库蚊黄病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种库蚊黄病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法及试剂盒。所述引物和TaqMan探针是根据库蚊黄病毒E基因区段的保守区域设计。试剂盒中包括的上游引物：5'-CACGCCGAACGGACTTCT-3’，下游引物：5’-TCCATTGGCCGCCATATATC-3’、TaqMan探针序列：5'-TTTCGCACCGGAGCAGCCG-3’，5’端标记FAM荧光报告基团、3’端标记TAMRA荧光淬灭基团，扩增的目前片段长度为62bp。该试剂盒可用于检测库蚊黄病毒，具有良好的灵敏度性和特异性，能检测到库蚊黄病毒的最低病毒滴度为10PFU/反应。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中病毒的分子生物学检测方法，特别是涉及库蚊黄病毒的实时荧光定量 RT-PCR检测方法及试剂盒。

背景技术

库蚊黄病毒(Culex flavivirus，CxFV)是一种蚊传虫媒病毒，属黄病毒科黄病毒属，于2003年由日本 学者在淡色库蚊(Culex pipiens)和三带喙库蚊(Culex tritaeniorhynchus)中首次分离到病毒，随后相继在 印度尼西亚、美国、西印度群岛特立尼达、非洲乌干达、南美洲秘鲁、巴西、台湾地区和我国的山东省、 辽宁省等地的多种库蚊属蚊虫中分离到该病毒。随着近年CxFV在全球不同地区的陆续发现，可以将CxFV 分为两种基因型，在两种型别内均存在致细胞病变和非致细胞病变两种表现型。

目前，对蚊虫中CxFV的检测主要采用病毒分离和病毒核酸的普通PCR检测。病毒分离耗时且无法用 于非致病变表型CxFV的检测，普通PCR快捷特异，但易造成污染且检测敏感性低。TaqMan Real-time PCR 是一种实时荧光定量的检测方法，通过检测体系中荧光强度的动态变化对核酸进行定性、定量分析体外扩 增技术。本研究利用TaqMan Real-time PCR技术建立了针对CxFV特异、快捷、敏感、有效的分子检测方 法，为媒介中CxFV的监测与检测提供了技术支持。

发明内容

本发明提供了针对库蚊黄病毒进行实时荧光定量RT-PCR检测的引物和TaqMan探针。

本发明所提供的引物和TaqMan探针，是根据库蚊黄病毒E基因区段最为保守的保守区域设计的，即 可用于检测库蚊黄病毒，也可用于定量检测样本中库蚊黄病毒的核酸拷贝数。

所述引物与探针序列分别为：库蚊黄病毒上游引物：CxFV-E-F：5’-CACGCCGA ACGGACTTCT-3’；下游引物：CxFV-E-R：5'-TCCATTGGCCGCCATATATC-3’；TaqMan探针： CxFV-E-Probe：FAM5’-TTTCgCACCggAgCAgCCg-3’TAMRA，5’端标记FAM荧光报告基团、3’端标记 TAMRA荧光淬灭基团。

所述库蚊黄病毒25uL实时荧光定量RT-PCR检测反应体系，包括：2×ReactionMix12.5μL、Enzyme Mix 1μL、10μM上下游引物与5μM探针各1μL、RNA模板1μL、Nuclease-free water7.5μL。

所述库蚊黄病毒实时荧光定量RT-PCR检测反应体系的最佳扩增条件为：先45℃10min；然后95℃ 10min；最后95℃15s和60℃60s40个循环。

所述库蚊黄病毒实时荧光定量RT-PCR检测反应体系适用于所有荧光定量PCR反应仪。

所述库蚊黄病毒实时荧光定量RT-PCR检测反应构建的病毒数定量分析模型最低检测限为10PFU/反 应。

所述库蚊黄病毒实时荧光定量RT-PCR检测反应通过与普通PCR检测方法对蚊虫标本的检测应用比 较，结果显示该方法具有较常规PCR检测法更加敏感、特异、简便和不易污染的特征。

附图说明

图1为对库蚊黄病毒的特异性检测的扩增曲线；

图2为10倍系列稀释定量库蚊黄病毒的实时荧光定量RT-PCR检测病毒滴度PFU定量分析扩增曲线；

图3为库蚊黄病毒实时荧光定量RT-PCR检测灵敏度的病毒滴度PFU定量分析标准曲线；

具体实施方式

本发明库蚊黄病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法是基于TaqMan Real-time PCR实时荧光定量检测技 术，利用在反应体系中加入荧光基团后产生的荧光信号积累的动态变化，从而实时监测整个反应进程，最 终可通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。本发明还涉及上述检测方法建立所包含的所有内容。

该方法具体步骤为：

(1)引物与探针的设计

选择GenBank发表的世界各地不同年代不同地区分离得到的具有代表性的50株库蚊黄病毒的全基因 组序列，用生物信息学分析软件ClustalX1.8进行E片段基因的序列比对，根据TaqMan PCR引物、探针 设计原则，选择最为保守的1031-1111区域作为扩增的目的基因片段。在此区域内利用Primer Express3.0 辅助设计引物及探针序列，然后进行Blast分析验证E片段基因的广谱性和特异性。序列信息见表1。

表1  CxFV检测体系特异引物与探针序列信息

(2)荧光素的选择

荧光发射基团选用较为常用的FAM基团，荧光淬灭基团选用TAMRA基团。

(3)引物与探针的合成

引物由北京梓熙生物科技有限公司合成，探针由上海生工生物工程有限公司合成并标记，探针5’端标 记FAM荧光报告基团、3’端标记TAMRA荧光淬灭基团。

(4)样品的制备与体系的建立

将库蚊黄病毒的毒株接种到白纹伊蚊卵细胞(C6/36细胞)，3天后细胞出现明显病变，收集细胞培养 上清，并测定培养上清中的病毒滴度为1×10^6.8PFU/mL(PFU：Plaque forming unit)，病毒培养与RNA提取在 BSL-2级生物安全实验室中进行。用QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit从库蚊黄病毒的细胞培 养上清中提取病毒RNA，参照试剂盒说明进行操作。使用并参照ABI公司AgPath-ID^TMOne-stepRT-PCRKit 试剂盒说明建立的PCR反应体系为配制设定组分浓度的25μL体系，具体组分构成见表2。

表2.PCR反应体系组分构成表

组分 体积(μL) 2×Reaction Mix 12.5 Enzyme Mix 1 上游引物(10μM) 1 下游引物(10μM) 1 探针(5μM) 1 样本RNA 2 无核酸酶水 补足至25

设置反应条件为：

(5)库蚊黄病毒实时荧光定量RT-PCR检测体系的验证

用登革1-4型病毒、西尼罗病毒、基因1、3型乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、Tahyna病毒、巴泰病 毒、盖塔病毒，共3属8种11株病毒RNA作为阴性对照样本，与库蚊黄病毒RNA在建立的反应体系中 进行引物与探针的特异性验证。库蚊黄病毒的RNA成功扩增Ct值≤35，其他11个阴性对照毒株的RNA 均无阳性扩增信号。对提取的库蚊黄病毒RNA进行10倍稀释得10^-1-10^-4的4个不同稀释度的病毒RNA， 分别进行4次平行重复实验验证体系的重复稳定性，4次重复实验所得Ct值的标准差均＜0.45，变异系数 均＜1.5％。具体实验数据见表3。

表3.CxFV检测体系重复稳定性结果

(6)阳性质粒标准品RNA的体外转录

合成蚊虫黄病毒E片段基因高度保守区域作为检测目的基因，并克隆至PGEM-Teasy载体中，基因合 成与质粒克隆由北京梓熙生物科技有限公司完成。用TaKaRa公司GoTaq Green Master Mix试剂盒对克隆 质粒中含有目的基因的M13引物进行PCR扩增，用QIAgen公司Gel Extraction Kit试剂盒回收纯化PCR 产物，利用紫外核酸蛋白定量仪对回收的线性化DNA模板定量，用Promega公司RiboMAX Large Scale  RNA Production System T7试剂盒进行目的基因的RNA体外转录。上述操作均按照试剂盒说明进行。

(7)建立相应的定量分析模型

对阳性质粒体外转录的RNA进行定量，按照公式(6.02×10²³)×(转录产物浓度ng/μl)/(转录产物分子 量)＝copies/μL计算RNA拷贝数。对已知浓度RNA进行10倍系列稀释得到1×10¹～1×10⁵copies/μL5 个样品浓度。按照上述的反应体系与反应条件进行RT-PCR扩增。对扩增所得结果进行分析，根据10¹～10⁵copies/μL不同浓度样品的拷贝数和循环阈值(Ct)绘制标准曲线。获得检测体系标准曲线方程为 Y＝-3.913X+42.93，R²＝0.998，扩增效率Eff＝80.1％。通过所得标准曲线知所建立的库蚊黄病毒荧光定量 RT-PCR检测方法的最低检测限为100copies/反应。

对已测定出病毒滴度(1×10^6.8PFU/mL)的培养上清进行系列稀释得到1×10¹～1×10⁶PFU/mL共7 个梯度，用QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit提取各稀释度细胞培养上清中病毒RNA，参照试 剂盒说明进行操作。按照上述的所建立体系与反应条件进行RT-PCR扩增。根据1×10¹～1×10⁶PFU/mL 不同浓度样品的拷贝数和循环阈值(Ct)绘制标准曲线。获得检测体系标准曲线方程为Y＝-3.551X+37.56， R²＝0.994，扩增效率Eff＝91.3％。所建立的库蚊黄病毒荧光定量RT-PCR检测方法的最低检测限为 10PFU/mL。

(8)在实际蚊虫标本中的应用与比较

用普通PCR方法与TaqMan PCR两种方法同时对246批蚊虫标本进行CxFV的病毒核酸检测，普通 PCR检出核酸阳性标本9份，TaqManPCR检出核酸阳性(Ct＜35)标本16份(包括普通PCR阳性9份)。 表明该方法具有更高的敏感性。

(9)结果判断

当待检样本的Ct(阈值)≤35时即判为阳性；当待检样本35＜Ct＜40时需重新检测，如结果仍在35＜Ct＜40 之间则判为阳性，否则判为阴性。无Ct值的待检样本判为阴性。

本发明具有以下优点：

1.首次建立了库蚊黄病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法，检测方法可以直接用于任何标本提取核 酸后的库蚊黄病毒定量检测。

2.本检测方法与其他库蚊黄病毒检测方法相比，灵敏度更高，操作更加简便且可有效防止污染，检 测结果更加直观准确，使检测效率得到很大提高。

3.本检测方法不仅能够评价标本中蚊虫黄病毒的感染状况，同时也为该病毒在与疾病关系方面的进 一步研究提供了有效工具。

综上所述，本发明的目的就是利用TaqMan Real-time PCR技术建立了专门针对库蚊黄病毒的特异、快 捷，更加敏感、有效的分子检测方法。通过序列比对挑选出库蚊黄病毒基因组中E基因片段上高度保守的 序列，在此序列上设计一对引物及一条TaqMan探针，建立实时荧光定量RT-PCR反应体系，进行体系的 特异性与稳定性验证，并初步应用于实际蚊虫标本的检测。本发明方法为今后蚊虫媒介中库蚊黄病毒的检 测与该病毒相关领域的研究提供了有效工具。