所述唾液酸 化Fc糖型使用酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Endo-S Asp-233 突变体，与位于脱糖基化的IVIG的Fc区上的GlcNAc组成部分和具有 预定数目的糖残基的唾液酸聚糖噁唑啉相组合来合成。

另一方面，本发明涉及一种合成均质的核心岩藻糖基化或非岩藻糖 基化的IgG抗体或IgG-Fc片段的方法，所述方法包括：

a.提供天然或重组的IgG抗体或IgG-Fc片段，其中所述重组IgG 或IgG-Fc从典型的蛋白表达系统、包括但不限于酵母、昆虫、植物和 任何哺乳动物表达系统来生产；

b.通过选自Endo-H、Endo-A、Endo-S和/或Endo-F3的酶移除所 述N-聚糖，以形成含有核心岩藻糖基化或非岩藻糖基化的GlcNAc的蛋 白；

c.提供糖噁唑啉或唾液酸聚糖噁唑啉以所需的寡糖组分，所述寡 糖组分在链中包含确定数目和类型的糖残基；以及

d.使用选自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Endo-S Asp-233突变体的内切糖苷酶，用具有所需数目的糖残基的糖噁唑啉或 具有所需数目的糖和唾液酸残基的唾液酸聚糖噁唑啉对所述含有岩藻 糖基化或非岩藻糖基化的GlcNAc的蛋白进行酶法糖基转移，由此形成 具有所需数目的糖残基和/或唾液酸的延长部分的均质的核心岩藻糖基 化或非岩藻糖基化的IgG抗体或IgG-Fc片段。

已设想，所述含有具有确定数目和类型的糖残基的预定寡糖组分的 寡糖噁唑啉或唾液酸聚糖噁唑啉，还可以包含其他组成部分或标签，包 括治疗剂或药物例如用于治疗癌症、HIV或其他病毒的治疗剂或药物， 活化细胞质膜上的受体的物质，影响细胞内化学的药剂，影响细胞物理 学的药剂，基因，基因类似物，RNA，RNA类似物，DNA，DNA类似 物，表面受体例如CCR5或CD4的氨基酸序列，对特定抗体具有亲和 性的抗原性结构；受体配体例如gp120、gp41或gp160的氨基酸序列， 受体拮抗剂，受体阻断剂，酶，酶底物，酶抑制剂，酶调节剂，治疗性 蛋白，蛋白类似物，代谢物，代谢物类似物，寡核苷酸，寡核苷酸类似 物，抗原，抗原类似物，抗体或其片段，抗体类似物，对另一种受体具 有反应性的不同于所述修饰的抗体的抗体，细菌，病毒，无机离子，金 属离子，金属簇，聚合物，荧光化合物，及其任何组合。

因此，本发明还提供了一种用于递送具有生物活性的药物或治疗剂 以治疗病症的递送装置，所述递送装置包含：重塑的IgG或IgG-Fc片 段，其具有预定的糖链或唾液酸聚糖以及附连于末端糖残基或唾液酸的 治疗剂或药物。

本发明设想了修饰与HIV相关的单克隆抗体，包括但不限于17b、 48d、A32、C11、2G12、F240、IgG1b12、19e、X5、TNX-355和F91， 它们都是可商购的。

其他与癌症或其他疾病相关的抗体也可以为个体重塑以与某些受 体相配，由此提高生物活性，所述单克隆抗体可以包括但不限于西妥昔 单抗、利妥昔单抗、莫罗单抗-CD3、阿昔单抗、达利珠单抗、巴利昔单 抗、帕利珠单抗、英夫利昔单抗、曲妥珠单抗、吉妥珠单抗奥唑米星、 阿仑单抗、替伊莫单抗、阿达木单抗、奥马珠单抗、托西莫单抗、I-131 托西莫单抗、依法利珠单抗、贝伐单抗、帕尼单抗、帕妥珠单抗、那他 珠单抗、依那西普、IGN101(Aphton)、伏洛昔单抗(Biogen Idec和 PDL BioPharm)、抗-CD80mAb(Biogen Idec)、抗-CD23mAb(Biogen  Idel)、CAT-3888(Cambridge Antibody Technology)、CDP-791(Imclone)、 艾拉普妥珠单抗(eraptuzumab)(Immunomedics)、MDX-010(Medarex  and BMS)、MDX-060(Medarex)、MDX-070(Medarex)、马妥珠单 抗(Merck)、CP-675,206(Pfizer)、CAL(Roche)、SGN-30(Seattle  Genetics)、赞诺里木单抗(zanolimumab)(Serono和Genmab)、阿 德木单抗(Sereno)、奥戈伏单抗(United Therapeutics)、尼妥珠单抗 (YM Bioscience)、ABT-874(Abbott Laboratories)、德尼单抗(Amgen)、 AM 108(Amgen)、AMG 714(Amgen)、芳妥珠单抗(Biogen Idec  和PDL BioPharm)、达利珠单抗(Biogent Idec和PDL BioPharm)、 戈利木单抗(Centocor和Schering-Plough)、CNTO 1275(Centocor)、 奥克利珠单抗(ocrelizumab)(Genetech和Roche)、HuMax-CD20 (Genmab)、贝利木单抗(HGS和GSK)、依帕珠单抗(Immunomedics)、 MLN1202(Millennium Pharmaceuticals)、维西珠单抗(PDL BioPharm)、 托珠单抗(Roche)、奥克尔利珠单抗(ocrerlizumab)(Roche)、聚 乙二醇化赛妥珠单抗(UCB，以前的Celltech)、依库珠单抗(Alexion  Pharmaceuticals)、派克西利珠单抗(pexelizumab)(Alexion  Pharmaceuticals和Procter&Gamble)、阿昔单抗(Centocor)、兰尼子 木单抗(ranibizimumab)(Genetech)、美泊利单抗(GSK)、TNX-355 (Tanox)或MYO-029(Wyeth).

本发明的另一方面涉及一种重塑最初包括非均质糖链的抗体的方 法，所述方法包括：

a.使用内切糖苷酶从所述抗体移除所述非均质糖链，留下附连于 原始糖基化位点的单一岩藻糖基化或非岩藻糖基化的GlcNAc组成部 分；以及

b.通过内切糖苷酶催化的糖基转移将具有至少一个标签的核心寡 糖或唾液酸聚糖噁唑啉转移到所述岩藻糖基化非岩藻糖基化的GlcNAc 组成部分，以产生带有标签的抗体，其中所述内切糖苷酶选自包括SEQ  ID NO：2和SEQ ID NO：3的Endo-S突变体。

所述标签组成部分可以包括但不限于抗原、治疗性药物例如用于癌 症或HIV的药物、毒素、荧光探针、生物素、PEG物质、脂质或核苷 酸。

另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含选自D233Q(SEQ ID  NO:2)和D233A(SEQ ID NO：3)的至少一种酿脓链球菌(Streptococcus  pyogenes)的Endo-S Asp-233突变体。

另一方面，本发明提供了一种具有预定寡糖组成部分的核心岩藻糖 基化或非岩藻糖基化的抗体或其Fc片段的基本上均质的制备物，其中 所述基本上均质的制备物通过任一种上述方法来生产。还提供了包含这 样的均质制备物的组合物。

另一方面，本发明提供了一种使用具有所需糖基化状态和/或唾液 酸化形式的重塑的抗体，以足以在被治疗的对象中调节生物活性的量进 行治疗的方法。

从随后的公开内容和权利要求书，本发明的其他方面、特点和实施 方式将更充分地显现。

附图简述

图1示出了典型的IgG抗体和Fc N-聚糖的结构。a)人类IgG的α 骨架结构，示出了功能区(在PDB编号1HZH的基础上建立的模型)； b)附连于Fc结构域中的Asn-297的全长双触角复杂型N-聚糖的结构

图2示出了EndoS(SEQ ID NO：4)和EndoF3(SEQ ID NO：5) 的序列比对。

图3A和B示出了将利妥昔单抗糖基化重塑成均质的天然和选择性 修饰的糖型的流程

图4A-C示出了利妥昔单抗的糖基化重塑的SDS-PAGE和ESI-MS 分析。(a)SDS-PAGE分析：第0道，蛋白质标志物；第1道，商品 化利妥昔单抗；第2道，EndoS脱糖基化的利妥昔单抗(1)；第3道， 来自于EndoS-D233A催化的、(1)与唾液酸聚糖噁唑啉(2)之间的 反应的糖基转移产物(3)；第4道，来自于EndoS-D233Q催化的、(1) 与(2)之间的反应的糖基转移产物；第5道，来自于EndoS-D233Q催 化的、脱糖基化的利妥昔单抗(1)与Man3GlcNAc噁唑啉(4)之间的 反应的糖基转移产物(5)；第6道，来自于EndoS-D233Q催化的、脱 糖基化的利妥昔单抗(1)与N3Man3GlcNAc噁唑啉(6)之间的反应 的糖基转移产物(7)。(b)商品化利妥昔单抗的重链的ESI-MS(在 去卷积后)。(c)脱糖基化的利妥昔单抗(1)的ESI-MS。(d)糖基 转移产物(3)的ESI-MS。(e)糖基转移产物(5)的ESI-MS。(f) 糖基转移产物(7)的ESI-MS。

图5A和B示出了向利妥昔单抗的非岩藻糖基化的均质糖型的酶法 重塑

图6示出了将利妥昔单抗糖工程化(glycoengineering)成非岩藻糖 基化的G2糖型的SDS-PAGE和ESI-MS分析。(a)SDS-PAGE分析： 第0道，蛋白质标志物；第1道，商品化利妥昔单抗；第2道，EndoS 脱糖基化的利妥昔单抗(1)；第3道，脱岩藻糖基化的产物(8)；第 4道，糖工程化的G2糖型。(b)脱岩藻糖基化的利妥昔单抗(8)的 重链的ESI-MS(在去卷积后)。(c)糖工程化的G2利妥昔单抗(10) 的重链的ESI-MS。

图7示出了人类IVIG的位点特异性的Fc糖工程化

图8示出了来自于IVIG的Fab和Fc的2AB标记的N-聚糖的荧光 HPLC分布图。a)来自于本源IVIG Fc；b)来自于糖工程化的IVIG Fc； c)来自于本源IVIG Fab；d)来自于糖工程化的IVIG Fab。聚糖结构包 括下列组分：

图9A-C示出了G2-利妥昔单抗和商品化利妥昔单抗与相应的Fcγ 受体的结合的典型的SPR传感图：FcγRIIIa-V158(A)，FcγRIIIa-F158 (B)和FcγRIIb(C)。通过蛋白A捕获将抗体固定，并通过以从40μg/mL (1.33μM)开始的连续的2倍稀释度注入相应的Fcγ受体来分析结合。

图10示出了通过PNGase F处理而释放的Fc N-聚糖的MALDI-TOF MS，符号与图1中所定义的相同。

图11示出了通过EndoS处理而释放的Fc N-聚糖的MALDI-TOF MS，符号与图1中所定义的相同。

图12A-C示出了利妥昔单抗的LC-MS分析。a)还原的利妥昔单 抗的LC分布图；b)轻链的ESI-MS；c)轻链的去卷积的MS；d)重 链的ESI-MS；e)重链的去卷积的MS。

图13示出了通过PNGase F处理从商品化和糖工程化的利妥昔单抗 样品释放的2-AB标记的N-聚糖的荧光HPLC分布图。a)来自于商品 化利妥昔单抗；b)来自于唾液酸化的利妥昔单抗(3)；c)来自于非 岩藻糖基化的利妥昔单抗(10)。

图14示出了野生型EndoS的糖基转移的SDS-PAGE分析。第0道， 蛋白质标志物；第1道，商品化利妥昔单抗；第2道，EndoS脱糖基化 的利妥昔单抗(1)；第3至第7道，脱糖基化的利妥昔单抗(1)与唾 液酸聚糖噁唑啉(2)之间的糖基转移反应的监测：第3道，15min； 第4道，30min；第5道，1h；第6道，2h；第7道，4h。

图15A和B示出了使用牛肾α-岩藻糖苷酶对Fuc(α2,6)GlcNAc-利 妥昔单抗(1)的脱岩藻糖基化的LC-MS监测。示出了利妥昔单抗的重 链的去卷积的ESI-MS分布图(FG-Rx，Fuc(α2,6)GlcNAc-利妥昔单抗的 重链；G-Rx，GlcNAc-利妥昔单抗的重链)。a)与α-岩藻糖苷酶温育2 天；b)与α-岩藻糖苷酶温育7天；c)与α-岩藻糖苷酶温育14天；以 及d)与α-岩藻糖苷酶温育20天。

图16示出了IVIG糖工程化的SDS-PAGE分析。第0道，蛋白质 标志物；第1道，商品化IVIG；第2道，用EndoS脱糖基化后的IVIG (11)；第3道，用唾液酸聚糖噁唑啉进行EndoS-D233Q催化的糖基 转移之后的IVIG(12)。

图17A和B分别示出了酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的 Endo-S Asp-233突变体D233Q(SEQ ID NO:2)和D233A(SEQ ID NO： 3)的氨基酸序列。

发明详述

本发明提供了新的糖苷合成酶EndoS Asp 233突变体，其显示出显 著的糖基转移效率，能够将复杂型N-聚糖从活化的聚糖噁唑啉转移到 脱糖基化的完整抗体而没有产物水解。在本文中发现，糖苷合成酶 EndoS Asp 233突变体高效地作用于完整抗体的核心岩藻糖基化和非岩 藻糖基化的GlcNAc-Fc结构域两者，以提供各种确定的IgG糖型。此外， 抗体和静脉内免疫球蛋白被转化成具有提高的抗炎活性的Fc完全唾液 酸化的糖型。此外，本发明提供了具有增加的ADCC活性和提高的 FcγIIIa受体结合活性的均质的糖型，以及可以进一步转化成其他糖型的 带有叠氮标签的糖型。

除非另有指明，否则本发明的实践将利用本领域技术范围之内的免 疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术。 参见例如Sambrook等《分子克隆实验指南》(MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL)第二版(1989)；《分子生物学现代方 法》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M. Ausubel等主编(1987))；《酶学方法》(METHODS IN  ENZYMOLOGY)丛书(Academic Press,Inc.)；《PCR 2：实用方法》 (PCR 2:A PRACTICAL APPROACH)(M.J.MacPherson,B.D.Hames 和G.R.Taylor主编，(1995))；Harlow和Lane主编(1988)《抗 体实验指南》(ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL)；以及《动 物细胞培养》(ANIMAL CELL CULTURE)(R.I.Freshney主编 (1987))。

应该理解，本文中描述的本发明的方面包括“由其构成”和/或“基 本上由其构成”的方面。

定义

当在本文的说明书中使用时，没有具体数目的指称意味着一个或多 个。当在权利要求项中使用时，当与单词“包含”联合使用时，没有具 体数目的指称可能意味着一个或超过一个。当在本文中使用时，“另一 个”可能意味着至少第二个或更多。

当在本文中使用时，“生物活性”是指药效学和药物动力学性质， 包括例如分子亲和性或产生的生物化学或生理学效应、受体亲和性或产 生的生物化学或生理学效应、非受体亲和性或生物化学或生理学效应、 效力、生物可利用性、吸收、分布、代谢或消除。

当在本文中使用时，“糖”是指氧化或非氧化的含糖分子，包括但 不限于单糖、二糖、三糖、寡糖或多糖，包括例如L-或D-异构体的N- 乙酰氨基葡萄糖、甘露糖、半乳糖、N-乙酰神经氨酸(唾液酸)、葡萄 糖、果糖、岩藻糖、山梨糖、鼠李糖、甘露庚酮糖、N-乙酰氨基半乳糖、 二羟丙酮、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘油醛、蔗糖、乳糖、麦芽糖、 海藻糖、纤维二糖或其任何组合。糖还指天然、重组、合成和/或半合 成生产的这样的分子。

当在本文中使用时，“均质的”是指核心岩藻糖基化的糖蛋白或非 岩藻糖基化的糖蛋白，其中寡糖组分包含至少75％、更优选地至少80％、 至少85％或至少90％、最优选地至少95％的相同数目和类型的糖残基。

当在本文中使用时，“蛋白”或“糖蛋白”可以与术语肽和糖肽互 换。

当在本文中使用时，“同源性”是指在两个多肽之间具有显著的同 一性或相似性并且与参比多肽具有至少90％、更优选地至少95％的相似 性的氨基酸序列。对于多肽来说，为获得上述序列之间的同源性百分数 而比较的长度一般为至少25个氨基酸，或者为至少50个氨基酸，更可 能为至少100个氨基酸，最可能为200个或更多氨基酸。显著同一或同 源的多肽，包括位于氨基酸序列的不破坏内切糖苷酶功能的位置处的添 加、截短、内部缺失或插入、保守和非保守置换或其他修饰。本领域技 术人员将会认识到大量氨基酸可以被修饰或被其他化学上相似的残基 置换而不显著改变活性。

当在本文中使用时，“调节”是指当将本发明的糖基化工程改造的 抗体与非糖基化工程改造的抗体进行比较时，如上所定义的“生物活性” 的提高或降低。

当在本文中使用时，“免疫球蛋白分子”或“抗体”是指含有特异 性结合抗原的抗原结合位点或结合于细胞受体的Fc区的分子。在结构 上，最简单的天然存在的抗体(例如IgG)包含通过二硫键互连的四条 多肽链，即两条重(H)链和两条轻(L)链。天然免疫球蛋白代表了 一个大的分子家族，其包括几种类型的分子，例如IgD、IgG、IgA、IgM 和IgE。该术语还涵盖杂合抗体或改变的抗体，及其片段，包括Fc片段。

抗体可以使用如本文中所述的常规技术片段化，并以与对完整抗体 所述相同的方式对所述片段进行筛选以便使用。免疫球蛋白分子的Fab 片段是多体蛋白，其由免疫球蛋白分子的部分构成，含有共价偶联在一 起并能够与抗原特异性结合的免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的免 疫活性部分。Fab和Fc片段可以使用本领域中公知的方法，用木瓜蛋白 酶对基本上完整的免疫球蛋白分子进行蛋白水解消化来制备。然而，Fab 或Fc片段也可以使用本领域中已知的方法，通过在适合的宿主细胞中 表达免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的所需部分来制备。

当在本文中使用时，对于抗体来说，“基本上纯的”意味着与那些 在天然状态下与其相伴的污染物或那些在获得抗体的过程中产生或使 用的污染物分离开。该术语还包括具有单一糖基化状态的所需产物，不 论这种状态是否包括单一位点或多个位点处的糖基化。通常，当抗体占 制备物中抗体的至少60重量％时，所述抗体是基本上纯的。例如，制 备物中的抗体以重量计至少约75％、在某些实施方式中至少约80％、在 某些实施方式中至少约85％、在某些实施方式中至少约90％、在某些实 施方式中至少约95％、最优选地至少约99％为所需抗体。基本上纯的抗 体包括天然、重组或合成生产的抗体。

当在本文中使用时，“治疗有效量”是指引起疾病或病症的症状的 改善或修复的量。

可用于作为标签附连到本发明的修饰的核心岩藻糖基化或非岩藻 糖基化的糖蛋白以及更优选地抗体或其片段的抗原，可以是外来抗原、 内源抗原、其片段或具有相同功能活性的变体。

当在本文中使用时，“内源抗原”是指天然存在于受体动物细胞或 组织中的蛋白质或其部分，例如细胞蛋白、免疫调节剂或治疗剂。

当在本文中使用时，“外来抗原”是指对于受体动物细胞或组织来 说是外来的蛋白或其片段，包括但不限于病毒蛋白、寄生虫蛋白、免疫 调节剂或治疗剂。

外来抗原可以是源自于病毒病原体和寄生虫病原体的蛋白、或其一 种或多种抗原性片段。

或者，外来抗原可以由合成的基因编码，并且可以使用常规的重组 DNA方法来构建；所述合成的基因可以表达源自于病毒病原体和寄生 虫病原体的抗原或其部分。这些病原体在人类、驯养动物或野生动物宿 主中可能是传染性的。

外来抗原可以是由任何病毒病原体或寄生虫病原体在进入它们的 动物宿主、在所述宿主中定植或复制之前或期间所表达的任何分子。

病毒抗原所源自的病毒病原体包括但不限于正粘病毒，例如流感病 毒(分类学ID：59771)；反转录病毒，例如RSV、HTLV-1(分类学 ID：39015)和HTLV-II(分类学ID：11909)；疱疹病毒，例如EBV (分类学ID：10295)、CMV(分类学ID：10358)或单纯性疱疹病毒 (ATCC#：VR-1487)；慢病毒，例如HIV-1(分类学ID：12721)和 HIV-2(分类学ID：11709)；弹状病毒，例如狂犬病毒；小核糖核酸 病毒，例如脊髓灰质炎病毒(分类学ID：12080)；痘病毒，例如痘苗 病毒(分类学ID：10245)；轮状病毒(分类学ID：10912)；以及细 小病毒，例如腺相关病毒1(分类学ID：85106)。

病毒抗原的实例包括但不限于人免疫缺陷病毒抗原Nef(美国国家 过敏和传染病研究所(National Institute of Allergy and Infectious  Disease)HIV储存库目录号183；GenBank登记号AF238278)、Gag、 Env(美国国家过敏和传染病研究所(National Institute of Allergy and  Infectious Disease)HIV储存库目录号2433；GenBank登记号U39362)、 Tat(美国国家过敏和传染病研究所(National Institute of Allergy and  Infectious Disease)HIV储存库目录号827；GenBank登记号Ml 3137)、 Rev(美国国家过敏和传染病研究所(National Institute of Allergy and  Infectious Disease)HIV储存库目录号2088；GenBank登记号L14572)、 Pol(美国国家过敏和传染病研究所(National Institute of Allergy and  Infectious Disease)HIV储存库目录号238；GenBank登记号AJ237568) 和gp120的T细胞和B细胞表位；乙肝表面抗原(GenBank登记号 AF043578)；轮状病毒抗原，例如VP4(GenBank登记号AJ293721) 和VP7(GenBank登记号AY003871)；流感病毒抗原，例如红细胞凝 集素(GenBank登记号AJ404627)；核蛋白(GenBank登记号AJ289872)； 以及单纯性疱疹病毒抗原，例如胸苷激酶(GenBank登记号AB047378)。

细菌抗原所源自的细菌病原体包括但不限于分枝杆菌属菌种 (Mycobacterium spp.)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、沙门氏 菌属菌种(Salmonella spp.)、志贺氏菌属菌种(Shigella spp.)、大肠 埃希氏菌(E.coli)、立克次氏体属菌种(Rickettsia spp.)、李斯特菌 属菌种(Listeria spp.)、肺炎军团菌(Legionella pneumoniae)、假单 胞菌属菌种(Pseudomonas spp.)、弧菌属菌种(Vibrio spp.)和伯氏疏 螺旋体(Borellia burgdorferi)。

细菌病原体的保护性抗原的实例包括肠毒性大肠杆菌的菌体抗原， 例如CFA/I菌毛抗原和热不稳定毒素的无毒性的B亚基；百日咳博德特 氏菌(Bordetella pertussis)的百日咳杆菌粘附素，百日咳博德特氏菌(B. pertussis)的腺苷酸环化酶-溶血素，破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium  tetani)的破伤风毒素的的片段C，伯氏疏螺旋体(Borellia burgdorferi) 的OspA，普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)和斑疹伤害立克次氏 体(Rickettsia typhi)的保护性类结晶表面层 (paracrystalline-surface-layer)蛋白，单核细胞增多性李斯特菌(Listeria  monocytogenes)的李斯特菌素(也称为“Llo”和“Hly”)和/或超氧 化物歧化酶(也称为“SOD”和“p60”)；幽门螺旋杆菌(Helicobacter  pylori)的脲酶，以及炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthrax)的致命毒素和/ 或保护性抗原的受体结合结构域。

来自于生物武器或病原体的抗原的实例包括但不限于天花、炭疽、 兔热病、鼠疫、李斯特菌、布鲁氏菌病、肝炎、痘苗、分枝杆菌、柯萨 基病毒、结核病、疟疾、埃立克体病和细菌性脑膜炎。

寄生虫抗原所源自的寄生虫病原体包括但不限于疟原虫属物种 (Plasmodium spp.)，例如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)(ATCC 号：30145)；锥虫属物种(Trypanosome spp.)，例如克氏锥虫 (Trypanosoma cruzi)(ATCC号：50797)；贾地鞭毛虫属物种(Giardia  spp.)，例如肠贾地鞭毛虫(Giardia intestinalis)(ATCC号：30888D)； 牛蜱属物种(Boophilus spp.)；巴贝虫属物种(Babesia spp.)，例如田 鼠巴贝虫(Babesia microti)(ATCC号：30221)；内阿米巴属物种 (Entamoeba spp.)，例如溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)(ATCC 号：30015)；艾美球虫属物种(Eimeria spp.)，例如巨型艾美球虫(Eimeria  maxima)(ATCC号：40357)；利什曼虫属物种(Leishmania spp.)(分 类学ID：38568)；裂体吸虫属物种(Schistosome spp.)，例如曼森氏 裂体吸虫(Schistosoma mansoni)(GenBank登记号AZ301495)；布鲁 丝虫属物种(Brugia spp.)，例如马来布鲁丝虫(Brugia malayi)(GenBank  登记号BE352806)；片吸虫属物种(Fasciola spp.)，例如肝片吸虫 (Fasciola hepatica)(GenBank登记号AF286903)；恶丝虫属物种 (Dirofilaria spp.)，例如犬恶丝虫(Dirofilaria immitis)(GenBank登 记号AF008300)；吴策线虫属物种(Wuchereria spp.)，例如班氏吴策 线虫(Wuchereria bancrofti)(GenBank登记号AF250996)；以及盘尾 丝虫属物种(Onchocerca spp.)，例如旋盘尾丝虫(Onchocerca volvulus) (GenBank登记号BE588251)。

寄生虫抗原的实例包括但不限于疟原虫属物种(Plasmodium spp.) 的红细胞前期抗原，例如恶性疟原虫(P.falciparum)(GenBank登记 号M22982)和间日疟原虫(P.vivax)(GenBank登记号M20670)的 环子孢子抗原；疟原虫属物种(Plasmodium spp.)的肝期抗原，例如肝 期抗原1(被称为LSA-1；GenBank登记号AF086802)；疟原虫属物种 (Plasmodium spp.)的裂殖子期抗原，例如裂殖子表面抗原-1(也被称 为MSA-1或MSP-1；GenBank登记号AF199410)；溶组织内阿米巴 (Entamoeba histolytica)的表面抗原，例如半乳糖特异性凝集素 (GenBank登记号M59850)或富含丝氨酸的溶组织内阿米巴蛋白；利 什曼虫属物种(Leishmania spp.)的表面蛋白，例如硕大利什曼虫 (Leishmania major)的63kDa糖蛋白(gp63)(GenBank登记号Y00647) 或46kDa糖蛋白(gp46)；马来布鲁丝虫(Brugia malayi)的副肌球蛋 白(GenBank登记号U77590)；曼森氏裂体吸虫(Schistosoma mansoni) 的磷酸丙糖异构酶(GenBank登记号W06781)；蛇形毛圆线虫 (Trichostrongylus colubriformis)的分泌的球蛋白样蛋白(GenBank登 记号M63263)；肝片吸虫(Fasciola hepatica)(GenBank登记号M77682)、 牛裂体吸虫(Schistosoma bovis)(GenBank登记号M77682)、日本裂 体吸虫(S.japonicum)(GenBank登记号U58012)的谷胱甘肽-S-转移 酶；以及牛裂体吸虫和日本裂体吸虫的KLH(Bashir等，同上)。

肿瘤特异性抗原的实例包括前列腺特异性抗原(PSA)、TAG-72 和CEA、人类酪氨酸酶(GenBank登记号M27160)、酪氨酸酶相关蛋 白(也被称为TRP；GenBank登记号AJ132933)和肿瘤特异性肽抗原。

移植抗原的实例包括T细胞上的CD3分子和组织相容性抗原例如 HLA A、HLA B、HLA C、HLA DR和HLA。

自体免疫抗原的实例包括IASβ链，其可用于针对自体免疫性脑脊 髓炎的治疗性疫苗中(GenBank登记号D88762)；谷氨酸脱羧酶，其 可用于针对胰岛素依赖性1型糖尿病的治疗性疫苗中(GenBank登记号 NM013445)；促甲状腺素受体(TSHr)，其可用于针对格雷夫斯病的 治疗性疫苗中(GenBank登记号NM000369)；以及酪氨酸酶相关蛋白 1，其可用于针对白癜风的治疗性疫苗中(GenBank登记号NM000550)。

可用于带有标签的抗体或其片段的构建中的HIV药物包括但不限 于抗病毒剂例如核苷RT抑制剂、CCR5抑制剂/拮抗剂、病毒进入抑制 剂和它们的功能类似物。具体来说，抗病毒剂可以是核苷RT抑制剂例 如齐多夫定(ZDV，AZT)、拉米夫定(3TC)、司他夫定(d4T)、 地达诺新(ddl)、扎西他宾(ddC)、阿巴卡韦(ABC)、艾莫瑞凡(Emirivine) (FTC)、替诺福韦(TDF)、地拉夫定(DLV)、依法韦仑(EFV)、 奈韦拉平(NVP)、沙奎那韦(SQV)、利托那韦(RTV)、印地那韦 (IDV)、奈非那韦(NFV)、安泼那韦(APV)、洛匹那韦(LPV)、 阿扎那韦、可比韦(ZDV/3TC)、克力芝(RTV/LPV)、三协维 (ZDV/3TC/ABC)；CCR5抑制剂/拮抗剂，例如SCH-C、SCH-D、PRO 140、TAK 779、TAK-220、RANTES类似物、AK602、UK-427、857、 单克隆抗体；以及病毒进入抑制剂，例如福泽昂(T-20)(恩夫韦地)、 NB-2、NB-64、T-649、T-1249、SCH-C、SCH-D、PRO 140、TAK 779、 TAK-220、RANTES类似物、AK602、UK-427、857；及其功能性类似 物或等同物。

设想了许多不同的核心岩藻糖基化的糖蛋白和非岩藻糖基化的糖 蛋白可以按照本发明的方法进行修饰或用作偶联到末端糖的治疗剂，其 包括但不限于促肾上腺皮质激素(ACTH)、促肾上腺皮质激素衍生物 (例如依比拉肽)、血管紧张素、血管紧张素Π、天冬氨酸酶、心房钠 尿肽、心房利尿钠肽、枯草杆菌肽、β-内啡肽、凝血因子VII、凝血因 子VIII和凝血因子IX、血液胸腺因子(FTS)、血液胸腺因子衍生物、 铃蟾肽、骨形态发生因子(BMP)、骨形态发生蛋白、缓激肽、雨蛙肽、 降钙素基因相关多肽(CGRP)、降钙素类、CCK-8、细胞生长因子(例 如EGF、TGF-α、TGF-β、PDGF、酸性FGF、碱性FGF)、蛙皮素、趋 化因子、胆囊收缩素、胆囊收缩素-8、胆囊收缩素-肠促胰酶素(CCK-PZ)、 多粘菌素E、集落刺激因子(例如CSF、GCSF、GMCSF、MCSF)、 促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)、细胞因子、去氨加压素、dinorphin、 二肽、歧化酶、强啡肽、章鱼唾腺精、内啡肽类、内皮素、内皮素拮抗 肽、endotherins、脑啡肽、脑啡肽衍生物、表皮生长因子(EGF)、促 红细胞生成素(EPO)、促卵泡激素(FSH)、肠抑胃肽、释胃泌素肽 (GRP)、胃泌素类、G-CSF、高血糖素、谷胱甘肽过氧化物酶、glutathio- 过氧化物酶、促性腺素(例如人类绒毛膜促性腺激素及其α和β亚基)、 短杆菌肽、短杆菌肽类、生长因子(EGF)、生长激素释放因子(GRF)、 生长激素类、激素释放激素(LHRH)、人类心房钠尿肽(h-ANP)、 人胎盘促乳素、胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF-I、IGF-II)、干扰素 类(例如α-、β-和γ-干扰素)、白介素类(例如1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11和12)、肠肽(VIP)、血管舒缓素、京都啡肽、促黄体 素释放素、促黄体激素(LH)、促黄体激素释放激素(LH-RH)、氯 化溶菌酶、促黑素细胞激素(MSH)、促黑激素、蜂毒肽、促胃动素、 胞壁酰、胞壁酰二肽、神经生长因子(NGF)、神经营养因子类(例如 NT-3、NT-4、CNTF、GDNF、BDNF)、神经肽Y、神经降压肽、催产 素、胰抑制素、胰多肽、肠促胰酶素、甲状旁腺素(PTH)、五肽胃泌 素、多肽YY、垂体腺苷酸环化酶活化多肽类(PACAP)、血小板衍生 生长因子、多粘菌素B、促乳素、促蛋白质合成多肽、PTH相关蛋白、 松弛素、肾素、胰泌素、血清胸腺因子、生长调节素类、生长激素抑制 素类衍生物类、超氧化物岐化酶、taftsin、四肽胃泌素、血小板生成素 (TPO)、胸腺体液因子(THF)、胸腺生成素、胸腺素、胸腺刺激素、 甲状腺激素释放激素、促甲状腺素(TSH)、促甲状腺素释放激素(TRH)、 胰蛋白酶、促吞噬素、肿瘤生长因子(TGF-α)、肿瘤坏死因子(TNF)、 短杆菌酪肽、尿抑胃素、尿激酶、血管活性肠肽和血管加压素。

核心岩藻糖基化和非岩藻糖基化的糖蛋白是重要的生物分子类别， 其在许多生物事件例如细胞粘附、肿瘤转移、病原体感染和免疫应答中 发挥关键作用。正如在本文中前面指明的，岩藻糖基化或非岩藻糖基化 的糖蛋白的结构和功能研究中的主要问题是它们的结构的微观非均质 性。天然和重组的岩藻糖基化或非岩藻糖基化的糖蛋白通常作为仅仅在 附连寡糖的结构方面不同的糖型的混合物被生产。

重塑的糖蛋白例如抗体可以经受任何必需或所需的进一步结构修 饰，包括但不限于糖基转移和选择性连接(例如点击化学、Staudinger 反应等)，以引入其他功能基团或标签。功能基团可以是任何适合的类 型，包括但不限于毒素、特殊抗原(例如α-Gal)、放射活性物质、光 活性物质、PEG等。糖蛋白可以在糖蛋白的叠氮官能团与带有目标功能 组成部分的炔类的“点击化学”环加成反应中进行催化反应。叠氮基和 炔官能团在相应的连接组分中可以被切换，并且可以将糖蛋白用炔基官 能团官能化，并与包含目标组成部分的叠氮官能化的化合物反应。还应 该认识到，可以为点击化学反应设计其他连接对。

按照本文描述的方法生产的核心岩藻糖基化和非岩藻糖基化的抗 体或其片段可用于诊断和治疗。在市场上和/或目前在临床试验中使用 的约三分之二的治疗性蛋白例如单克隆抗体是糖蛋白。然而，在开发基 于糖蛋白的药物中，天然和重组糖蛋白的不同糖型中的结构非均质性提 出了主要障碍，这是因为不同的糖型可能具有不同的生物活性，并且在 表达期间控制糖基化以获得均质的糖型是极为困难的。以前发现的一类 内切糖苷酶的糖基转移活性代表了糖基化工程领域中提高糖蛋白的治 疗和诊断潜力的重要进步，并且本发明的Endo-S突变体能够对核心岩 藻糖基化和非岩藻糖基化的天然和重组糖蛋白进行糖基转移而没有水 解的不利方面。

通过下面的非限制性实施例，更充分示出了本发明的特点和优点。

实施例

EndoS糖苷合成酶突变体的产生及其在完整的单克隆抗体利妥昔 单抗的糖基化重塑中的用途

以前，从几种GH85内切糖苷酶(ENGase)包括EndoA、EndoM 和EndoD，通过负责在水解期间促进噁唑啉鎓离子中间体形成的关键的 天冬酰胺(Asn)残基的定点突变，来制造糖苷合成酶(36-39，43)。 EndoS是属于糖苷水解酶家族18(GH18)的内切糖苷酶(40，41)， 其与最近被显示为具有糖基转移活性的EndoF1、EndoF2和EndoF3在 同一GH家族中(44)。基于EndoS催化的水解也通过如由其他GH18 内切糖苷酶例如EndoF3所证实的(45)涉及噁唑啉鎓离子中间体的形 成的底物辅助的机制来进行的假设，通过鉴定并突变负责促进噁唑啉鎓 离子形成的残基，从EndoS产生了潜在的糖苷合成酶。以前对EndoF3 的结构和突变发生研究显示，165位处的天冬氨酸残基(D165)而不是 如GH85家族的酶中的天冬酰胺残基，负责促进噁唑啉形成，并且E167 残基是用于催化水解的广义酸/碱(45)。EndoS与EndoF3的序列比对 (图2)导致在EndoS中鉴定到两个对催化来说关键的残基：负责促进 噁唑啉鎓离子形成的D233残基(对应于EndoF3中的D165)，和在聚 糖水解中作为广义酸/碱残基的E235残基(等同于EndoF3的E167)， 如图2中所示。在功能上，D233残基应该也分别等同于GH85内切糖 苷酶EndoA、EndoM和EndoD中的N171、N175和N322。因此，遵照 通过噁唑啉鎓离子中间体以底物辅助的机制进行的从EndoA、EndoM和 EndoD产生糖苷合成酶的方法(36-39)，通过EndoS(SEQ ID NO：l) 的定点突变产生了如图17中所示的两种特定突变体D233A(SEQ ID  NO：2)和D233Q(SEQ ID NO：3)。将这些突变体以及野生型EndoS 在大肠杆菌中作为GST融合蛋白以高产率表达(30-40mg/L)，并通过 谷胱甘肽亲和层析进行纯化。

将利妥昔单抗这种治疗性单克隆抗体用作模型mAb，以检查酶的 脱糖基化活性和潜在的糖基转移活性。商品化利妥昔单抗的主要Fc聚 糖是带有0-2个半乳糖组成部分的分别被命名为G0F、G1F和G2F糖型 的核心岩藻糖基化的双触角复杂型寡糖，正如图10中示出的由PNGase F释放出的N-聚糖的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱术 (MALDI-TOF MS)分析所揭示的。用EndoS-GST融合蛋白(在这里 被称为野生型EndoS或EndoS)处理利妥昔单抗引起快速脱糖基化，给 出如图11中所示的相应的Fc N-聚糖(在还原末端处仅具有一个 GlcNAc)，以及在糖基化位点(N297)处带有岩藻糖基化的GlcNAc 二糖组成部分(Fucα1,6GlcNAc)的脱糖基化的利妥昔单抗。这些结果 证实了野生型EndoS对完整IgG的显著的Fc聚糖水解活性，暗示了它 在mAb的糖基化重塑的第一步中的有用性。然后使用脱糖基化的利妥 昔单抗作为受体和几种合成的聚糖噁唑啉作为供体底物，检查了EndoS 及其突变体的糖基转移潜力，如图3A和B中所示。如图4中所示，通 过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和液相色谱质谱 术(LC-MS)分析来监测糖基化重塑过程。在还原条件下，利妥昔单抗 的重链和轻链分别出现在约50KDa和约25KDa处(a，第1道，在图 4A中)。在用野生型EndoS脱糖基化后，重链在约48KDa处显现为单 一条带，表明移除了利妥昔单抗中的两个N-聚糖(每条重链各一个) (a，第2道，在图4A中)。将脱糖基化的利妥昔单抗(1)和合成的 唾液酸聚糖噁唑啉(2)(结构参见图3A)(供体/受体，50：1，摩尔 比)与突变体EndoS-D233A温育，给出糖基转移产物(3)，其重链显 现为比脱糖基化的利妥昔单抗(1)的重链大出约2KDa的单一条带(a， 第3道，图4A)。这一结果表明新的N-聚糖附连于每条Fc重链。将 (1)和(2)与EndoS-D233Q温育给出相同的糖基转移产物(a，第4 道，图4A)。有趣的是，在1h温育内实现对于完整抗体的Fc结构域 来说基本上定量的糖基转移。已发现，更长时间的温育(10h)不导致 糖基转移产物的水解。这些结果表明，两种EndoS突变体是新的高效的 糖苷合成酶，其能够将脱糖基化的完整IgG用复杂型N-聚糖糖基化而 没有产物水解。

通过LC-MS分析对糖基转移进行进一步表征。如图12中所示，将 利妥昔单抗的重链和轻链在LC-MS条件下分离。轻链MS数据的去卷 积给出23 044的质量，其与利妥昔单抗轻链的计算质量(M＝23 042Da) 相一致(47)。如图4A中的图b中所示，重链的MS数据的去卷积给 出三种不同m/z的物质50508、50670和50834，其分别与重链糖型的理 论质量良好相符：G0F，M＝50 515Da；G1F，M＝50 677Da；G2F， M＝50 839Da(47)。如图4B中的图c中所示，脱糖基化的利妥昔单 抗(1)的重链的去卷积的电子喷雾电离质谱术(ESI-MS)在49420处 显示出单一物质，其与带有Fucα1,6GlcNAc二糖组成部分的重链(计算 值，M＝49420Da)匹配良好。如图4B中的图d中所示，在糖基化重 塑后，从糖基转移产物(3)的重链观察到51 426处的单一峰，向利妥 昔单抗的脱糖基化的重链增添了2006Da。这一结果表明唾液酸聚糖从 相应的糖噁唑啉(2)附连到重链。糖基转移产物的SDS-PAGE上的单 一条带和其纯净MS谱，清楚地表明在利妥昔单抗中的Fc结构域的两 个糖基化位点上，糖基转移是基本上定量的(Fc同源二聚体中两个位点 中的任一个的不完全糖基化将导致在还原后观察到Fucα1,6GlcNAc-重 链，M＝49 420Da)。为了进一步证实N-聚糖被特异性附连到Fc结构 域的GlcNAc，通过用特异性水解AsN-聚糖连接之间的酰胺键的PNGase F处理，从糖重塑的利妥昔单抗(3)释放出整个N-聚糖。将释放出的 N-聚糖用荧光标签2-氨基苯甲酰胺(2-AB)标记，并进行荧光高效液 相色谱(HPLC)和MS分析。LC-MS分析清楚地揭示出释放的N-聚糖 是预期的带有核心岩藻糖和末端唾液酸的双触角复杂型N-聚糖，其由 约92％的双唾液酸化的N-聚糖和约8％的单唾液酸化的N-聚糖构成，如 图13b中所示。N-聚糖组成与在用于糖基转移的相应N-聚糖噁唑啉(2) 中发现的比例非常一致。这一结果证实了转移的N-聚糖被特异性附连 到脱糖基化的利妥昔单抗中的GlcNAc引发体。

本文中提出的结果代表了完整IgG单克隆抗体的糖基化重塑的第 一份报告，其中通过组合使用EndoS和基于EndoS的糖苷合成酶得以 实现的高效脱糖基化-重新糖基化方案，将全尺寸天然复杂型N-聚糖整 体转移到Fc结构域。在糖基转移完成后，通过简单的蛋白A亲和层析 将产物纯化，给出明确确定的均质的糖型。应该指出，如图13a中所示， 商品化利妥昔单抗仅含有痕量的唾液酸化糖型。由于已提出唾液酸化 Fc和IgG具有抗炎活性，因此带有完全唾液酸化的Fc N-聚糖的糖工程 化的利妥昔单抗可能获得抗炎功能，因此可能将其治疗覆盖面从癌症治 疗扩展到自体免疫疾病的治疗(21，22)。

除了唾液酸化复杂型N-聚糖噁唑啉(2)之外，EndoS突变体同等 有效地将Man3GlcNAc核心噁唑啉(4)(48)和带有叠氮标签的 N3Man3GlcNAc噁唑啉(6)(49)用于利妥昔单抗糖工程化，分别导 致相应的均质糖型(5)和(7)的形成，如图3A中所示。如图4C中 的图e中所示，糖基转移产物(5)的重链的去卷积的ESI-MS在50112 处显示出单一物质，其与带有Man3GlcNAc2聚糖的利妥昔单抗重链的 计算分子质量(M＝50 109Da)匹配良好。同样地，如图4C中的图f 中所示，糖基转移产物(7)的重链的去卷积的ESI-MS在50143处显 示出单一物质，其与带有N3Man3GlcNAc2聚糖的利妥昔单抗重链的计 算分子质量(M＝50 134Da)良好相符。这些结果再一次表明糖基转移 是基本上定量的。应该指出，将供体/受体的摩尔比降低至25:1仍产生 高效转化，暗示了EndoS糖苷合成酶突变体的显著的糖基转移效率。特 别是，在完整单克隆抗体中的Fc N-聚糖的核心上选择性导入叠氮官能 团，将允许通过点击化学对抗体进行进一步的位点特异性修饰(50，51)， 其可用于标记和靶向目的，或用于扩展抗体糖型的多样性，用于进一步 的结构-活性关系研究。

在与使用EndoS突变体相同的条件下，还试验了野生型EndoS使 用聚糖噁唑啉(2和4)对脱糖基化的利妥昔单抗(1)的糖基转移，并 且观察到当通过LC-MS监测时，仅发现相应的糖基转移产物的短暂形 成，这可能是由产物被野生型酶的快速原位水解而造成的。最近， Scanlan、Davis和合作者报道了关于EndoS的底物特异性的独立的研究， 并证实了野生型EndoS可以将Man3GlcNAc噁唑啉用于脱糖基化的IgG 的高效糖基转移(42)。为了解决这种明显的观察差异，遵照最近的报 道(42)，使用低得多的酶量，在较低温度(4℃)下重新评估了野生 型EndoS的糖基转移效率。使用这种修改的条件，观察到了在初始温育 期时野生型EndoS使用复合的糖噁唑啉(2)对脱糖基化的利妥昔单抗 (1)的显著糖基转移，但是当温育继续时产物逐渐被水解，如图14中 所示。因此，当使用野生型EndoS时，为了捕获糖基转移产物，应该仔 细地控制反应条件。对于实际应用来说，EndoS糖苷合成酶突变体将是 用于高效和完全糖基转移的选择，因为它们不含产物水解活性。

对利妥昔单抗进行糖工程化以提供非岩藻糖基化和半乳糖基化的G2糖 型

对于抗癌疗法来说，非岩藻糖基化的IgG糖型是合乎需要的，这是 因为以前已证实，具有Fc N-聚糖的低岩藻糖含量的mAb显示出提高的 体外ADCC活性和提高的体内抗癌效力，特别是对于带有FcγIIIa受体 的低亲和性F158等位基因的患者来说(16-19，52)。没有高效的方法 可用于将现有的岩藻糖基化mAb(在哺乳动物细胞中生产的重组mAb 的主要糖型)高效转化成非岩藻糖基化的mAb。为了解决这一问题，试 验了一系列可商购的α-岩藻糖苷酶，但是都不能移除完整利妥昔单抗中 的α1,6-岩藻糖，参见图5A和B中的反应图式。这些结果暗示，α-1,6- 岩藻糖组成部分可能被Fc结构域和/或复合的N-聚糖掩蔽，使得α-岩藻 糖苷酶不能接近它。根据理论推断，在脱糖基化后，得到的利妥昔单抗 的Fuc(α1,6)GlcNAc糖型可能更易于α-岩藻糖苷酶的接近。因此，在仅 带有Fuc(α1,6)GlcNAc组成部分的脱糖基化的利妥昔单抗(1)上试验 了几种可商购α-岩藻糖苷酶的活性。已发现，来自于牛肾的非特异性α- 岩藻糖苷酶具有中等活性，并且能够从脱糖基化的利妥昔单抗(1)移 除岩藻糖残基，以给出含有GlcNAc的利妥昔单抗(8)(参见图15A 和B)。尽管由于α-岩藻糖苷酶的中等活性，为了获得EndoS-脱糖基 化的利妥昔单抗的完全脱岩藻糖基化需要相对大量的α-岩藻糖苷酶和 延长的反应时间，但这种α-岩藻糖苷酶活性的发现为获得脱岩藻糖基化 的利妥昔单抗前体(8)以用于进一步的糖工程化提供了可替选的方式。

接下来，确定了糖苷合成酶EndoS-D233A和EndoS-D233Q也有效 地识别(8)中的非岩藻糖基化的GlcNAc，以使用唾液酸化的N-聚糖 噁唑啉(9)进行糖基转移(38)，在基本上定量的转化中提供均质的 非岩藻糖基化的G2糖型(10)，图5。通过蛋白A亲和层析对产物进 行纯化。如图6中所示，糖工程化的产物(10)的身份和纯度通过 SDS-PAGE和LC-MS分析来证实。脱岩藻糖基化的利妥昔单抗(8)在 49 274处显示出单一物质(图6b)，证实了岩藻糖的移除(GlcNAc-利 妥昔单抗的重链的计算值，M＝49 274Da)。糖基转移产物(10)的重 链的去卷积的ESI-MS表现为50 695处的单一物质(图6c)，其与带有 唾液酸化的双触角复杂型N-聚糖Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2的利妥昔 单抗重链的计算分子质量(M＝50693Da)匹配良好。在比较性研究中， 还发现尽管突变体D233A和D233Q识别岩藻糖基化的GlcNAc-利妥昔 单抗(1)和非岩藻糖基化的GlcNAc-利妥昔单抗(8)两者作为受体用 于糖基转移，但两种糖苷合成酶突变体优选使用岩藻糖基化的GlcNAc- 利妥昔单抗(1)作为受体，与非岩藻糖基化的受体(8)相比具有更快 的糖基转移(数据未示出)。合在一起，这些实验结果揭示出从可商购 的单克隆抗体制造非岩藻糖基化和完全半乳糖基化的均质糖型的组合 酶方法。得到的非岩藻糖基化和半乳糖基化的利妥昔单抗预期获得提高 的ADCC和CDC效应子功能，正如以前的研究所建议的(2，16-20， 52)。

对IVIG进行位点选择性Fc糖工程化以提供完全Fc唾液酸化的IVIG糖 型

利妥昔单抗的成功的糖基化重塑促使了审查将化学酶方法用于 IVIG的糖工程化，旨在提高其抗炎活性。IVIG是从数千健康供体的血 浆纯化的合并的IgG级分。最近的研究表明，次要的α2,6-唾液酸化Fc 糖型是IVIG中赋予抗炎活性的活性物质，正如在类风湿性关节炎的小 鼠模型中所证实的(21，22，53，54)。由于唾液酸化的Fc糖型是IVIG 中的次要组分(55)，因此IVIG的抗炎活性对末端Fc唾液酸化的依赖 性可能部分地解释为了提供保护，为什么需要IVIG的高剂量(1-2g/kg) 输注。使用人类α-1,6-唾液酸基转移酶(ST6Gal-I)尝试了Fc和IVIG 的直接唾液酸化，但是效率低，并且在大多数情况下，只获得单唾液酸 化的糖型作为主要产物(22，56)。此外，IVIG中约30％的FAB结构 域是N-糖基化的，并且当对FAB聚糖进行唾液酸化时，IVIG的Fc唾 液酸化的糖型的凝集素富集效率较低(2，57)。因此，如果可以使用 唾液酸化的N-聚糖实现Fc特异性糖工程化而不改变FAB糖基化，将是 非常合乎需要的。

已发现，在温和条件下，EndoS能够选择性地对IVIG的Fc结构域 进行脱糖基化，而不水解FAB结构域处的N-聚糖。此外，如图7中所 示，可以通过EndoS-D233Q突变体，使用唾液酸聚糖噁唑啉(2)对IVIG 的脱糖基化的Fc结构域(11)进行选择性糖基化，以给出Fc完全唾液 酸化的IVIG(12)。首先通过SDS-PAGE分析来监测糖工程化。如图 16中所示，IVIG的脱糖基化和重新糖基化是明显的，正如重链的条带 尺寸的变化所显示的。为了进一步表征IVIG的糖工程化的位点选择性， 通过木瓜蛋白酶消化将FAB和Fc结构域分开(58)。通过蛋白A亲和 层析来分离Fc结构域，并且留在通流物(flow-through)中的FAB结构 域在快速蛋白质液相色谱(FPLC)系统上通过孔径排阻层析来分离。 然后，通过PNGase F处理分开地释放出Fc N-聚糖和FAB N-聚糖，用 2-氨基苯甲酰胺(2-AB)标记(59)，并通过HPLC(荧光检测和定量) 和MS特征研究进行分析。IVIG的糖工程化之前和之后的FAB N-聚糖 和Fc N-聚糖分布情况示出在图8中。已发现，IVIG的Fc糖基化图案 比单克隆抗体利妥昔单抗的Fc糖基化更复杂。除了作为主要组分的 G0F、G1F和G2F糖型之外，存在显著量的单唾液酸化的(峰2和7) 糖型(约10％)和含有平分型GlcNAc的糖型(峰13-15)(5％)(图 8a)。在糖工程化之后，Fc糖基化(通过EndoS-脱糖基化，随后通过 EndoS-D233Q用唾液酸聚糖噁唑啉(2)进行糖基转移)显示出完全唾 液酸化的聚糖(峰1和6)作为主要糖型(>90％)(图8b)。有趣的 是，在糖工程化过程之前和之后，除了产生少量完全唾液酸化的糖型(峰 6)之外，FAB糖基化图案是相似的(比较图8c和d)。这些结果表明， 即使在FAB糖基化存在下，基于EndoS的糖基化重塑过程对于完整IgG 抗体的Fc N-聚糖来说是高度选择性的。本发明的Fc糖工程化方法的显 著的选择性和高效率，提供了将商品化IVIG转变成预期表现出提高的 抗炎活性的完全Fc-唾液酸化的IVIG制备物的新途径，正如在使用小鼠 模型的以前研究中所证实的(21，22，53，54)。

糖工程化的利妥昔单抗与刺激性Fcγ受体(FcγRIIIa)和抑制性Fcγ受 体(FcγRIIb)的结合

通过表面等离子体共振(SPR)分析，检查了利妥昔单抗的重塑的 糖型对相应的Fcγ受体(FcγRIIIa-F158、FcγRIIIa-V158和FcγRIIb)的 亲和性。将利妥昔单抗糖型位点特异性地固定在蛋白A芯片上，并按照 我们以前报道的程序(35)，将各种不同浓度的Fcγ受体作为被分析物 注入。正如预期的，如图9中所示，当与可商购的利妥昔单抗相比时， 非岩藻糖基化的G2糖型对低亲和力和高亲和力FcγIIIa受体 FcγRIIIa-F158和FcγRIIIa-V158两者表现出明显提高的亲和性。G2糖 型(10)与FcγRIIIa-F158和FcγRIIIa-V158的结合的KD值分别为123 ±11和12±2nM，其通过使用BIAcore T100评估软件将结合数据用1:1 的稳态模型进行拟合来获得。另一方面，商品化KD利妥昔单抗与 FcγRIIIa-F158和FcγRIIIa-V158的结合的KD值据估算分别为1042± 155和252±18nM。因此，糖工程化的G2糖型对低亲和力和高亲和力 Fcγ受体(FcγRIIIa-F158和FcγRIIIa-V158)的亲和性比商品化利妥昔 单抗分别高出约9倍和20倍。另一方面，G2糖型和商品化利妥昔单抗 对抑制性Fcγ受体FcγRIIb表现出可比的亲和性，KD值分别为2.3±0.5 和2.0±0.7μΜ。这些结果揭示出糖工程化的利妥昔单抗清楚地获得了 有益功能。应该指出，高亲和力的结合FcγRIIIa的糖型的高效制备，对 于解决在对使用常用MAb的治疗响应性较低或没有响应性的癌症患者 中发现的Fcγ受体多态性的问题来说，在临床上是重要的。在这些患者 中，他们的FcγRIIIa-F158等位基因与高亲和力受体FcγRIIIa-V158等位 基因相比，对治疗性mAb例如利妥昔单抗具有低的亲和性(52，60， 61)。还提出，Fcγ受体介导的效应子功能是HIV中和性抗体实现保护 性免疫的重要机制(62)。因此，本文描述的糖工程化方法可以在生产 对于功能研究以及生物医学应用来说有价值的单克隆抗体的各种确定 糖型中找到广阔应用。

在本文中描述了对完整IgG抗体进行糖工程化的高效的化学酶方 法。通过定点突变产生的两种新的基于EndoS的糖苷合成酶表现出广泛 的底物特异性，能够将唾液酸化和非唾液酸化的和复杂型N-聚糖以及 选择性修饰的N-聚糖核心从相应的聚糖噁唑啉转移到Fc-脱糖基化的完 整抗体。此外，当将α-岩藻糖苷酶充分组合时，脱糖基化/重新糖基化 方法对于核心岩藻糖基化和非岩藻糖基化的IgG抗体两者有效。这些新 发现显著扩展了化学酶方法的范围，并且使完整的单克隆抗体向迄今为 止通过现有方法难以获得的各种明确糖型的高效转化成为可能。预期这 种糖工程化方法可以促进开发具有高治疗效力和/或获得新功能的生物 相似和/或生物更优的生物物质。

材料和方法

单克隆抗体利妥昔单抗(美罗华(rituxan)，Genentech Inc.，South  San Francisco,CA)和IVIG通过Premium Health Services Inc.(Columbia， MD)购买。唾液酸聚糖噁唑啉(2)和非唾液酰复杂型聚糖噁唑啉(5) 按照以前报道的程序合成(38，46)。牛肾α-1-岩藻糖苷酶购自Sigma (St.Louis，MO)和Prozyme(Hayward，CA)。来自于原玻璃蝇节杆 菌(Arthrobacter protophormiae)的内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶 (EndoA)和来自于冻土毛霉(Mucor hiemalis)的内切-β-N-乙酰氨基 葡萄糖苷酶(EndoM)以及它们的突变体按照报道的程序在大肠杆菌中 过量生产(38)。PNGase F购自New England Biolabs(Ipswich，MA)。 液相色谱质谱术(LC-MS)

LC-MS在LXQ系统(Thermo Scientific)上，使用Hypersil GOLD 柱(1.9μm,50x 2.1mm)进行。将IgG样品用0.5％β-巯基乙醇处理并 在60℃加热15min，然后进行LC-MS测量。分析在60℃下进行，使用 含有0.1％甲酸的10-40％MeCN在10min内的线性梯度，以0.25mL/min 的流速洗脱。

电子喷雾电离质谱术(ESI-MS)和基质辅助激光飞行时间质谱术 (MALDI-TOF MS)

ESI-MS谱在Waters Micromass ZQ-4000单一四极质谱仪上测量。 MALDI-TOF MS在Autoflex II MALDI-TOF质谱仪(Bruker Daltonics, Billerica,MA)上进行。使用ProteoMass Peptide MALDI-MS校准试剂 盒(MSCAL2，Sigma/Aldirich)校准仪器。将2,5-二羟基苯甲酸(DHB) 基质用于中性聚糖，并将2',4',6'-三羟基苯乙酮(THAP)用于酸性聚糖。

EndoS和突变体的过表达和纯化

按照以前报道的程序(40，63)，使用由Dr.M.Collin(Lund  University,Sweden)善意提供的质粒pGEX-EndoS将野生型EndoS在大 肠杆菌中过量生产并纯化。使用GENEART定点突变试剂盒 (Invitrogen)，按照制造商的指导产生两种EndoS突变体D233A和 D233Q。将pGEX-EndoS质粒用作模板，并将LA Taq聚合酶(Takara, Japan)用于PCR。突变通过DNA测序来证实，并转化到BL21(DE3) 中。将转化子在含有100mg/L羧苄青霉素的Luria-Bertani培养基中培 养，并用0.1mM异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷在25℃下诱导16h。通 过在4℃下以1700g离心15min来收获细胞。将细胞沉淀物悬浮在含有 溶菌酶和PMSF的磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)中。将裂解的混合物在4 ℃下以16000g离心20min。在离心后，将来自于细胞裂解的上清液施 加到3mL 50％谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B树脂(GE Healthcare)。将样 品在25℃下温育60min，同时轻柔摇动。将树脂施加到10mL柱子 (PD-10GE Healthcare)，并用PBS洗涤5次。向柱子加入500μl谷胱 甘肽洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl，10mM谷胱甘肽，pH 8.0)，在室 温温育5min，收集，然后重复三次。将洗脱的级分合并，并在4℃下 针对磷酸钠缓冲液(50mM，pH 7.0)透析过夜。然后使用Amicon超 离心过滤器10kDa(Millipore)将蛋白质样品浓缩。将浓缩的蛋白样品 通过SDS-PAGE进行分析，并使用Nano-Drop 2000c分光光度计对蛋白 浓度进行定量。野生型EndoS的过量生产得率约为40mg/L，突变体的 得率约为30mg/L。

通过野生型EndoS对利妥昔单抗进行脱糖基化以给出(Fucα1,6) GlcNAc-利妥昔单抗(1)

将Tris-Cl缓冲液(50mM，pH 8.0，2mL)中的商品化利妥昔单 抗(20mg)在37℃下与EndoS(30μg)温育1h。LC-MS和SDS-PAGE 分析表明重链上的N-聚糖完全切开。将反应混合物在用Tris-Cl缓冲液 (20mM，pH 8.0)预平衡的蛋白A-琼脂糖树脂(5mL)柱上进行亲和 层析。将柱子相继用Tris-Cl(20mM，pH 8.0，25mL)和甘氨酸-HCl (20mM，pH 5.0，20mL)清洗。使用甘氨酸-HCl(100mM，pH 2.5， 20mL)释放出结合的IgG，并将洗脱级分立即用Tris-Cl缓冲液(1.0M， pH 8.8)中和。将含有Fc片段的级分合并，并通过离心过滤(Amicon Ultra 离心过滤器，Millipore，Billerica，MA)进行浓缩，以给出(Fucα1,6) GlcNAc-利妥昔单抗(1)(18mg)。LC-MS：(Fucα1,6)GlcNAc-利 妥昔单抗(1)的重链的计算值为M＝49 420Da(47)；实测值(m/z) 为49 420(去卷积数据)。

通过EndoS突变体D233A或D233Q用唾液酸聚糖噁唑啉(2)对 (Fucα1,6)GlcNAc-利妥昔单抗(1)进行糖基转移

将(Fucα1,6)GlcNAc-利妥昔单抗(1)(10mg)和唾液酸化的聚 糖-噁唑啉(2)(10mg)在Tris缓冲液(50mM，pH 7.4，2mL)中， 与EndoS突变体D233A或D233Q(200μg)在30℃下温育。以一定时 间间隔取出等分试样并通过LC-MS进行分析。在2-3h后，LC-MS监 测表明(Fucα1,6)GlcNAc-利妥昔单抗(1)完全反应，给出带有完全 唾液酸化的N-聚糖的糖基转移产物(3)。按照上面描述的程序，将反 应混合物在蛋白A-琼脂糖柱上进行亲和层析。将含有产物的级分合并 并通过超离心进行浓缩，给出唾液酸化的利妥昔单抗(3)(11mg，定 量的)。LC-MS：带有完全唾液酸化的N-聚糖的(3)的重链的计算值 为M＝51 421Da；实测值(m/z)为51 426(去卷积数据)。

通过EndoS-D233Q用Man3GlcNAc噁唑啉(4)和带有叠氮标签的 Man3GlcNAc噁唑啉(6)对(Fucα1,6)GlcNAc-利妥昔单抗(1)进行 糖基转移

按照对(3)的制备所描述的进行糖基转移，以给出相应产物。糖 工程化的利妥昔单抗(5和7)的LC-MS分析：带有岩藻糖基化的 Man3GlcNAc2N-聚糖的(5)的重链的计算值为M＝50 109Da；实测 值(m/z)为50 112(去卷积数据)；带有岩藻糖基化的叠氮基 -Man3GlcNAc2N-聚糖的(7)的重链的计算值为M＝50 134Da；实测 值(m/z)为50 143(去卷积数据)。

通过牛肾α-岩藻糖苷酶对(Fucα1,6)GlcNAc-利妥昔单抗(1)进行脱 岩藻糖基化

将(Fucα1,6)GlcNAc-利妥昔单抗(1)(2mg)在含有0.05叠氮 化钠的磷酸盐缓冲液(50mM，pH 5.5，200μL)中的溶液，与来自于 牛肾的岩藻糖苷酶(Prozyme，5U)在37℃下温育。以一定时间间隔 取出等分试样并通过LC-MS进行分析。在20天后，LC-MS监测指示 (Fucα1,6)GlcNAc-利妥昔单抗(1)的完全脱岩藻糖基化，以给出产 物GlcNAc-利妥昔单抗(2)。按照上面描述的程序在蛋白A柱子上对 反应混合物进行亲和层析。将含有产物的级分合并并通过超离心进行浓 缩，以给出GlcNAc-利妥昔单抗(2)(2mg，定量的)。LC-MS：带 有GlcNAc组成部分的GlcNAc-利妥昔单抗(2)的重链的计算值为M＝ 49 274Da；实测值(m/z)为49274(去卷积数据)。

通过D233Q突变体使用非唾液酸化复杂型聚糖噁唑啉(5)对GlcNAc- 利妥昔单抗(4)进行糖基转移

将GlcNAc-利妥昔单抗(4)(2mg)和噁唑啉(5)(5mg)在 Tris缓冲液(50mM，pH7.4，0.5mL)中的溶液与EndoS-D233Q(200 μg)在37℃下温育。以一定时间间隔取出等分试样并通过LC-MS进行 分析。在2h后，LC-MS监测指示4的完全反应，以给出相应的糖基转 移产物(6)。在蛋白A柱子上对反应混合物进行亲和层析。将含有产 物的级分合并并通过超离心进行浓缩，给出非岩藻糖基化的利妥昔单抗 糖型(6)(2mg，定量的)。LC-MS：带有非岩藻糖基化的N-聚糖的 (6)的重链的计算值为M＝50 693Da；实测值(m/z)为50 695(去 卷积数据)。

通过EndoS在IVIG的Fc结构域处进行位点特异性脱糖基化

将Tris-Cl缓冲液(50mM，pH8.0，2mL)中的商品化IVIG(20mg) 在37℃下与EndoS(SEQ ID NO：1)(30μg)温育1h。在蛋白A柱 上对残留物进行亲和层析，以给出(Fucα1,6)GlcNAc-IVIG(20mg， 定量的)，其中Fc N-聚糖被移除，在N297位点处留下α1,6-岩藻糖基 化的GlcNAc。

通过D233Q突变体使用唾液酸聚糖噁唑啉(2)对(Fucα1,6)GlcNAc-IVIG 进行糖基转移

将(Fucα1,6)GlcNAc-IVIG(3mg)和唾液酸聚糖-噁唑啉(2)(3 mg)在Tris缓冲液(50mM，pH7.4，2mL)中的溶液与D233Q突变 体(SEQ ID NO：2)(60μg)在30℃下温育。在2h后，SDS-PAGE 分析表明(Fucα1,6)GlcNAc-IVIG完全反应，给出糖基转移产物。在 蛋白A柱上对反应混合物进行亲和层析，以提供糖重塑的IVIG(3mg， 定量的)，其中Fc N-聚糖被重塑成完全唾液酸化的复杂型N-聚糖。

表面等离子体共振(SPR)结合实验

使用Biacore T100仪器(GE Healthcare，USA)，通过表面等离子 体共振(SPR)来测量IgG的不同糖型与Fcγ受体之间的结合。使用标 准的伯胺偶联化学，在pH4.5下将5000RU的蛋白A固定在CM5生物 传感器芯片(GE Healthcare)上，以捕获IgG的不同糖型。类似地准备 参比流动池，其中不注入蛋白A。将HBS-P缓冲液(10mM HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，0.05％v/v表面活性剂P20)中的IgG的每种单个糖 型以10μl/min的速率注射到蛋白A表面上，并达到150RU的捕获水 平。以10μl/min的速率注入FcγIIIa和FcγIIb受体的连续稀释液。在每 个循环后，通过以10μl/min的速率注入10mM HCl 30s来再生表面。 使用BIAcore T100软件将数据拟合到1:1的Langmuir结合模型中，以 获得平衡常数(KD)数据。

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本文中引用的所有参考文献的内容为所有目的通过参考并入本文。

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