骨膜素基因的表达抑制核酸分子、骨膜素基因的表达抑制方法及其用途

摘要

本发明提供抑制骨膜素基因的表达的新分子。骨膜素基因的表达抑制核酸分子的特征在于，包含由序列号1～19中的任一个碱基序列构成的核苷酸作为骨膜素基因的表达抑制序列。利用本发明的表达抑制核酸分子，能够抑制骨膜素基因的表达，因此能够用于例如起因于骨膜素基因的表达的眼病，具体来说能够用于增殖性糖尿病视网膜病变或黄斑变性等的治疗。

说明书

技术领域

本发明涉及成为眼病的原因的骨膜素(periostin)基因的表达抑制核酸分子、骨膜素基因的表达抑制方法及其用途。

背景技术

近年来，伴随着糖尿病患者的增加，作为并发症之一的糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy：DR)患者正在增加。糖尿病视网膜病变根据疾病分期而分类为单纯糖尿病视网膜病变、前增殖型糖尿病视网膜病变和增殖型糖尿病视网膜病变(Proliferative Diabetic Retinopathy：PDR)。其中，增殖型糖尿病视网膜病变不仅存在视力降低，而且有可能会失明。

另外，作为眼病，老年性黄斑变性(Age-related Macular Degeneration：AMD)等黄斑变性也同样地成为问题。黄斑变性是因年龄增长或压力等原因而出现黄斑变性、视力降低的疾病。该疾病在严重时也有可能导致失明。

这些眼病的起因是，脉络膜视网膜陷于缺氧状态等，为了补充氧，在视网膜上下形成新生血管。由于新生血管脆弱，因而容易破裂出血，所出的血液会遮蔽光程，因而视力降低。另外，所述新生血管发展为被称作增殖组织的纤维膜，由于该原因，还有可能产生牵引性视网膜脱离。并且，若该状态持续、反复而严重化，则有可能导致失明(专利文献1)。因此，关于这些眼病，要求提供能够成为治疗药的新的候补物质。

有文献报道，这些眼病与骨膜素基因的表达有关(非专利文献1)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2011‐220969号公报

非专利文献

非专利文献1：S.Yoshida et al.,Investigative Ophthalmology&VisualScience,2011,Vol.52,No.8

发明内容

发明要解决的问题

因此，本发明的目的在于提供可抑制骨膜素基因的表达的新分子、以及提供使用了该分子的表达抑制方法和眼病的治疗方法等用途。

用于解决问题的方案

为了达到上述目的，本发明的骨膜素基因的表达抑制核酸分子的特征在于，包含下述(as1)、(as2)或(as3)的核苷酸作为骨膜素基因的表达抑制序列。

(as1)由序列号1～19中的任一个碱基序列构成的核苷酸；

(as2)由所述(as1)的碱基序列中缺失、置换和/或添加了一个或多个碱基的碱基序列构成的、具有骨膜素基因的表达抑制功能的核苷酸；

(as3)由与所述(as1)的碱基序列具有90％以上的同源性的碱基序列构成的、具有骨膜素基因的表达抑制功能的核苷酸。

本发明的组合物的特征在于，其包含本发明的所述表达抑制核酸分子。

本发明的眼病用药物的特征在于，其包含本发明的所述表达抑制核酸分子。

本发明的抑制方法的特征在于，其为骨膜素基因的表达抑制方法，其使用本发明的所述表达抑制核酸分子。

本发明的眼病的治疗方法的特征在于，其包括将本发明的所述表达抑制核酸分子投与患者的步骤。

发明的效果

利用本发明的表达抑制核酸分子，能够进行骨膜素基因的表达抑制。因此，本发明对于骨膜素基因的表达成为原因的眼病、例如增殖型糖尿病视网膜病变或黄斑变性等各种眼病的治疗有效。

附图说明

图1是示出本发明的核酸分子的一例的示意图。

图2是示出本发明的核酸分子的另一例的示意图。

图3是示出本发明的核酸分子的另一例的示意图。

图4是示出本发明的核酸分子的另一例的示意图。

图5是示出本发明的实施例1中的体外的骨膜素基因表达量的相对值的图。

图6是本发明的实施例2的结果，(A)是示出小鼠的眼的纤维性增殖组织的体积的图，(B)是示出小鼠的眼的新生血管的体积的图。

图7是示出本发明的实施例3中的体外的骨膜素基因表达量的相对值的图。

图8是示出本发明的实施例4中的体外的骨膜素基因表达量的相对值的图。

图9是示出本发明的实施例4中的体外的骨膜素基因表达量的相对值的图。

图10是示出本发明的实施例5中的体外的骨膜素基因表达量的相对值的图。

具体实施方式

只要没有特别提及，则本说明书中使用的用语能够以该技术领域中通常所用的含义使用。

<表达抑制核酸分子>

如前所述，本发明的表达抑制核酸分子(下文中也称为“本发明的核酸分子”)的特征在于，其为表达抑制用的核酸分子，包括下述(as1)、(as2)或(as3)的核苷酸作为骨膜素基因的表达抑制序列。

(as1)由序列号1～19中的任一个碱基序列构成的核苷酸；

(as2)由所述(as1)的碱基序列中缺失、置换和/或添加了一个或多个碱基的碱基序列构成的、具有骨膜素基因的表达抑制功能的核苷酸；

(as3)由与所述(as1)的碱基序列具有90％以上的同源性的碱基序列构成的、具有骨膜素基因的表达抑制功能的核苷酸。

下文中，将所述(as1)、(as2)或(as3)的核苷酸称为as核苷酸，分别称为as1核苷酸、as2核苷酸、as3核苷酸。

本发明中，对骨膜素基因的表达的抑制没有特别限制，例如，可以为基因转录自身的抑制，也可以为通过分解基因的转录产物而进行的抑制。另外，骨膜素基因的表达的抑制例如可以为具有本来的功能的骨膜素蛋白质的表达的抑制，在蛋白质被表达的情况下，所述蛋白质例如可以为所述功能被抑制的蛋白质，也可以为所述功能缺失的蛋白质。

所述表达抑制序列例如可以为由所述as核苷酸构成的序列，也可以为包含所述as核苷酸的序列。

对所述表达抑制序列的长度没有特别限制，例如，为18～32碱基长、优选为19～30碱基长、更优选为19、20、21碱基长。本发明中，例如，碱基数的数值范围公开了属于该范围的全部正整数，例如“1～4碱基”的记载是指公开了“1、2、3、4碱基”的全部(以下相同)。

下面示出所述as1核苷酸的序列。需要说明的是，由所述序列号1～19的碱基序列构成的核苷酸、由所述核苷酸构成的表达抑制序列、包含所述核苷酸的表达抑制序列、和包含所述核苷酸的核酸分子分别还有时用以下所示的名称(序列号前的名称)表示。

NI-0079(序列号1)

 5’-AAGUAUUUCUUUUUGGUGC-3’

NI-0080(序列号2)

 5’-GAAGUAUUUCUUUUUGGUG-3’

NI-0081(序列号3)

 5’-AAUCUGGUUCCCAUGGAUG-3’

NI-0082(序列号4)

 5’-UUUCUAGGACACCUCGUGG-3’

NI-0083(序列号5)

 5’-UUGUUUGGCAGAAUCAGGA-3’

NI-0084(序列号6)

 5’-UCAAUAACUUGUUUGGCAG-3’

NI-0085(序列号7)

 5’-AGCUCAAUAACUUGUUUGG-3’

NI-0086(序列号8)

 5’-UUGCUGUUUUCCAGCCAGC-3’

NI-0087(序列号9)

 5’-UGGUUUGCUGUUUUCCAGC-3’

NI-0088(序列号10)

 5’-GAUGCCAAGCCUAAUUGGG-3’

NI-0091(序列号11)

 5’-UGAUUCGAGCACAAUUAAC-3’

NI-0092(序列号12)

 5’-UACUGUUAUACUGUCACCG-3’

NI-0093(序列号13)

 5’-UAAGCACACGGUCAAUGAC-3’

NI-0094(序列号14)

 5’-UAAUUGGGCUACCAGGUCG-3’

NI-0095(序列号15)

 5’-AUCAGAUCGUUGAUUUAGG-3’

NI-0096(序列号16)

 5’-UUCAGGAUAUUAGUGACUC-3’

NI-0097(序列号17)

 5’-UCCUUUCUAGGACACCUCG-3’

NI-0098(序列号18)

 5’-AUCCUUUCUAGGACACCUC-3’

NI-0099(序列号19)

 5’-UUUGCUGUUUUCCAGCCAG-3’

所述as2核苷酸中，对“一个或多个”没有特别限制。“一个或多个”例如为1～7个、优选为1～5个、更优选为1～4个、进一步优选为1个、2个或3个。所述as2核苷酸例如具有与所述as1核苷酸同样的功能即可，更详细来说，具有骨膜素基因的表达抑制功能即可。“和/或”是指至少任一个的含义，还可以表示“选自由……组成的组中的至少1种”(以下相同)。

所述as3核苷酸中，同源性例如为90％以上、优选为93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上。所述as3核苷酸例如具有与所述as1核苷酸同样的功能即可，更详细来说，具有骨膜素基因的表达抑制功能即可。所述同源性例如可以使用BLAST、FASTA等解析软件通过缺省参数算出(以下相同)。

如前所述，所述表达抑制序列可以为由所述as核苷酸构成的序列，也可以为包含所述as核苷酸的序列。在后者的情况下，所述表达抑制序列可以举出例如进一步具有突出的形态。所述表达抑制序列中，所述突出例如可以附加在所述as核苷酸的3’端和5’端中的至少一者，优选附加在所述3’端。

对所述突出没有特别限制，例如，对长度和序列也没有特别限制。所述突出例如可以用(N)_n表示。N为碱基，例如可以为天然的碱基，也可以为人工碱基。所述天然碱基可以举出例如A、C、G、U和T。所述n为正整数，表示突出的碱基长。所述突出(N)_n的长度(n)例如为1、2、3碱基长，优选为1或2碱基长、更优选为2碱基长。所述突出(N)_n的长度为2碱基长以上的情况下(n≥2)，连续的碱基(N)例如可以为相同的碱基，也可以为不同的碱基。所述突出(N)_n的序列例如可以适用siRNA的反义的突出。所述(N)n例如从3’侧或5’侧可以例示出UU、CU、UC、GA、AG、GC、UA、AA、CC、GU、UG、CG、AU、TT等。

所述表达抑制序列具有所述突出的情况下，所述表达抑制序列可以举出例如所述as1核苷酸和所述突出连结而成的序列。作为具体例，可以举出所述as1核苷酸和所述突出连结而成的序列号20～38中的任一个碱基序列(n为正整数)所构成的核苷酸。在以下序列中，(N)_n为突出，没有特别限制，如前所述，其长度(n)优选为2碱基长。另外，在各序列的旁边示出突出的一例(以5’-3’方向记载)，但本发明不限定于此。另外，在下述序列中，除去(N)_n外的区域可以为所述as2核苷酸或所述as3核苷酸。

NI-0079(序列号20)

  TT 5’-AAGUAUUUCUUUUUGGUGC(N)_n-3’

NI-0080(序列号21)

  TT 5’-GAAGUAUUUCUUUUUGGUG(N)_n-3’

NI-0081(序列号22)

  TT 5’-AAUCUGGUUCCCAUGGAUG(N)_n-3’

NI-0082(序列号23)

  TT 5’-UUUCUAGGACACCUCGUGG(N)_n-3’

NI-0083(序列号24)

  TT 5’-UUGUUUGGCAGAAUCAGGA(N)_n-3’

NI-0084(序列号25)

  TT 5’-UCAAUAACUUGUUUGGCAG(N)_n-3’

NI-0085(序列号26)

  TT 5’-AGCUCAAUAACUUGUUUGG(N)_n-3’

NI-0086(序列号27)

  TT 5’-UUGCUGUUUUCCAGCCAGC(N)_n-3’

NI-0087(序列号28)

  TT 5’-UGGUUUGCUGUUUUCCAGC(N)_n-3’

NI-0088(序列号29)

  TT 5’-GAUGCCAAGCCUAAUUGGG(N)_n-3’

NI-0091(序列号30)

  AG 5’-UGAUUCGAGCACAAUUAAC(N)_n-3’

NI-0092(序列号31)

  UC 5’-UACUGUUAUACUGUCACCG(N)_n-3’

NI-0093(序列号32)

  AU 5’-UAAGCACACGGUCAAUGAC(N)_n-3’

NI-0094(序列号33)

  GU 5’-UAAUUGGGCUACCAGGUCG(N)_n-3’

NI-0095(序列号34)

  AU 5’-AUCAGAUCGUUGAUUUAGG(N)_n-3’

NI-0096(序列号35)

  CG 5’-UUCAGGAUAUUAGUGACUC(N)_n-3’

NI-0097(序列号36)

  UG 5’-UCCUUUCUAGGACACCUCG(N)_n-3’

NI-0098(序列号37)

  GU 5’-AUCCUUUCUAGGACACCUC(N)_n-3’

NI-0099(序列号38)

  CU 5’-UUUGCUGUUUUCCAGCCAG(N)_n-3’

本发明的核酸分子优选进一步具有与所述表达抑制序列退火的互补序列。所述互补序列例如包含与所述表达抑制序列中的所述as核苷酸互补的核苷酸(下文中称为互补核苷酸)。所述互补序列可以为包含所述互补核苷酸的序列，也可以为由所述互补核苷酸构成的序列。

所述互补序列例如能够与所述表达抑制序列退火即可。关于所述互补序列中的所述互补核苷酸与所述表达抑制序列中的所述as核苷酸，其互补性例如为90％以上，优选为93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上，更优选为100％。需要说明的是，所述表达抑制序列与所述互补序列优选例如前者的as核苷酸与后者的互补核苷酸显示出前述那样的互补性，前者的as核苷酸以外的区域和后者的互补核苷酸以外的区域可以互补，也可以非互补。在将所述表达抑制序列和所述互补序列比对时，前者的as核苷酸以外的区域和后者的互补核苷酸以外的区域例如可以存在对应的序列，也可以不存在对应的序列。作为具体例，前者的as核苷酸以外的区域和后者的互补核苷酸以外的区域可以举出例如所述突出。即，在将所述表达抑制序列与所述互补序列比对时，所述表达抑制序列可以为突出在3’侧(或5’侧)突出的形状，所述互补序列可以为突出在5’侧(或3’侧)突出的形状。

所述互补核苷酸可以举出例如下述(s1)、(s2)或(s3)的核苷酸。

(s1)由与所述(as1)的碱基序列互补的碱基序列构成的核苷酸；

(s2)由与所述(as2)的碱基序列互补的碱基序列构成的核苷酸；

(s3)由与所述(as3)的碱基序列互补的碱基序列构成的核苷酸。

下面，将所述(s1)、(s2)或(s3)的核苷酸称为s核苷酸，分别称为s1核苷酸、s2核苷酸、s3核苷酸。

所述互补序列例如可以为由所述s核苷酸构成的序列，也可以为包含所述s核苷酸的序列。

对所述互补序列的长度没有特别限制，例如为18～32碱基长、优选为19～30碱基长、更优选为19、20、21碱基长。

下面示出所述s1核苷酸的序列的具体例。所述序列号39～57的序列分别与由所述序列号1～19的碱基序列构成的as1核苷酸完全互补。需要说明的是，由所述序列号39～57的碱基序列构成的核苷酸、由所述核苷酸构成的表达抑制序列、包含所述核苷酸的表达抑制序列、和包含所述核苷酸的核酸分子分别还有时用以下所示的名称(序列号前的名称)表示。

NI-0079(序列号39)

 5’-GCACCAAAAAGAAAUACUU-3’

NI-0080(序列号40)

 5’-CACCAAAAAGAAAUACUUC-3’

NI-0081(序列号41)

 5’-CAUCCAUGGGAACCAGAUU-3’

NI-0082(序列号42)

 5’-CCACGAGGUGUCCUAGAAA-3’

NI-0083(序列号43)

 5’-UCCUGAUUCUGCCAAACAA-3’

NI-0084(序列号44)

 5’-CUGCCAAACAAGUUAUUGA-3’

NI-0085(序列号45)

 5’-CCAAACAAGUUAUUGAGCU-3’

NI-0086(序列号46)

 5’-GCUGGCUGGAAAACAGCAA-3’

NI-0087(序列号47)

 5’-GCUGGAAAACAGCAAACCA-3’

NI-0088(序列号48)

 5’-CCCAAUUAGGCUUGGCAUC-3’

NI-0091(序列号49)

 5’-GUUAAUUGUGCUCGAAUCA-3’

NI-0092(序列号50)

 5’-CGGUGACAGUAUAACAGUA-3’

NI-0093(序列号51)

 5’-GUCAUUGACCGUGUGCUUA-3’

NI-0094(序列号52)

 5’-CGACCUGGUAGCCCAAUUA-3’

NI-0095(序列号53)

 5’-CCUAAAUCAACGAUCUGAU-3’

NI-0096(序列号54)

 5’-GAGUCACUAAUAUCCUGAA-3’

NI-0097(序列号55)

 5’-CGAGGUGUCCUAGAAAGGA-3’

NI-0098(序列号56)

 5’-GAGGUGUCCUAGAAAGGAU-3’

NI-0099(序列号57)

 5’-CUGGCUGGAAAACAGCAAA-3’

如前所述，所述互补序列可以为由所述互补核苷酸构成的序列，也可以为包含所述互补核苷酸的序列。在后者的情况下，所述互补序列可以举出例如进一步具有突出的形态。所述互补序列中，所述突出例如可以附加在所述互补核苷酸的3’端和5’端中的至少一者，优选附加在所述3’端。

对所述突出没有特别限制，可以援引所述表达抑制序列中的记载。所述互补序列中的所述突出(N)_n的序列例如可以适用siRNA的有义的突出。所述(N)n例如从5’侧或3’侧可以例示出UU、CU、UC、CA、AC、GA、AG、GC、UA、AA、CC、UG、GU、CG、AU、TT、GG等。

所述互补序列具有所述突出的情况下，所述互补序列可以举出例如所述s1核苷酸和所述突出连结而成的序列。作为具体例，可以举出所述s核苷酸和所述突出连结而成的序列号58～76中的任一个碱基序列(n为正整数)所构成的核苷酸。在以下序列中，(N)_n为突出，没有特别限制，如前所述，其长度(n)优选为2碱基长。另外，在各序列的旁边示出突出的一例，但本发明不限定于此。另外，在下述序列中，除去(N)_n外的区域可以为所述s2核苷酸或所述s3核苷酸。

NI-0079(序列号58)

 5’-GCACCAAAAAGAAAUACUU(N)_n-3’ TT

NI-0080(序列号59)

 5’-CACCAAAAAGAAAUACUUC(N)_n-3’ TT

NI-0081(序列号60)

 5’-CAUCCAUGGGAACCAGAUU(N)_n-3’ TT

NI-0082(序列号61)

 5’-CCACGAGGUGUCCUAGAAA(N)_n-3’ TT

NI-0083(序列号62)

 5’-UCCUGAUUCUGCCAAACAA(N)_n-3’ TT

NI-0084(序列号63)

 5’-CUGCCAAACAAGUUAUUGA(N)_n-3’ TT

NI-0085(序列号64)

 5’-CCAAACAAGUUAUUGAGCU(N)_n-3’ TT

NI-0086(序列号65)

 5’-GCUGGCUGGAAAACAGCAA(N)_n-3’ TT

NI-0087(序列号66)

 5’-GCUGGAAAACAGCAAACCA(N)_n-3’ TT

NI-0088(序列号67)

 5’-CCCAAUUAGGCUUGGCAUC(N)_n-3’ TT

NI-0091(序列号68)

 5’-GUUAAUUGUGCUCGAAUCA(N)_n-3’ UC

NI-0092(序列号69)

 5’-CGGUGACAGUAUAACAGUA(N)_n-3’ AA

NI-0093(序列号70)

 5’-GUCAUUGACCGUGUGCUUA(N)_n-3’ CA

NI-0094(序列号71)

 5’-CGACCUGGUAGCCCAAUUA(N)_n-3’ GG

NI-0095(序列号72)

 5’-CCUAAAUCAACGAUCUGAU(N)_n-3’ UU

NI-0096(序列号73)

 5’-GAGUCACUAAUAUCCUGAA(N)_n-3’ GA

NI-0097(序列号74)

 5’-CGAGGUGUCCUAGAAAGGA(N)_n-3’ UC

NI-0098(序列号75)

 5’-GAGGUGUCCUAGAAAGGAU(N)_n-3’ CA

NI-0099(序列号76)

 5’-CUGGCUGGAAAACAGCAAA(N)_n-3’ CC

下述表1和表2中例示出所述as核苷酸与所述s核苷酸的组合。本发明不限定于这些例示。另外，在下述序列中，as核苷酸和s核苷酸分别可以在3’端具有(N)n的突出，或者可以在5’端具有(N)n的突出，所述(N)n优选为2碱基长。

[表1]

[表2]

对本发明的核酸分子的结构单元没有特别限制，可以举出例如核苷酸残基。所述核苷酸残基可以举出例如核糖核苷酸残基和脱氧核糖核苷酸残基。所述核苷酸残基可以举出例如未经修饰的非修饰核苷酸残基和经修饰的修饰核苷酸残基。

本发明的核酸分子例如为RNA分子。本发明的核酸分子例如可以为仅由核糖核苷酸残基构成的RNA分子，也可以为除核糖核苷酸残基外还包含脱氧核糖核苷酸残基和/或非核苷酸残基的RNA分子。

本发明的核酸分子例如可以为所述双链核酸分子，也可以为所述单链核酸分子。下面，举出所述双链核酸分子和所述单链核酸分子的例子对本发明的核酸分子进行说明。

(1)双链核酸分子

本发明的核酸分子为双链核酸分子的情况下，只要包含两条单链核酸、且一条单链核酸具有所述表达抑制序列即可。所述双链核酸分子可以举出例如所谓的siRNA、或siRNA的前体等。所述双链核酸分子例如优选一条单链核酸、即其反义链具有所述表达抑制序列，另一条单链核酸、即其有义链具有所述互补序列。所述反义链例如可以为由所述表达抑制序列构成的单链核酸，也可以为包含所述表达抑制序列的单链核酸。所述有义链例如可以为由所述互补序列构成的单链核酸，也可以为包含所述互补序列的单链核酸。

所述双链核酸分子中，对各单链核酸的长度没有特别限制。所述反义链例如为18～32碱基长、优选为19～30碱基长、更优选为19、20、21碱基长。所述有义链例如为18～32碱基长、优选为19～30碱基长、更优选为19、20、21碱基长。

所述反义链和所述有义链优选分别在3’端和5’端的至少一者具有突出。所述突出的长度例如为1、2、3碱基长、优选为1或2碱基长、更优选为2碱基长。对所述突出的序列没有特别限制，可以举出例如前述例示。

(2)单链核酸分子

本发明的核酸分子为单链核酸分子的情况下，只要具有所述表达抑制序列即可，对其它形态没有特别限制。

所述核酸分子例如为由1条单链构成的单链核酸分子，例如，在能够退火的方向具有所述表达抑制序列和所述互补序列。

对所述表达抑制序列和所述互补序列的连结顺序没有特别限制，例如，可以是所述表达抑制序列的3’端与所述互补序列的5’端连结，也可以是所述表达抑制序列的5’端与所述互补序列的3’端连结，优选为前者。所述单链核酸分子例如可以是所述表达抑制序列与所述互补序列直接连结，也可以间接地连结。所述直接连结可以举出例如基于磷酸二酯键的连结。所述间接连结可以举出例如介由连接子区域的连结。

所述连接子区域例如可以由核苷酸残基构成，也可以由非核苷酸残基构成，还可以由所述核苷酸残基和非核苷酸残基构成。所述核苷酸残基可以举出例如核糖核苷酸残基和脱氧核糖核苷酸残基。

下面，作为所述单链核酸分子的具体例，例示出通过分子内退火而在1处具有环的第1形态和在2处具有环的第2形态。本发明不限定于此。

(2-1)第1形态

作为所述单链核酸分子的第1形态，可以举出5’侧区域和3’侧区域相互退火而形成双链结构(茎结构)的分子。这也可称为shRNA(smallhairpin RNA或short hairpin RNA(短发夹RNA))的形态。shRNA为发夹结构，一般具有一个茎区域和一个环区域。

本形态的核酸分子可以举出例如下述结构：包含区域(X)、连接子区域(Lx)和区域(Xc)，且在所述区域(X)与所述区域(Xc)之间连结有所述连接子区域(Lx)。并且，优选所述区域(Xc)与所述区域(X)互补，具体来说，优选所述区域(X)和所述区域(Xc)中的一者包含所述表达抑制序列，另一者包含所述互补序列。所述区域(X)和所述区域(Xc)分别具有所述表达抑制序列和所述互补序列中的任一者，因此所述核酸分子例如能够通过分子内退火在所述区域(X)与所述区域(Xc)之间可形成茎结构，所述连接子区域(Lx)形成环结构。

所述核酸分子例如可以从5’侧至3’侧依次具有所述区域(Xc)、所述连接子区域(Lx)和所述区域(X)，也可以从3’侧至5’侧依次具有所述区域(Xc)、所述连接子区域(Lx)和所述区域(X)。所述表达抑制序列例如可以配置于所述区域(X)和所述区域(Xc)中的任一者，优选配置于所述互补序列的上游侧、即所述互补序列的5’侧。

将本形态的核酸分子的一例示于图1的示意图。图1的(A)为示出所述核酸分子中的各区域的顺序的概要的示意图，图1的(B)为示出所述核酸分子在所述分子内形成双链的状态的示意图。如图1的(B)所示，所述核酸分子在所述区域(Xc)与所述区域(X)之间形成双链，所述Lx区域根据其长度形成环结构。图1只不过示出所述区域的连结顺序和形成双链的各区域的位置关系，例如，各区域的长度、所述连接子区域(Lx)的形状等不限定于此。

所述核酸分子中，所述区域(Xc)和所述区域(X)的碱基数没有特别限制。下面例示出各区域的长度，但本发明不限定于此。

所述核酸分子中，所述区域(X)的碱基数(X)与所述区域(Xc)的碱基数(Xc)的关系例如满足下述(3)或(5)的条件，在前者的情况下，具体来说例如满足下述(11)的条件。

X>Xc···(3)

X-Xc＝1～10、优选为1、2或3、

更优选为1或2···(11)

X＝Xc···(5)

所述区域(X)或所述区域(Xc)包含所述表达抑制序列的情况下，所述区域例如可以为仅由所述表达抑制序列构成的区域，也可以为包含所述表达抑制序列的区域。所述表达抑制序列的碱基数例如如前所述。包含所述表达抑制序列的区域例如可以在所述表达抑制序列的5’侧和/或3’侧进一步具有附加序列。所述附加序列的碱基数例如为1～31碱基、优选为1～21碱基、更优选为1～11碱基。

对所述区域(X)的碱基数没有特别限制。所述区域(X)包含所述表达抑制序列的情况下，其下限例如为19碱基。其上限例如为50碱基、优选为30碱基、更优选为25碱基。所述区域(X)的碱基数的具体例例如为19～50碱基、优选为19～30碱基、更优选为19～25碱基。

对所述区域(Xc)的碱基数没有特别限制。其下限例如为19碱基、优选为20碱基、更优选为21碱基。其上限例如为50碱基、优选为40碱基、更优选为30碱基。

所述连接子区域(Lx)优选为在其自身的区域内部不发生自我退火的结构。所述连接子区域(Lx)例如如前所述可以由所述核苷酸残基构成，也可以由所述非核苷酸残基构成，还可以包含所述两者。

所述连接子区域(Lx)包含所述核苷酸残基的情况下，对其长度没有特别限制。所述连接子区域(Lx)例如优选为所述区域(X)与所述区域(Xc)能够形成双链的长度。关于所述连接子区域(Lx)的碱基数，其下限例如为1碱基、优选为2碱基、更优选为3碱基，其上限例如为100碱基、优选为80碱基、更优选为50碱基、40碱基、30碱基、20碱基、10碱基。

对所述核酸分子的全长没有特别限制。所述核酸分子中，所述碱基数的合计(全长的碱基数)的下限例如为38碱基、优选为42碱基、更优选为50碱基、进一步优选为51碱基、特别优选为52碱基，其上限例如为300碱基、优选为200碱基、更优选为150碱基、进一步优选为100碱基、特别优选为80碱基。所述核酸分子中，除所述连接子区域(Lx)外的碱基数的合计的下限例如为38碱基、优选为42碱基、更优选为50碱基、进一步优选为51碱基、特别优选为52碱基，上限例如为300碱基、优选为200碱基、更优选为150碱基、进一步优选为100碱基、特别优选为80碱基。

(2-2)第2形态

作为所述单链核酸分子的第2形态，可以举出5’侧区域和3’侧区域分别各自进行分子内退火、形成两个双链结构(茎结构)的分子。这可以援引例如国际公开WO2012/005368号公报和WO2012/017979的公开内容。

本形态的核酸分子可以举出例如从5’侧至3’侧依次包含5’侧区域(Xc)、内部区域(Z)和3’侧区域(Yc)的结构。所述内部区域(Z)优选由内部5’侧区域(X)和内部3’侧区域(Y)连结而构成，所述5’侧区域(Xc)与所述内部5’侧区域(X)互补，所述3’侧区域(Yc)与所述内部3’侧区域(Y)互补。并且，优选所述内部区域(Z)、所述5’侧区域(Xc)和所述3’侧区域(Yc)中的至少一者包含所述表达抑制序列。

所述核酸分子中，所述5’侧区域(Xc)与所述内部5’侧区域(X)互补，所述3’侧区域(Yc)与所述内部3’侧区域(Y)互补。因此，在5’侧，所述区域(Xc)向所述区域(X)折回，所述区域(Xc)和所述区域(X)通过自我退火能够形成双链，另外在3’侧，所述区域(Yc)向所述区域(Y)折回，所述区域(Yc)和所述区域(Y)通过自我退火能够形成双链。

如前所述，所述内部区域(Z)由所述内部5’区域(X)和所述内部3’区域(Y)连结而成。所述区域(X)和所述区域(Y)例如直接连结，其间不具有夹杂序列。为了表示所述5’侧区域(Xc)和所述3’侧区域(Yc)的排列关系，所述内部区域(Z)表示为“由所述内部5’侧区域(X)和所述内部3’侧区域(Y)连结而构成”，在所述内部区域(Z)中，所述内部5’侧区域(X)和所述内部3’侧区域(Y)例如在所述核酸分子的使用中不限定为个别的独立的区域。即，例如在所述内部区域(Z)具有所述表达抑制序列的情况下，所述内部区域(Z)中，所述表达抑制序列可以跨越所述区域(X)和所述区域(Y)配置。

所述核酸分子中，所述5’侧区域(Xc)和所述内部5’侧区域(X)例如可以直接连结，也可以间接连结。在前者的情况下，直接连结可以举出例如基于磷酸二酯键的连结。在后者的情况下，可以举出例如以下形态：在所述区域(Xc)和所述区域(X)之间具有连接子区域(Lx)，介由所述连接子区域(Lx)将所述区域(Xc)和所述区域(X)连结。

所述核酸分子中，所述3’侧区域(Yc)和所述内部3’侧区域(Y)例如可以直接连结，也可以间接连结。在前者的情况下，直接连结可以举出例如基于磷酸二酯键的连结。在后者的情况下，可以举出例如以下形态：在所述区域(Yc)和所述区域(Y)之间具有连接子区域(Ly)，介由所述连接子区域(Ly)将所述区域(Yc)和所述区域(Y)连结。

所述核酸分子例如可以具有所述连接子区域(Lx)和所述连接子区域(Ly)两者，也可以具有任一者。在后者的情况下，可以举出例如以下形态：在所述5’侧区域(Xc)和所述内部5’侧区域(X)之间具有所述连接子区域(Lx)，在所述3’侧区域(Yc)和所述内部3’侧区域(Y)之间不具有所述连接子区域(Ly)，即所述区域(Yc)和所述区域(Y)直接连结。另外，在后者的情况下，可以举出例如以下形态：在所述3’侧区域(Yc)和所述内部3’侧区域(Y)之间具有所述连接子区域(Ly)，在所述5’侧区域(Xc)和所述内部5’侧区域(X)之间不具有所述连接子区域(Lx)，即所述区域(Xc)和所述区域(X)直接连结。

所述连接子区域(Lx)和所述连接子区域(Ly)优选为分别在其自身的区域内部不发生自我退火的结构。所述连接子区域(Lx)和所述连接子区域(Ly)例如如前所述可以由所述核苷酸残基构成，也可以由所述非核苷酸残基构成，还可以包含所述两者。

关于本形态的核酸分子，将不具有所述连接子区域的一例示于图2的示意图中。图2的(A)是对所述核酸分子从5’侧向3’侧示出各区域的顺序的概要的示意图，图2的(B)是示出所述核酸分子在所述分子内形成双链的状态的示意图。如图2的(B)所示，所述核酸分子的所述5’侧区域(Xc)折回，在所述5’侧区域(Xc)和所述内部5’侧区域(X)之间形成双链，所述3’侧区域(Yc)折回，在所述3’侧区域(Yc)和所述内部3’侧区域(Y)之间形成双链。图2只不过示出了各区域的连结顺序和形成双链的各区域的位置关系，例如各区域的长度等不限定于此。

关于所述核酸分子，将具有所述连接子区域的一例示于图3的示意图中。图3的(A)是对所述核酸分子从5’侧向3’侧示出各区域的顺序的概要的示意图，图3的(B)是示出所述核酸分子在所述分子内形成双链的状态的示意图。如图3的(B)所示，所述核酸分子在所述5’侧区域(Xc)和所述内部5’侧区域(X)之间、所述内部3’侧区域(Y)和所述3’侧区域(Yc)之间形成双链，所述Lx区域和所述Ly区域为环结构。图3只不过示出了各区域的连结顺序和形成双链的各区域的位置关系，例如各区域的长度等不限定于此。

所述核酸分子中，所述5’侧区域(Xc)、所述内部5’侧区域(X)、所述内部3’侧区域(Y)和所述3’侧区域(Yc)的碱基数没有特别限制。下面例示出各区域的长度，但本发明不限定于此。

所述5’侧区域(Xc)如前所述例如与所述内部5’侧区域(X)的全部区域互补。该情况下，所述5’侧区域(Xc)例如优选为与所述内部5’侧区域(X)相同的碱基长，由与从所述内部5’侧区域(X)的5’端至3’端的全部区域互补的碱基序列构成。所述5’侧区域(Xc)更优选为与所述内部5’侧区域(X)相同的碱基长，且所述5’侧区域(Xc)的全部碱基与所述内部5’侧区域(X)的全部碱基互补，即例如优选为完全互补。需要说明的是，不限定于此，例如如前所述可以一个或多个碱基非互补。

另外，所述5’侧区域(Xc)如前所述例如可以与所述内部5’侧区域(X)的部分区域互补。该情况下，所述5’侧区域(Xc)例如优选为与所述内部5’侧区域(X)的部分区域相同的碱基长，即，由比所述内部5’侧区域(X)短1碱基以上的碱基长的碱基序列构成。所述5’侧区域(Xc)更优选为与所述内部5’侧区域(X)的所述部分区域相同的碱基长，且所述5’侧区域(Xc)的全部碱基与所述内部5’侧区域(X)的所述部分区域的全部碱基互补，即例如优选为完全互补。所述内部5’侧区域(X)的所述部分区域例如优选为所述5’侧区域(X)中的从5’端的碱基(第1位的碱基)连续的碱基序列所构成的区域(片段)。

所述3’侧区域(Yc)如前所述例如可以与所述内部3’侧区域(Y)的全部区域互补。该情况下，所述3’侧区域(Yc)例如优选为与所述内部3’侧区域(Y)相同的碱基长，由与从所述区域(Y)的5’端至3’端的全部区域互补的碱基序列构成。所述3’侧区域(Yc)更优选为与所述内部3’侧区域(Y)相同的碱基长，且所述3’侧区域(Yc)的全部碱基与所述内部3’侧区域(Y)的全部碱基互补，即例如优选为完全互补。需要说明的是，不限定于此，例如如前所述可以一个或多个碱基非互补。

另外，所述3’侧区域(Yc)如前所述例如可以与所述内部3’侧区域(Y)的部分区域互补。该情况下，所述3’侧区域(Yc)例如优选为与所述内部3’侧区域(Y)的部分区域相同的碱基长，即，由比所述内部3’侧区域(Y)短1碱基以上的碱基长的碱基序列构成。所述3’侧区域(Yc)更优选为与所述内部3’侧区域(Y)的所述部分区域相同的碱基长，且所述3’侧区域(Yc)的全部碱基与所述内部3’侧区域(Y)的所述部分区域的全部碱基互补，即例如优选为完全互补。所述内部3’侧区域(Y)的所述部分区域例如优选为所述内部3’侧区域(Y)中的从3’端的碱基(第1位的碱基)连续的碱基序列所构成的区域(片段)。

所述核酸分子中，所述内部区域(Z)的碱基数(Z)与所述内部5’侧区域(X)的碱基数(X)和所述内部3’侧区域(Y)的碱基数(Y)的关系、所述内部区域(Z)的碱基数(Z)与所述5’侧区域(Xc)的碱基数(Xc)和所述3’侧区域(Yc)的碱基数(Yc)的关系例如满足下述式(1)和(2)的条件。

Z＝X+Y···(1)

Z≥Xc+Yc···(2)

所述核酸分子中，对所述内部5’侧区域(X)的碱基数(X)与所述内部3’侧区域(Y)的碱基数(Y)的长度的关系没有特别限制，例如可以满足下式的任一条件。

X＝Y···(19)

X<Y···(20)

X>Y···(21)

所述核酸分子中，所述内部5’侧区域(X)的碱基数(X)、所述5’侧区域(Xc)的碱基数(Xc)、所述内部3’侧区域(Y)的碱基数(Y)和所述3’侧区域(Yc)的碱基数(Yc)的关系例如满足下述(a)～(d)中的任一条件。

(a)满足下述式(3)和(4)的条件。

X>Xc···(3)

Y＝Yc···(4)

(b)满足下述式(5)和(6)的条件。

X＝Xc···(5)

Y>Yc···(6)

(c)满足下述式(7)和(8)的条件。

X>Xc···(7)

Y>Yc···(8)

(d)满足下述式(9)和(10)的条件。

X＝Xc···(9)

Y＝Yc···(10)

所述(a)～(d)中，所述内部5’侧区域(X)的碱基数(X)与所述5’侧区域(Xc)的碱基数(Xc)之差、所述内部3’侧区域(Y)的碱基数(Y)与所述3’侧区域(Yc)的碱基数(Yc)之差例如优选满足下述条件。

(a)满足下述式(11)和(12)的条件。

X-Xc＝1～10、优选为1、2、3或4、

更优选为1、2或3···(11)

Y-Yc＝0···(12)

(b)满足下述式(13)和(14)的条件。

X-Xc＝0···(13)

Y-Yc＝1～10、优选为1、2、3或4、

更优选为1、2或3···(14)

(c)满足下述式(15)和(16)的条件。

X-Xc＝1～10、优选为1、2或3、

更优选为1或2···(15)

Y-Yc＝1～10、优选为1、2或3、

更优选为1或2···(16)

(d)满足下述式(17)和(18)的条件。

X-Xc＝0···(17)

Y-Yc＝0···(18)

关于所述(a)～(d)的核酸分子，将各自的结构的一例示于图4的示意图中。图4是包含所述连接子区域(Lx)和所述连接子区域(Ly)的核酸分子，(A)为所述(a)的核酸分子的例子，(B)为所述(b)的核酸分子的例子，(C)为所述(c)的核酸分子的例子，(D)为所述(d)的核酸分子的例子。图4中，虚线示出通过自我退火形成了双链的状态。图4的核酸分子将所述内部5’侧区域(X)的碱基数(X)和所述内部3’侧区域(Y)的碱基数(Y)作为所述式(20)的“X<Y”表示，但不限定于此，如前所述，可以为所述式(19)的“X＝Y”，也可以为所述式(21)的“X>Y”。另外，图4只不过是示出所述内部5’侧区域(X)与所述5’侧区域(Xc)的关系、所述内部3’侧区域(Y)与所述3’侧区域(Yc)的关系的示意图，例如各区域的长度、形状等不限定于此，另外，连接子区域(Lx)和连接子区域(Ly)的有无也不限定于此。

所述(a)～(c)的核酸分子例如通过所述5’侧区域(Xc)和所述内部5’侧区域(X)、以及所述3’侧区域(Yc)和所述内部3’侧区域(Y)分别形成双链，从而为在所述内部区域(Z)中具有与所述5’侧区域(Xc)和所述3’侧区域(Yc)均无法比对的碱基的结构，也可以称为具有不形成双链的碱基的结构。下面，在所述内部区域(Z)中，将所述无法比对的碱基(也称为不形成双链的碱基)称为“自由碱基”。图4中，将所述自由碱基的区域用“F”表示。对所述区域(F)的碱基数没有特别限制。关于所述区域(F)的碱基数(F)，例如在所述(a)的核酸分子的情况下为“X-Xc”的碱基数，在所述(b)的核酸分子的情况下为“Y-Yc”的碱基数，在所述(c)的核酸分子的情况下为“X-Xc”的碱基数与“Y-Yc”的碱基数的总数。

另一方面，所述(d)的核酸分子例如为所述内部区域(Z)的全部区域与所述5’侧区域(Xc)和所述3’侧区域(Yc)比对的结构，也可以称为所述内部区域(Z)的全部区域形成双链的结构。需要说明的是，所述(d)的核酸分子中，所述5’侧区域(Xc)的5’端与所述3’侧区域(Yc)的3’端未连结。

关于所述核酸分子，下面例示出各区域的长度，但本发明不限定于此。

所述5’侧区域(Xc)、所述3’侧区域(Yc)和所述内部区域(Z)中的所述自由碱基(F)的碱基数的合计例如为所述内部区域(Z)的碱基数。因此，所述5’侧区域(Xc)和所述3’侧区域(Yc)的长度例如可以根据所述内部区域(Z)的长度、所述自由碱基的数(F)及其位置而适宜决定。

所述内部区域(Z)的碱基数例如为19碱基以上。所述碱基数的下限例如为19碱基、优选为20碱基、更优选为21碱基。所述碱基数的上限例如为50碱基、优选为40碱基、更优选为30碱基。所述内部区域(Z)的碱基数的具体例例如为19碱基、20碱基、21碱基、22碱基、23碱基、24碱基、25碱基、26碱基、27碱基、28碱基、29碱基、或30碱基。

所述内部区域(Z)包含所述表达抑制序列的情况下，所述内部区域(Z)例如可以为仅由所述表达抑制序列构成的区域，也可以为包含所述表达抑制序列的区域。所述表达抑制序列的碱基数例如如前所述。所述内部区域(Z)包含所述表达抑制序列的情况下，在所述表达抑制序列的5’侧和/或3’侧可以进一步具有附加序列。所述附加序列的碱基数例如为1～31碱基、优选为1～21碱基、更优选为1～11碱基、进一步优选为1～7碱基。

所述内部区域(Z)中，对所述表达抑制序列的位置没有特别限制，如前所述，可以为所述内部5’侧区域(X)，也可以为所述内部3’侧区域(Y)，还可以跨越所述内部5’区域(X)和所述内部3’侧区域(Y)而配置。所述核酸分子例如在具有所述互补序列的情况下，对其位置也没有特别限制，例如，可以为与所述内部5’侧区域(X)对应的所述5’侧区域(Xc)，也可以为对于所述内部3’侧区域(Y)的所述3’侧区域(Yc)。另外，在所述表达抑制序列跨越所述内部5’区域(X)和所述内部3’侧区域(Y)而配置的情况下，例如，所述互补序列可以被分割成所述5’侧区域(Xc)和所述3’侧区域(Yc)。所述互补序列被分割成两个的情况下，例如，可以为与所述自由碱基相应的部位缺失的序列。

所述5’侧区域(Xc)的碱基数例如为1～29碱基、优选为1～11碱基、更优选为1～7碱基、进一步优选为1～4碱基、特别优选为1碱基、2碱基、3碱基。所述内部区域(Z)或所述3’侧区域(Yc)包含所述表达抑制序列的情况下，例如，优选这样的碱基数。作为具体例，在所述内部区域(Z)的碱基数为19～30碱基(例如19碱基)的情况下，所述5’侧区域(Xc)的碱基数例如为1～11碱基、优选为1～9碱基、1～7碱基、更优选为1～4碱基、进一步优选为1碱基、2碱基、3碱基。

所述5’侧区域(Xc)包含所述表达抑制序列的情况下，所述5’侧区域(Xc)例如可以为仅由所述表达抑制序列构成的区域，也可以为包含所述表达抑制序列的区域。所述表达抑制序列的长度例如如前所述。所述5’侧区域(Xc)包含所述表达抑制序列的情况下，在所述表达抑制序列的5’侧和/或3’侧可以进一步具有附加序列。所述附加序列的碱基数例如为1～11碱基、优选为1～7碱基。

所述3’侧区域(Yc)的碱基数例如为1～29碱基、优选为1～11碱基、更优选为1～7碱基、进一步优选为1～4碱基、特别优选为1碱基、2碱基、3碱基。所述内部区域(Z)或所述5’侧区域(Xc)包含所述表达抑制序列的情况下，例如，优选这样的碱基数。作为具体例，在所述内部区域(Z)的碱基数为19～30碱基(例如19碱基)的情况下，所述3’侧区域(Yc)的碱基数例如为1～11碱基、优选为1～9碱基、1～7碱基、更优选为1～4碱基、进一步优选为1碱基、2碱基、3碱基。

所述3’侧区域(Yc)包含所述表达抑制序列的情况下，所述3’侧区域(Yc)例如可以为仅由所述表达抑制序列构成的区域，也可以为包含所述表达抑制序列的区域。所述表达抑制序列的长度例如如前所述。所述3’侧区域(Yc)包含所述表达抑制序列的情况下，在所述表达抑制序列的5’侧和/或3’侧可以进一步具有附加序列。所述附加序列的碱基数例如为1～11碱基、优选为1～7碱基。

如前所述，所述内部区域(Z)、所述5’侧区域(Xc)和所述3’侧区域(Yc)的碱基数例如可以用所述式(2)的“Z≥Xc+Yc”表示。作为具体例，“Xc+Yc”的碱基数例如与所述内部区域(Z)相同，或者比所述内部区域(Z)更小。在后者的情况下，“Z-(Xc+Yc)”例如为1～10、优选为1～4、更优选为1、2或3。所述“Z-(Xc+Yc)”例如相当于所述内部区域(Z)中的所述自由碱基的区域(F)的碱基数(F)。

所述单链核酸分子中，所述5’侧区域(Xc)的末端和所述3’侧区域(Yc)的末端例如优选在分子内退火的状态下相对于所述内部区域(Z)位于5’侧或3’侧。在前者的情况下，所述5’侧区域(Xc)的碱基数(Xc)和所述3’侧区域(Yc)的碱基数(Yc)为Xc<Yc的关系。并且，碱基数(Xc)例如为1～11碱基、优选为1～9碱基、更优选为1～7碱基、进一步优选为1～4碱基、特别优选为1碱基、2碱基、3碱基，所述5’侧区域(Xc)与所述内部区域(Z)的碱基数(Z)的关系(Xc/Z)例如为1/50～1/2、优选为1/40～1/3、更优选为1/30～1/4。在后者的情况下，所述5’侧区域(Xc)的碱基数(Xc)和所述3’侧区域(Yc)的碱基数(Yc)为Xc>Yc的关系。并且，碱基数(Yc)例如为1～11碱基、优选为1～9碱基、更优选为1～7碱基、进一步优选为1～4碱基、特别优选为1碱基、2碱基、3碱基，所述3’侧区域(Yc)与所述内部区域(Z)的碱基数(Z)的关系(Yc/Z)例如为1/50～1/2、优选为1/40～1/3、更优选为1/30～1/4。

所述连接子区域(Lx)和(Ly)优选为分别在其自身的区域内部不发生自我退火的结构。所述连接子区域(Lx)和(Ly)例如如前所述可以由所述核苷酸残基构成，也可以由所述非核苷酸残基构成，还可以包含所述两者。

所述连接子区域(Lx)和所述连接子区域(Ly)如前所述包含核苷酸残基的情况下，对其长度没有特别限制。所述连接子区域(Lx)例如优选为所述内部5’侧区域(X)与所述5’侧区域(Xc)能够形成双链的长度，所述连接子区域(Ly)例如优选为所述内部3’侧区域(Y)与所述3’侧区域(Yc)能够形成双链的长度。所述连接子区域(Lx)和所述连接子区域(Ly)的长度例如可以相同也可以不同，另外，其碱基序列也可以相同或不同。所述连接子区域(Lx)和所述连接子区域(Ly)的碱基数的下限例如为1碱基、优选为2碱基、更优选为3碱基，其上限例如为100碱基、优选为80碱基、更优选为50碱基、40碱基、30碱基、20碱基、10碱基。关于所述各连接子区域的碱基数，作为具体例，例如可以例示出1～50碱基、1～30碱基、1～20碱基、1～10碱基、1～7碱基、1～4碱基等，但不限定于此。

对所述核酸分子的全长没有特别限制。所述核酸分子中，所述碱基数的合计(全长的碱基数)的下限例如为38碱基、优选为42碱基、更优选为50碱基、进一步优选为51碱基、特别优选为52碱基，其上限例如为300碱基、优选为200碱基、更优选为150碱基、进一步优选为100碱基、特别优选为80碱基。所述核酸分子中，除所述连接子区域(Lx)和连接子区域(Ly)外的碱基数的合计的下限例如为38碱基、优选为42碱基、更优选为50碱基、进一步优选为51碱基、特别优选为52碱基，上限例如为300碱基、优选为200碱基、更优选为150碱基、进一步优选为100碱基、特别优选为80碱基。

本形态的核酸分子例如可以5’端与3’端结合，也可以未结合。在前者的情况下，本形态的核酸分子为环状的单链核酸分子。在后者的情况下，例如出于能够维持两末端的未结合的考虑，本形态的核酸分子优选5’端为非磷酸基。

(2-3)第3形态

作为所述单链核酸分子的第3形态，可以举出所述连接子区域为非核苷酸结构的分子。这可以援引例如国际公开WO2012/005368号公报和WO2012/017979的公开内容。

本形态的核酸分子除了在所述第1形态和所述第2形态的核酸分子中所述连接子区域(Lx)和/或所述连接子区域(Ly)具有非核苷酸结构以外，可以援引前述说明。

对所述非核苷酸结构没有特别限制，可以举出例如吡咯烷骨架、哌啶骨架、聚亚烷基二醇等。所述聚亚烷基二醇可以举出例如聚乙二醇。

所述吡咯烷骨架例如可以为构成吡咯烷的5元环的碳的1个以上被取代的吡咯烷衍生物的骨架，在被取代的情况下，例如优选为C-2的碳以外的碳原子。所述碳例如可以被氮、氧或硫取代。所述吡咯烷骨架例如可以在吡咯烷的5元环内包含例如碳-碳双键或碳-氮双键。所述吡咯烷骨架中，构成吡咯烷的5元环的碳和氮例如可以键合氢，也可以键合后述的取代基。所述连接子区域(Lx)例如可以介由所述吡咯烷骨架中的任一基团与所述区域(X)和所述区域(Xc)结合，所述连接子区域(Ly)例如可以介由所述吡咯烷骨架中的任一基团与所述区域(Y)和所述区域(Yc)结合，优选为所述5元环中的任一个碳原子和氮，优选为所述5元环的2位的碳(C-2)和氮。作为所述吡咯烷骨架，可以举出例如脯氨酸骨架、脯氨醇骨架等。所述脯氨酸骨架和脯氨醇骨架等例如为生物体内物质及其还原体，因此安全性也优异。

所述哌啶骨架例如可以是构成哌啶的6元环的碳的1个以上被取代的哌啶衍生物的骨架，在被取代的情况下，例如优选为C-2的碳以外的碳原子。所述碳例如可以被氮、氧或硫取代。所述哌啶骨架例如可以在哌啶的6元环内包含例如碳-碳双键或碳-氮双键。所述哌啶骨架中，构成哌啶的6元环的碳和氮例如可以键合氢，也可以键合后述的取代基。所述连接子区域(Lx)例如可以介由所述哌啶骨架中的任一基团与所述区域(X)和所述区域(Xc)结合，所述连接子区域(Ly)例如可以介由所述哌啶骨架中的任一基团与所述区域(Y)和所述区域(Yc)结合，优选为所述6元环中的任一个碳原子和氮，更优选为所述6元环的2位的碳(C-2)和氮。

所述连接子区域例如可以仅包含由所述非核苷酸结构构成的非核苷酸残基，也可以包含由所述非核苷酸结构构成的非核苷酸残基与核苷酸残基。

所述连接子区域例如用下述式(I)表示。

所述式(I)中，例如，

X¹和X²各自独立地为H₂、O、S或NH；

Y¹和Y²各自独立地为单键、CH₂、NH、O或S；

R³为与环A上的C-3、C-4、C-5或C-6键合的氢原子或取代基；

L¹为由n个原子构成的亚烷基链，此处，亚烷基碳原子上的氢原子可以被OH、OR^a、NH₂、NHR^a、NR^aR^b、SH、或者SR^a取代，也可以不被取代，或者，

L¹为所述亚烷基链的一个以上碳原子被氧原子取代的聚醚链，

其中，Y¹为NH、O或S的情况下，与Y¹键合的L¹的原子为碳，与OR¹键合的L¹的原子为碳，氧原子彼此不相邻；

L²为由m个原子构成的亚烷基链，此处，亚烷基碳原子上的氢原子可以被OH、OR^c、NH₂、NHR^c、NR^cR^d、SH或者SR^c取代，也可以不被取代，或者，

L²为所述亚烷基链的一个以上碳原子被氧原子取代的聚醚链，

其中，Y²为NH、O或S的情况下，与Y²键合的L²的原子为碳，与OR²键合的L²的原子为碳，氧原子彼此不相邻；

R^a、R^b、R^c和R^d各自独立地为取代基或保护基；

l为1或2；

m为0～30的范围的整数；

n为0～30的范围的整数；

环A中，所述环A上的C-2以外的1个碳原子可以被氮、氧或硫取代，

所述环A内可以包含碳-碳双键或碳-氮双键，

所述区域(Xc)和所述区域(X)分别介由-OR¹-或-OR²-与所述连接子区域(Lx)结合，

所述区域(Yc)和所述区域(Y)分别介由-OR¹-或-OR²-与所述连接子区域(Ly)结合，

此处，R¹和R²可以存在也可以不存在，在存在的情况下，R¹和R²各自独立地为核苷酸残基或所述结构(I)。

所述式(I)中，X¹和X²例如各自独立地为H₂、O、S或NH。所述式(I)中，X¹为H₂意味着X¹和X¹所键合的碳原子一同形成CH₂(亚甲基)。关于X²也同样。

所述式(I)中，Y¹和Y²各自独立地为单键、CH₂、NH、O或S。

所述式(I)中，环A中l为1或2。在l＝1的情况下，环A为5元环，例如为所述吡咯烷骨架。所述吡咯烷骨架可以举出例如脯氨酸骨架、脯氨醇骨架等，可以例示出这些的二价的结构。l＝2的情况下，环A为6元环，例如为所述哌啶骨架。环A中，环A上的C-2以外的1个碳原子可以被氮、氧或硫取代。另外，环A可以在环A内包含碳-碳双键或碳-氮双键。环A例如可以为L型和D型中的任一种。

所述式(I)中，R³为与环A上的C-3、C-4、C-5或C-6键合的氢原子或取代基。R³为所述取代基的情况下，取代基R³可以为一个，也可以为多个，还可以不存在，为多个的情况下，可以相同也可以不同。

取代基R³例如为卤素、OH、OR⁴、NH₂、NHR⁴、NR⁴R⁵、SH、SR⁴或氧基(＝O)等。

R⁴和R⁵例如各自独立地为取代基或保护基，可以相同也可以不同。所述取代基可以举出例如卤素、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、芳基、杂芳基、芳基烷基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、杂环基烯基、杂环基烷基、杂芳基烷基、甲硅烷基、甲硅烷基氧基烷基等。以下相同。取代基R³可以为这些列举的取代基。

所述保护基例如为将反应性高的官能团转换为惰性的官能团，可以举出公知的保护基等。所述保护基可以援引例如文献(J.F.W.McOmie,“ProtectingGroups in Organic Chemistry”Prenum Press,London and New York,1973)的记载。对所述保护基没有特别限制，可以举出例如叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、双(2-乙酰氧基乙基氧基)甲基(ACE)、三异丙基甲硅烷基氧基甲基(TOM)、1-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE)、2-氰基乙氧基甲基(CEM)和甲苯磺酰乙氧基甲基(TEM)、二甲氧基三苯甲基(DMTr)等。R³为OR⁴的情况下，对所述保护基没有特别限制，可以举出例如TBDMS基、ACE基、TOM基、CEE基、CEM基和TEM基等。除此以外，还可以举出含甲硅烷基的基团。以下相同。

所述式(I)中，L¹为由n个原子构成的亚烷基链。所述亚烷基碳原子上的氢原子例如可以被OH、OR^a、NH₂、NHR^a、NR^aR^b、SH、或者SR^a取代，也可以不被取代。或者，L¹可以为所述亚烷基链的1个以上的碳原子被氧原子取代的聚醚链。所述聚醚链例如为聚乙二醇。需要说明的是，Y¹为NH、O或S的情况下，与Y¹键合的L¹的原子为碳，与OR¹键合的L¹的原子为碳，氧原子彼此不相邻。即，例如在Y¹为O的情况下，其氧原子与L¹的氧原子不相邻，OR¹的氧原子与L¹的氧原子不相邻。

所述式(I)中，L²为由m个原子构成的亚烷基链。所述亚烷基碳原子上的氢原子例如可以被OH、OR^c、NH₂、NHR^c、NR^cR^d、SH或者SR^c取代，也可以不被取代。或者，L²可以为所述亚烷基链的1个以上的碳原子被氧原子取代的聚醚链。需要说明的是，Y²为NH、O或S的情况下，与Y²键合的L²的原子为碳，与OR²键合的L²的原子为碳，氧原子彼此不相邻。即，例如在Y²为O的情况下，其氧原子与L²的氧原子不相邻，OR²的氧原子与L²的氧原子不相邻。

对L¹的n和L²的m没有特别限制，各自的下限例如为0，对上限也没有特别限制。n和m例如可以根据所述连接子区域(Lx)或(Ly)的所期望的长度适宜设定。例如，从制造成本和收率等方面出发，n和m分别优选为0～30、更优选为0～20、进一步优选为0～15。n和m可以相同(n＝m)，也可以不同。n+m例如为0～30、优选为0～20、更优选为0～15。

R^a、R^b、R^c和R^d例如各自独立地为取代基或保护基。所述取代基和所述保护基例如与前述相同。

所述式(I)中，氢原子例如各自独立地可以被Cl、Br、F和I等卤素取代。

所述区域(Xc)和所述区域(X)例如分别介由-OR¹-或-OR²与所述连接子区域(Lx)结合，所述区域(Yc)和所述区域(Y)例如分别介由-OR¹-或-OR²与所述连接子区域(Ly)结合。此处，R¹和R²可以存在，也可以不存在。R¹和R²存在的情况下，R¹和R²各自独立地为核苷酸残基或所述式(I)的结构。R¹和/或R²为所述核苷酸残基的情况下，所述连接子区域(Lx)和所述连接子区域(Ly)例如由除了核苷酸残基R¹和/或R²外的所述式(I)的结构所构成的所述非核苷酸残基与所述核苷酸残基形成。R¹和/或R²为所述式(I)的结构的情况下，所述连接子区域(Lx)和所述连接子区域(Ly)例如成为由两个以上的所述式(I)的结构构成的所述非核苷酸残基连结而成的结构。所述式(I)的结构例如可以包含1个、2个、3个或4个。这样，在包含多个所述结构的情况下，所述(I)的结构例如可以直接连结，也可以介由所述核苷酸残基结合。另一方面，R¹和R²不存在的情况下，所述连接子区域(Lx)和所述连接子区域(Ly)例如可以仅由所述式(I)的结构所构成的所述非核苷酸残基形成。

对所述区域(Xc)和所述区域(X)以及所述区域(Yc)和所述区域(Y)、与所述-OR¹-和-OR²-的结合的组合没有特别限制，可以举出例如以下的任一条件。

条件(1)

所述区域(Xc)介由-OR²-与所述式(I)的结构结合，所述区域(X)介由-OR¹-与所述式(I)的结构结合，

所述区域(Yc)介由-OR¹-与所述式(I)的结构结合，所述区域(Y)介由-OR²-与所述式(I)的结构结合。

条件(2)

所述区域(Xc)介由-OR²-与所述式(I)的结构结合，所述区域(X)介由-OR¹-与所述式(I)的结构结合，

所述区域(Yc)介由-OR²-与所述式(I)的结构结合，所述区域(Y)介由-OR¹-与所述式(I)的结构结合。

条件(3)

所述区域(Xc)介由-OR¹-与所述式(I)的结构结合，所述区域(X)介由-OR²-与所述式(I)的结构结合，

所述区域(Yc)介由-OR¹-与所述式(I)的结构结合，所述区域(Y)介由-OR²-与所述式(I)的结构结合。

条件(4)

所述区域(Xc)介由-OR¹-与所述式(I)的结构结合，所述区域(X)介由-OR²-与所述式(I)的结构结合，

所述区域(Yc)介由-OR²-与所述式(I)的结构结合，所述区域(Y)介由-OR¹-与所述式(I)的结构结合。

所述式(I)的结构例如可以例示出下述式(I-1)～式(I-9)，下述式中，n和m与所述式(I)相同。下述式中，q为0～10的整数。

所述式(I-1)～(I-9)中，对n、m和q没有特别限制，如前所述。作为具体例，可以举出：所述式(I-1)中，n＝8，所述(I-2)中，n＝3，所述式(I-3)中，n＝4或8，所述(I-4)中，n＝7或8，所述式(I-5)中，n＝3和m＝4，所述(I-6)中，n＝8和m＝4，所述式(I-7)中，n＝8和m＝4，所述(I-8)中，n＝5和m＝4，所述式(I-9)中，q＝1和m＝4。将所述式(I-4)的一例(n＝8)示于下述式(I-4a)，将所述式(I-8)的一例(n＝5、m＝4)示于下述式(I-8a)。

所述核酸分子中，所述连接子以外的区域的结构单元分别优选所述核苷酸残基。所述各区域例如由下述(1)～(3)的残基构成。

(1)非修饰核苷酸残基

(2)修饰核苷酸残基

(3)非修饰核苷酸残基和修饰核苷酸残基

所述核酸分子中，对所述连接子区域的结构单元没有特别限制，可以举出例如所述核苷酸残基和所述非核苷酸残基。所述连接子区域例如可以仅由所述核苷酸残基构成，也可以仅由所述非核苷酸残基构成，还可以由所述核苷酸残基与所述非核苷酸残基构成。所述连接子区域例如由下述(1)～(7)的残基构成。

(1)非修饰核苷酸残基

(2)修饰核苷酸残基

(3)非修饰核苷酸残基和修饰核苷酸残基

(4)非核苷酸残基

(5)非核苷酸残基和非修饰核苷酸残基

(6)非核苷酸残基和修饰核苷酸残基

(7)非核苷酸残基、非修饰核苷酸残基和修饰核苷酸残基

所述核酸分子具有所述连接子区域(Lx)和所述连接子区域(Ly)两者的情况下，例如，两种结构单元可以相同，也可以不同。作为具体例，可以举出例如：两种连接子区域的结构单元为所述核苷酸残基的形态；两种连接子区域的结构单元为所述非核苷酸残基的形态；一种区域的结构单元为所述核苷酸残基、另一种连接子区域的结构单元为非核苷酸残基的形态；等等。

作为所述单链核酸分子的具体例，下面示出所述第2形态的核酸分子(下文中也称为NK)和所述第3形态的核酸分子(下文中也称为PK)。

下面示出所述NK的具体例。各NK以从5’端至3’端方向的序列示出，5’侧的被四方形包围的区域为所述连接子(Lx)，3’侧的被四方形包围的区域为所述连接子(Lx)，下划线部分为所述as核苷酸。在核心序列中，对所述连接子(Lx)和所述连接子(Ly)的序列没有特别限制，优选为各区域内不产生退火的序列、即形成环的序列。关于各NK，例示出以任意的n示出所述连接子(Lx)和所述连接子(Ly)的序列和以具体的碱基表示的序列。n例如为a、c、g或u(以下相同)。需要说明的是，这些仅为例示，并不限定本发明。

[表3]

下面示出所述PK的具体例。各PK以从5’端至3’端方向的序列示出，5’侧的被四方形包围的区域为所述连接子(Lx)，3’侧的被四方形包围的区域为所述连接子(Lx)，下划线部分为所述as核苷酸。在核心序列中，对所述连接子(Lx)和所述连接子(Ly)的结构没有特别限制，可以举出前述的吡咯烷骨架、哌啶骨架的结构。需要说明的是，这些仅为例示，并不限定本发明。

[表4]

关于NK-0144(序列号84)、NK-0145(序列号86)、NK-0146(序列号88)、NK-0147(序列号90)和NK-0148(序列号92)、以及PK-0076(序列号93)、PK-0077(序列号94)、PK-0078(序列号95)、PK-0079(序列号96)、PK-0080(序列号97)，下面示出茎形成和环形成的状态。下述序列中，箭头表示5’端和3’端未结合，5’表示5’端。另外，下述序列中，下划线部分为所述as核苷酸。

[表5]

下面示出所述NK和PK中的所述as核苷酸的种类。

[表6]

本发明的核酸分子可以举出例如仅由所述核苷酸残基构成的分子、除所述核苷酸残基外还包含所述非核苷酸残基的分子等。本发明的核酸分子中，所述核苷酸残基如前所述例如可以仅为所述非修饰核苷酸残基，也可以仅为所述修饰核苷酸残基，还可以为所述非修饰核苷酸残基和所述修饰核苷酸残基两者。所述核酸分子包含所述非修饰核苷酸残基和所述修饰核苷酸残基的情况下，对所述修饰核苷酸残基的个数没有特别限制，例如为“一个或多个”，具体来说例如为1～5个、优选为1～4个、更优选为1～3个、最优选为1或2个。本发明的核酸分子包含所述非核苷酸残基的情况下，对所述非核苷酸残基的个数没有特别限制，例如为“一个或多个”，具体来说例如为1～8个、1～6个、1～4个、1、2或3个。

所述核酸分子例如除了所述非修饰核糖核苷酸残基外还包含所述修饰核糖核苷酸残基的情况下，对所述修饰核糖核苷酸残基的个数没有特别限制，例如为“一个或多个”，具体来说例如为1～5个、优选为1～4个、更优选为1～3个、最优选为1或2个。对于所述非修饰核糖核苷酸残基的所述修饰核糖核苷酸残基例如可以是核糖残基被脱氧核糖残基取代的所述脱氧核糖核苷酸残基。所述核酸分子例如除了所述非修饰核糖核苷酸残基外还包含所述脱氧核糖核苷酸残基的情况下，对所述脱氧核糖核苷酸残基的个数没有特别限制，例如为“一个或多个”，具体来说例如为1～5个、优选为1～4个、更优选为1～3个、最优选为1或2个。

所述核苷酸残基例如包含糖、碱基和磷酸作为构成要素。所述核苷酸残基如前所述可以举出例如核糖核苷酸残基和脱氧核糖核苷酸残基。所述核糖核苷酸残基例如具有核糖残基作为糖，具有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)作为碱基，所述脱氧核糖残基例如具有脱氧核糖残基作为糖，具有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)作为碱基。

所述核苷酸残基可以举出未修饰核苷酸残基和修饰核苷酸残基。对所述未修饰核苷酸残基而言，所述各构成要素例如与天然存在的物质相同或实质上相同，优选与人体中天然存在的物质相同或实质上相同。

所述修饰核苷酸残基例如为修饰了所述未修饰核苷酸残基的核苷酸残基。所述修饰核苷酸残基例如可以修饰了所述未修饰核苷酸残基的构成要素中的任一者。本发明中，“修饰”例如为所述构成要素的置换、添加和/或缺失、所述构成要素中的原子和/或官能团的置换、添加和/或缺失，可以称为“改変”。所述修饰核苷酸残基可以举出例如天然存在的核苷酸残基、人工修饰的核苷酸残基等。所述天然来源的修饰核苷酸残基例如可以参照Limbach等人(Limbach et al.、1994、Summary：the modified nucleosides of RNA、NucleicAcids Res.22：2183～2196)。另外，所述修饰核苷酸残基例如可以为所述核苷酸的替代物的残基。

所述核苷酸残基的修饰可以举出例如核糖-磷酸骨架(下文中为核糖磷酸骨架)的修饰。

所述核糖磷酸骨架中，例如可以修饰核糖残基。所述核糖残基例如可以修饰2’位碳，具体来说，例如可以将与2’位碳键合的羟基取代为氢或氟等卤素。通过将所述2’位碳的羟基取代为氢，可以将核糖残基取代为脱氧核糖。所述核糖残基例如可以取代为立体异构体，例如可以取代为阿拉伯糖残基。

所述核糖磷酸骨架例如可以取代为具有非核糖残基和/或非磷酸的非核糖磷酸骨架。所述非核糖磷酸骨架可以举出例如所述核糖磷酸骨架的非带电体。被取代为所述非核糖磷酸骨架的所述核苷酸的替代物可以举出例如吗啉代、环丁基、吡咯烷等。除此以外，所述替代物例如还可以举出人工核酸单体残基。作为具体例，可以举出例如PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸)、ENA(2’-O,4’-C-亚乙基桥联核酸)等，优选为PNA。

所述核糖磷酸骨架中，例如可以修饰磷酸基。所述核糖磷酸骨架中，与糖残基最相邻的磷酸基被称为α磷酸基。所述α磷酸基带有负电，其电荷在与糖残基非键合的2个氧原子均匀地分布。所述α磷酸基中的4个氧原子之中，在核苷酸残基间的磷酸二酯键中，与糖残基非键合的2个氧原子在下文中也称为“非键合(non-linking)氧”。另一方面，在所述核苷酸残基间的磷酸二酯键中，与糖残基键合的2个氧原子在下文中称为“键合(linking)氧”。所述α磷酸基例如优选进行成为非带电的修饰、或者成为所述非键合氧中的电荷分布为非对称型的修饰。

所述磷酸基例如可以对所述非键合氧进行取代。所述氧例如可以被S(硫)、Se(硒)、B(硼)、C(碳)、H(氢)、N(氮)和OR(R为烷基或芳基)中的任一种原子取代，优选被S取代。所述非键合氧例如优选两者被取代，更优选两者被S取代。所述修饰磷酸基可以举出例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼代磷酸酯(Boranophosphate)、硼磷酸酯(Boranophosphate ester)、氢膦酸酯(Hydrogen phosphonates)、氨基膦酸酯、烷基或芳基膦酸酯、和磷酸三酯等，其中，优选所述2个非键合氧两者均被S取代的二硫代磷酸酯。

所述磷酸基例如可以取代所述键合氧。所述氧例如可以被S(硫)、C(碳)和N(氮)中的任一种原子取代，所述修饰磷酸基可以举出例如被N取代的交联氨基膦酸酯、被S取代的交联硫代磷酸酯、和被C取代的交联亚甲基膦酸酯等。所述键合氧的取代例如优选在本发明的核酸分子的5’端核苷酸残基和3’端核苷酸残基中的至少一者进行，在5’侧的情况下，优选利用C取代，在3’侧的情况下，优选利用N取代。

所述磷酸基例如可以取代为所述不含磷的连接。所述连接子例如包含硅氧烷、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、环氧乙烷连接子、磺酸酯、磺酰胺、硫代甲酰缩醛、甲酰缩醛、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲基亚氨基、亚甲基肼基、亚甲基二甲基肼基、和亚甲基氧基甲基亚氨基等，优选包含亚甲基羰基氨基和亚甲基甲基亚氨基。

本发明的核酸分子例如可以修饰了3’端和5’端中的至少一者的核苷酸残基。所述修饰例如可以为3’端和5’端中的任一者，也可以为两者。所述修饰例如如前所述，优选对末端的磷酸基进行。所述磷酸基例如可以修饰整体，也可以修饰所述磷酸基中的1个以上的原子。在前者的情况下，例如可以为磷酸基整体的取代，也可以为缺失。

所述末端的核苷酸残基的修饰可以举出例如其它分子的添加。所述其它分子可以举出例如后述的标记物质、保护基等功能性分子。所述保护基可以举出例如S(硫)、Si(硅)、B(硼)、含酯基团等。所述标记物质等功能性分子例如能够用于本发明的核酸分子的检测等。

所述其它分子例如可以附加至所述核苷酸残基的磷酸基，也可以介由间隔物附加至所述磷酸基或所述糖残基。所述间隔物的末端原子例如可以附加或取代到所述磷酸基的所述键合氧、或糖残基的O、N、S或者C。所述糖残基的键合部位例如优选3’位的C或者5’位的C、或与它们键合的原子。所述间隔物例如还可以附加或取代到所述PNA等核苷酸替代物的末端原子。

对所述间隔物没有特别限制，例如可以包含-(CH₂)_n-、-(CH₂)_nN-、-(CH₂)_nO-、-(CH₂)_nS-、O(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂OH、无碱基糖、酰胺、羧基、胺、羟基胺、羟基亚胺、硫醚、二硫化物、硫脲、磺酰胺和吗啉代等、以及生物素试剂和荧光素试剂等。所述式中，n为正整数，优选n＝3或6。

除了这些以外，附加到所述末端的分子可以举出例如色素、插入剂(例如吖啶)、交联剂(例如补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、德克萨卟啉、噻啉)、多环式芳香族烃(例如吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(例如EDTA)、亲油性载体(例如胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆酸、二甲氧基三苯甲基、或吩噁嗪)和肽复合体(例如黑腹果蝇触足肽、Tat肽)、烷基化剂、磷酸、氨基、巯基、PEG(例如PEG-40K)、MPEG、[MPEG]₂、聚氨基、烷基、取代烷基、放射线标记物、酶、半抗原(例如生物素)、输送/吸收促进剂(例如阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶(例如咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑复合体、四氮杂大环的Eu³⁺复合体)等。

本发明的核酸分子的所述5’端例如可以被磷酸基或磷酸基类似物修饰。所述磷酸基可以举出例如5’-磷酸((HO)₂(O)P-O-5’)、5’二磷酸((HO)₂(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)、5’三磷酸((HO)₂(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)、5’-鸟嘌呤核苷帽(7-甲基化或非甲基化、7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)、5’-腺嘌呤核苷帽(Appp)、任意的修饰或非修饰核苷酸帽结构(N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)、5’-硫代磷酸(硫代磷酸酯：(HO)₂(S)P-O-5’)、5’-二硫代磷酸(二硫代磷酸酯：(HO)(HS)(S)P-O-5’)、5’-硫醇代磷酸((HO)₂(O)P-S-5’)、硫取代的一磷酸、二磷酸和三磷酸(例如，5’-α-硫代三磷酸、5’-γ-硫代三磷酸等)、5’-氨基磷酸酯((HO)₂(O)P-NH-5’、(HO)(NH₂)(O)P-O-5’)、5’-烷基膦酸(例如，RP(OH)(O)-O-5’、(OH)₂(O)P-5’-CH₂、R为烷基(例如甲基、乙基、异丙基、丙基等))、5’-烷基醚膦酸(例如，RP(OH)(O)-O-5’、R为烷基醚(例如甲氧基甲基、乙氧基甲基等))等。

所述核苷酸残基中，对所述碱基没有特别限制。所述碱基例如可以为天然的碱基，也可以为非天然的碱基。所述碱基例如可以为天然来源，也可以为合成品。所述碱基例如可以使用一般的碱基、其修饰类似物等。

所述碱基可以举出例如腺嘌呤和鸟嘌呤等嘌呤碱基、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶等嘧啶碱基。除此以外，所述碱基还可以举出肌苷、胸腺嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、nubularine、isoguanisine、杀结核菌素(tubercidine)等。所述碱基可以举出例如2-氨基腺嘌呤、6-甲基化嘌呤等烷基衍生物；2-丙基化嘌呤等烷基衍生物；5-卤代尿嘧啶和5-卤代胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶和6-偶氮胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、5-卤代尿嘧啶、5-(2-氨基丙基)尿嘧啶、5-氨基烯丙基尿嘧啶；8-卤化、氨基化、硫醇化、硫代烷基化、羟基化和其它的8-取代嘌呤；5-三氟甲基化和其它的5-取代嘧啶；7-甲基鸟嘌呤；5-取代嘧啶；6-氮杂嘧啶；N-2、N-6、和O-6取代嘌呤(包含2-氨基丙基腺嘌呤)；5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶；二氢尿嘧啶；3-去氮-5-氮杂胞嘧啶；2-氨基嘌呤；5-烷基尿嘧啶；7-烷基鸟嘌呤；5-烷基胞嘧啶；7-去氮腺嘌呤；N6,N6-二甲基腺嘌呤；2,6-二氨基嘌呤；5-氨基-烯丙基-尿嘧啶；N3-甲基尿嘧啶；取代1,2,4-三唑；2-吡啶酮；5-硝基吲哚；3-硝基吡咯；5-甲氧基尿嘧啶；尿嘧啶-5-氧基乙酸；5-甲氧基羰基甲基尿嘧啶；5-甲基-2-硫尿嘧啶；5-甲氧基羰基甲基-2-硫尿嘧啶；5-甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶；3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿嘧啶；3-甲基胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；N4-乙酰基胞嘧啶；2-硫胞嘧啶；N6-甲基腺嘌呤；N6-异戊基腺嘌呤；2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤；N-甲基鸟嘌呤；O-烷基化碱基等。另外，嘌呤和嘧啶例如包含美国专利第3,687,808号、“Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering”、858～859页、Kroschwitz J.I.编、John Wiley&Sons、1990、和Englisch等、AngewandteChemie、International Edition、1991、30卷、p.613所公开的物质。

除了这些以外，所述修饰核苷酸残基例如还可以包含缺失碱基的残基、即无碱基的核糖磷酸骨架。另外，所述修饰核苷酸残基例如可以使用美国临时申请第60/465,665号(申请日：2003年4月25日)和国际申请第PCT/US04/07070号(申请日：2004年3月8日)中记载的残基，本发明可以援引这些文献。

本发明的核酸分子例如包含标记物质，可以被所述标记物质标记化。对所述标记物质没有特别限制，可以举出例如荧光物质、色素、同位素等。所述标记物质可以举出例如芘、TAMRA、荧光素、Cy3色素、Cy5色素等荧光团，所述色素可以举出例如Alexa488等Alexa色素等。所述同位素可以举出例如稳定同位素和放射性同位素，优选为稳定同位素。所述稳定同位素例如由于暴露的危险性少、也不需要专用的设施，因而操作性优异，另外还能够降低成本。另外，所述稳定同位素例如不存在标记的化合物的物性变化，作为示踪物的性质也优异。对所述稳定同位素没有特别限制，可以举出例如²H、¹³C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、³³S、³⁴S和³⁶S。

本发明的核酸分子如前所述能够抑制骨膜素基因的表达。因此，本发明的核酸分子例如可以作为骨膜素基因的表达成为原因的眼病的治疗剂。本发明中，“治疗”例如包括所述眼病的预防、所述眼病的改善、所述眼病的预后的改善的含义，可以为任意一种。

对所述眼病没有特别限制，可以举出视网膜病变、黄斑变性、翼状胬肉、结膜炎、眼内新生血管、眼手术后的纤维瘢痕等，所述视网膜病变可以举出例如增殖性糖尿病视网膜病变、增殖硝子体视网膜病变等增殖性视网膜病变等。

对本发明的核酸分子的使用方法没有特别限制，例如，向所述投与对象投与所述核酸分子即可。

所述投与对象可以举出例如细胞、组织或器官。所述投与对象可以举出例如人、除人以外的非人动物。所述非人动物可以举出例如小鼠、大鼠、兔、山羊、牛、马、狗等非人哺乳类动物等。所述投与例如可以为体内，也可以为体外。

对所述细胞没有特别限制，可以举出例如人和小鼠等的ARPE-19等视网膜色素上皮细胞、以及NIH3T3等成纤维细胞等各种培养细胞、ES细胞、造血干细胞等干细胞；初代培养细胞等从生物体分离的细胞；等等。所述细胞中排除例如人受精卵、以及人胚胎和人个体内的细胞。

关于本发明的核酸分子，可以参照后述的本发明的组合物、眼病用药物、骨膜素基因的表达抑制方法和眼病的治疗方法等的记载内容。

本发明的核酸分子如前所述能够抑制骨膜素基因的表达，因此例如作为眼病用药物有用。

<表达载体>

本发明的表达载体的特征在于，包含编码本发明的核酸分子的DNA。本发明的表达载体的特征在于包含所述DNA，对其它特征没有任何限制。本发明的表达载体例如以能够表达的方式在载体中插入有所述DNA。对插入所述DNA的载体没有特别限制，例如可以使用一般的载体，可以举出病毒载体和非病毒载体等。所述非病毒载体可以举出例如质粒载体。

利用本发明的载体，例如通过体内或体外的投与，能够在所投与的对象内表达本发明的表达抑制核酸分子。

<组合物>

本发明的组合物的特征在于，其包含本发明的表达抑制核酸分子。

本发明的组合物的特征在于包含所述本发明的表达抑制核酸分子，对其它特征没有任何限制。

利用本发明的组合物能够抑制骨膜素基因的表达，因此本发明的组合物例如还能够称为抑制用试剂。根据本发明，例如通过对存在骨膜素基因的对象、特别是骨膜素基因的表达相对高的对象、被预测相对高的对象进行投与，能够抑制骨膜素基因的表达。投与对象例如如前所述。

另外，本发明的表达抑制核酸分子如前所述能够用于眼病的治疗，因而本发明的组合物还能够称为眼病用的药学组合物、眼病的治疗药、眼病用药物。

根据本发明，例如通过对眼病的患者进行投与，能够抑制骨膜素基因的表达，对所述眼病进行治疗。所述眼病例如如前所述，可以举出增殖型糖尿病视网膜病变、老年性黄斑变性等黄斑变性等。本发明中，“治疗”如前所述例如包括所述眼病的预防、所述眼病的改善、所述眼病的预后的改善的含义，可以为任意一种。

对所述投与方法没有特别限制，例如可以根据投与对象适宜决定。所述投与对象为从生物体分离出的细胞等的情况下，可以举出例如使用转染试剂的方法、电穿孔法、纳米气泡法等。所述投与对象为生物体的情况下，可以举出例如非经口投与、经口投与等。非经口投与可以举出例如局部投与、静脉内投与等。对于所述眼病的投与部位可以举出例如眼、血管等。在对眼直接投与的情况下，对其投与方法没有特别限制，可以举出例如点眼、点入、玻璃体内注射、结膜下注射、眼球筋膜囊下注射、前房内投与等。对本发明的组合物的投与条件例如投与次数、投与量等没有特别限制。

对本发明的组合物的形态没有特别限制，例如为注射液、点滴静脉注射液、点眼液、眼软膏等。

本发明的组合物中，对所述表达抑制核酸分子的混配量没有特别限制。对所述表达抑制核酸分子的投与条件没有特别限制。在玻璃体注射的情况下，例如对人类成人男性的一个眼球每1次的投与量(合计)例如为0.01～10mg、优选为0.1～1mg，投与次数例如为2周～8周1次。本发明的组合物中，关于所述核酸分子的混配量，优选以能够实现所例示的投与条件的浓度含有该核酸分子。

本发明的组合物例如可以仅包含本发明的表达抑制核酸分子，也可以进一步包含其它添加物。对所述添加物的混配量没有特别限制，只要不妨碍所述表达抑制核酸分子的功能即可。对所述添加物没有特别限制，例如优选药学上允许的添加物。对所述添加物的种类没有特别限制，例如可以根据投与对象的种类适宜选择。

本发明的组合物中，所述添加物例如优选与所述表达抑制核酸分子形成复合体。该情况下，所述添加物例如也可以称为复合化剂。本发明的组合物中，通过将所述表达抑制核酸分子形成复合体，例如能够有效地递送所述表达抑制核酸分子。对所述表达抑制核酸分子与所述复合化剂的结合没有特别限制，可以举出例如非共价键。所述复合体可以举出例如包合物。

对所述复合化剂没有特别限制，可以举出聚合物、环糊精、金刚合金等。所述环糊精可以举出例如线性环糊精共聚物、线性氧化环糊精共聚物等。

除此以外，所述添加剂可以举出例如载体、与靶细胞的结合物质、缩合剂、融合剂、赋形剂、基剂、稳定化剂、保存剂等。

<骨膜素基因的表达抑制方法>

如前所述，本发明的抑制方法，其特征在于，其为抑制骨膜素基因的表达的方法，使用所述本发明的表达抑制核酸分子、所述本发明的组合物或所述眼病用药物。本发明的抑制方法的特征在于使用本发明的表达抑制核酸分子，对其它的步骤和条件没有任何限制。

本发明的抑制方法例如包括下述步骤：对存在骨膜素基因的对象、特别是骨膜素基因的表达相对高的对象或被预测相对高的对象投与所述表达抑制核酸分子。通过所述投与步骤，例如使所述投与对象与所述表达抑制核酸分子接触。所述投与对象可以举出例如前述的细胞、组织或器官。所述投与对象例如与前述同样地可以举出人、所述非人动物。所述投与例如可以为体内，也可以为体外。

本发明的抑制方法例如可以单独投与所述表达抑制核酸分子，也可以投与包含所述表达抑制核酸分子的所述本发明的组合物。对所述投与方法没有特别限制，例如可以根据投与对象的种类适宜选择，可以援引前述记载内容。

<治疗方法>

如前所述，本发明的眼病的治疗方法的特征在于包括将本发明的表达抑制核酸分子投与患者的步骤。本发明的治疗方法的特征在于在眼病的治疗中使用本发明的表达抑制核酸分子，对其它的步骤和条件没有任何限制。本发明中作为对象的眼病例如如前所述，可以举出增殖型糖尿病视网膜病变等视网膜病变、老年性黄斑变性等黄斑变性等。

本发明的治疗方法例如可以援引所述本发明的抑制方法等。对所述投与方法没有特别限制，例如如前所述可以为非经口投与和经口投与中的任一种。

<表达抑制核酸分子的使用>

本发明的表达抑制核酸分子是用于抑制骨膜素基因的表达或骨膜素蛋白质的功能的核酸分子、或者是用于眼病的治疗的核酸分子。另外，本发明的表达抑制核酸分子是用于制造骨膜素基因的表达抑制剂或眼病用药物的核酸分子。

下面，通过实施例等来详细说明本发明，但本发明不限定于这些实施例。

实施例

(实施例1)

合成siRNA，确认了体外的人骨膜素基因的表达抑制。

(1)siRNA

作为实施例的siRNA，合成了下述序列的双链RNA。各双链RNA中，上方的序列为有义链、下方的序列为反义链。有义链的3’端的突出和反义链的3’端的突出均是n＝2，为TT。

[表7]

另外，作为阴性对照，使用了将反义链的碱基序列随机打乱(scrambled)的下述双链RNA。

[表8]

NI-0000

  (序列号77)5’-UACUAUUCGACACGCGAAGUU-3’

  (序列号78)3’-UUAUGAUAAGCUGUGCGCUUC-5’

(2)骨膜素基因的表达量的测定

细胞使用了人视网膜色素上皮细胞株ARPE-19(美国模式培养物保藏所：ATCC)。培养条件为37℃、5％CO₂。培养基使用了包含10％FBS的DMEM(Invitrogen)。

首先，在所述培养基中培养细胞，将其培养液分别以400μL、5×10⁴细胞/孔的方式分注到24孔板中，进一步将所述孔中的细胞培养24小时后，使用转染试剂RNAiMAX(Invitrogen)根据所附方案转染所述双链RNA。具体来说，对于每一个所述孔，添加所述双链RNA与所述转染试剂的复合体100μl以及所述细胞的悬浮液400μl(5×10⁴细胞)，使总量为500μl、所述双链RNA的最终浓度为10nmol/L。

转染后，将所述孔中的细胞培养24小时。然后，使用RNeasy MiniKit(Qiagen)根据所附方案回收RNA。接下来，使用逆转录酶(商品名SuperScript III、Invitrogen)根据所附方案由所述RNA合成cDNA。并且，将所得到的cDNA作为模板进行PCR，测定骨膜素基因的表达量和作为内标的β-肌动蛋白基因的表达量。所述骨膜素基因的表达量通过所述β-肌动蛋白基因的表达量进行修正。所述PCR中，骨膜素基因和β-肌动蛋白的扩增分别使用了以下的引物对。将未添加双链RNA的非添加细胞组设为1，相对地比较表达量。

骨膜素基因扩增用引物对

  5’-TGCCCAGCAGTTTTGCCCAT-3’(序列号79)

  5’-CGTTGCTCTCCAAACCTCTA-3’(序列号80)

β-肌动蛋白基因扩增用引物对

  5’-GCCACGGCTGCTTCCAGCTCCTC-3’(序列号81)

  5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGTCAC-3’(序列号82)

需要说明的是，作为对照1，对未添加所述双链RNA和所述转染试剂的细胞也测定了基因表达量(-)。另外，作为对照2，对转染中未添加所述双链RNA而仅添加了所述转染试剂的细胞也测定了基因表达量(mock)。

(3)结果

将这些结果示于图5。图5是示出骨膜素基因表达量的相对值的图，纵轴为相对基因表达量。如图5所示，所述实施例的双链RNA示出了比对照(-和mock)和阴性对照更低的值，因此能够确认均具有表达抑制活性。其中，NI-0079、NI-0082、NI-0083、NI-0084、NI-0085示出了极强的表达抑制活性。

(实施例2)

使用脉络膜新生血管(choroidal neovascularization：CNV)的模型小鼠，通过本发明的核酸分子确认了新生血管和纤维性增殖组织的形成被抑制。

(1)核酸分子

作为实施例的siRNA，使用了所述实施例1的NI-0079。另外，作为实施例的单链核酸分子，使用了以下所示的NK-0144和PK-0076。在NK-0144和PK-0076中，与所述siRNA的反义链共通的序列号1的as1核苷酸用下划线表示。

[表9]

所述PK-0076中，连接子(Lx)和连接子(Ly)的结构为所述(I-8a)所示的下述结构。

阴性对照使用了与所述实施例1相同的NI-0000。

(2)模型小鼠的制作

将Ketalar(注册商标)注射液(50mg/mL)和Selactar(注册商标)2％注射液以体积比9：1进行混合，将该混合液用未添加钙和镁的PBS(-)稀释5倍。用注射器将所得到的麻醉用稀释液以170μL/只的条件注射至小鼠(C57BL/6JJcl、雄性、6-8周龄、日本CLEA)的腹腔，进行全身麻醉。对所述小鼠点眼1滴Mydrin(注册商标)P，进行散瞳，接下来点眼1滴作为隐形眼镜用的角膜安装辅助剂的Scopisol眼科溶液。然后，对麻醉下的小鼠的眼以下述条件照射激光。

设备

ZEISS 30SL-M

设定

功率：100mW

光斑大小：75μm

持续时间：0.1秒、4发射(shots)/眼

(3)核酸分子的投与

对于进行了激光照射的那天和照射第7天的小鼠，点眼1滴Mydrin(注册商标)P进行散瞳，接下来将所述麻醉用稀释液以与前述同样的条件注射至所述小鼠，进行全身麻醉。并且，将制备成0.1nmol/μL的所述核酸分子按照0.1nmol/眼的方式注入所述小鼠的玻璃体内。所述注入中使用33G带针汉密尔顿注射器(#701)，一边用手术用显微镜观察眼球内一边进行。然后，对所述小鼠点眼1滴抗菌点眼药Cravit点眼液(商品名)0.5％。

(4)药效评价

将投与了所述核酸分子的所述小鼠在遮光条件下饲育规定期间(21天)后，通过过量麻醉使其安乐死。从所述小鼠中摘除眼球，用4％PFA(多聚甲醛)固定处理1小时。从固定后的眼球中采集脉络膜，浸渍到所述PBS(-)中。然后，对于所述脉络膜，根据常规方法进行Flat Mount免疫染色，将同工凝集素B4和I型胶原染色。利用荧光显微镜进行基于同工凝集素B4的染色的新生血管的形成确认和基于I型胶原的染色的纤维性增殖组织的形成确认，利用激光共聚焦显微镜由立体构筑图像将新生血管和纤维性增殖组织的体积定量化。定量化中使用了NIS-Elemen作为定量化软件。

将这些结果示于图6。图6中，(A)是示出纤维性增殖组织的体积的图，(B)是示出新生血管的体积的图，各纵轴表示体积(μm³)。

如图6所示，与NI-0000的对照相比，实施例的NI-0079、NK-0144和PK-0076的纤维性增殖组织的体积和新生血管的体积均减少，在实施例中NK-0144显示出更优异的结果，PK-0076显示出进一步优异的结果。由这些结果可知，利用实施例的核酸分子能够抑制纤维性增殖组织和新生血管的增加。

(实施例3)

合成siRNA，确认了体外的人骨膜素基因的表达抑制。

作为实施例的siRNA，合成了下述序列的双链RNA。各双链RNA中，上方的序列为有义链、下方的序列为反义链。有义链的3’端的突出和反义链的3’端的突出均是n＝2。并且，除了使用这些siRNA以外，与所述实施例1同样地测定了相对基因表达量。

[表10]

将这些结果示于图7。图7是示出骨膜素基因表达量的相对值的图，纵轴为相对基因表达量。如图7所示，所述实施例的双链RNA显示出比对照(-和mock)和阴性对照更低的值，因而能够确认均具有表达抑制活性。

(实施例4)

合成单链核酸分子，确认了体外的人骨膜素基因的表达抑制。

作为实施例的单链核酸分子，合成了下述序列的单链RNA(NK和PK)。

下述序列中，将所述as1核苷酸用下划线表示。另外，在作为单链RNA的各PK中，连接子(Lx)和连接子(Ly)的结构分别为所述实施例1中记载的所述(I-8a)的结构。并且，除了使用这些单链核酸分子以外，与所述实施例1同样地测定了相对基因表达量。

[表11]

将这些结果示于图8和9。图8是示出使用单链RNA(NK)时的骨膜素基因表达量的相对值的图，图9是示出使用单链RNA(PK)时的骨膜素基因表达量的相对值的图，两图中纵轴为相对基因表达量。如图8和图9所示，所述实施例的单链RNA均示出比对照(-和mock)和阴性对照更低的值，因而可以确认均具有表达抑制活性。

(实施例5)

合成siRNA，确认了体外的小鼠骨膜素基因的表达抑制。

作为实施例的siRNA，使用了NI-0079～NI-0088和NI-0094～NI-0099。并且，作为细胞，使用小鼠成纤维细胞株NIH3T3，以4×10⁴细胞/孔的方式用于培养，除此以外与所述实施例1同样地测定了相对基因表达量。

将这些的结果示于图10。图10是示出骨膜素基因表达量的相对值的图，纵轴为相对基因表达量。如图10所示，所述实施例的siRNA均示出比对照(-和mock)和阴性对照更低的值，因而可以确认均具有表达抑制活性。

以上，参照实施方式对本申请发明进行了说明，但本申请发明不限定于上述实施方式。对于本申请发明的特征和详细情况，可以在本申请发明的范围内进行本领域技术人员能够理解的各种变更。

本申请要求以2012年3月29日提交的日本申请特愿2012-78114为基础的优先权，将其全部公开内容引入至此。

产业上的可利用性

利用本发明的核酸分子能够抑制骨膜素基因的表达或骨膜素蛋白质的功能。因此，本发明对于骨膜素基因的表达或骨膜素蛋白质成为原因的眼病、具体来说例如增殖型糖尿病视网膜病变和老年性黄斑变性等黄斑变性的治疗有效。