一种基于智能手机可读条形码式样的有机磷农残检测方法

摘要

一种基于智能手机可读条形码式样的有机磷农残检测方法，其所述方法是用于有机磷农残微通道的制备；用于39码“+”码的打印制作；用于加入所述有机磷农残微通道中的农残快检试剂；用于智能手机扫描条形码获取扫描结果；用于智能手机扫描条形码截屏获取扫描区数字图片进行色度分析。本发明基于智能手机可读条形码，将智能手机和一维条形码应用到生物、化学分子的定量定性检测中，由于使用的是被广泛使用的智能手机进行检测，且手机条形码扫描软件和手机图像分析软件均可从网上免费下载，因此该方法具有检测速度快，成本低，易于推广的明显优势。

说明书

技术领域

本发明涉及一种有机磷农残快速检测方法，具体地说是将有机磷农残检测液加入以聚碳酸酯（PC）和聚二甲基硅氧烷（PDMS）为材料的微通道中，再将此微通道放到39码“+”的检测区内，利用智能手机上条形码扫描软件对此“生物条形码”进行扫描，并截屏获取工作区域的条形码数字图片，最后分析数字图片检测区的Y值来实现有机磷农残检测的定量分析。

背景技术

随着智能手机功能的逐渐强大以及广泛普及，基于智能手机的医疗即时诊断技术引起了广泛的关注与研究。Ozcan等人在手机上增加显微系统将手机改造成为普通显微镜、荧光显微镜, 实现了血细胞技术（Isa Navruz.; Ahmet F. Coskun.; Justin Wong.; Saqib Mohammad.; Derek Tseng.; Richie Nagi.; Stephen Phillipsand Aydogan Ozcan. Lab Chip. 2013, 13, 4015-4023）以及食物过敏源的检测(Ahmet F. Coskun.; Justin Wong.; Delaram Khodadadi.; Richie Nagi.; Andrew Tey.; and Aydogan Ozcan. Lab Chip. 2013, 13, 636-640)  Ericson等人利用特殊设计的芯片以及软件，结合智能手机的拍照功能，实现了基于比色法的唾液和汗液中pH值的检测(Oncescu V, O'Dell D, Erickson D. Lab Chip, 2013; 12:3232-3238.)以及胆固醇的检测（Oncescu V, Mancuso M, Erickson D. Lab Chip, 2014; 14: 759-763. Shen等人（Li Shen.; Joshua A. Hagen.;Ian Papautsky. LabChip. 2012, 12, 4240–4243）利用智能手机的拍照功能并且结合特殊色彩分析软件实现了pH值检测；G.M.Whitesides（Martinez, A.W.; Phillips, S.T.; Carrilho, E.M.; Thomas, S.W.; Sindi, H.; Whitesides, G.M. Anal. Chem. 2008, 80, 3699-3707.）使用智能手机的照相功能，对在微通道内反应完毕的待测样品进行成像，利用电脑软件对所获取的数字图像进行量化分析实现了尿液中葡萄糖的检测。Wang等人（Wang, S.; Zhao, X.; Khimiji, I.; Akbas, R.; Qiu, W.; Edwards, D.; Cramer, D.W.; Ye, B.; Demirci, U. Lab Chip. 2011, 11, 3411. ），使用酶联免疫法定量检测尿液中卵巢癌生物标记HE4的含量，通过智能手机成像，利用手机上安装的软件对获取的数字图像进行相应的分析最后获得检测结果。

以上研究成果，让人们看到了智能手机在未来医疗诊断中巨大的潜力，但是由于增加了需要精密加工的光学附件以及特殊设计的信号接收分析系统，这实际上已经失去了面向普通用户的利用智能手机进行即时检测的真正意义与价值。

一维条形码（barcode）是指一组规则排列的条和空，条是指反射率小的部分，空是指反射率大的部分。条和空的不同排列方式代表不同的意义，传统意义的条形码的条和空分别为打印的黑条和白条，本申请专利提出的生物检测条形码是利用生物、化学检测中的显色结果作为条形码的条与空，更为重要的是利用普通智能手机的免费条形码扫描APP就可以实现条形码的解码。

需要指出的是2003年Mirkin（Nam, J.-M.; Thaxton, C.S.; Mirkin, C.A. Science. 2003, 301, 1884-1886）等人发明的生物条形码检测技术与本申请专利提出的生物检测条形码完全不同。本申请专利提出的是真正意义的条形码结构，利用现有的条形码编码解码原理就可以实现生物分子的快速诊断与检测，而Mirkin等人提出的生物条形码检测技术是在纳米金颗粒探针上结合一系列DNA链，只是利用了条形码的数字标记概念，和实际应用中的条形码设计及读取无任何关联。

发明人为李晓春等人，公开号为103674856A发明专利“基于扫描及色度分析的微通道用于有机磷农残速测方法技术领域”提出了一种适合扫描的微通道，并利用分析色度值进而实现对有机磷农残的快速、定量检测方法，该专利利用不容易受到外部光源干扰的扫描仪获取数字图片并对其进行定量分析。该技术的不足之处扫描仪体积较大不方便携带并且获取的数字图片需要导入电脑用专业色彩分析软件Photoshop进行分析，因此不利于广泛普及应用。

申请人为国家纳米科学中心的张翼，张兴，蒋兴宇的公开号为CN103272656A发明专利“条形码微流控芯片及其用途”与本申请专利有本质的区别。该专利利用Codabar条码的“：”与“1”、EAN码的“0”和“3”结构的特殊性将条码编码规则融入到微流控芯片的设计中，该方法将一维条码的每个条区设置为通道区域，每个通道是由基底和具有凹陷的部分可逆地贴合而形成微流通道，微流通道利用通入管道和排出管道来实现样品或者试剂的通入和排出，最后通过条码读取装置直接识读生化检测反应后产生条码图案。该技术的不足之处通道所需要的凹陷部分的制备工艺比较复杂且在实施中作为通道区域的条区数量较多因而需要制备通道数量较多，同时需要专业的条形码识读装置，从而不利于广泛普及应用。

本申请专利中涉及到的“生物条形码”是将39码的条作为检测区，利用智能手机上的APP软件扫描条形码，检测区待测物浓度的不同而得到不同的结果。本实验中用到的一维条形码是39码，39码是一种可表示数字、字母等信息的条码，主要用于工业、图书及票证的自动化管理。39码的每一个字符由5个条和4个空共9个单元组成，这9个单元仅有两种宽度，其中3个宽单元9个窄单元，因此称为39码。标准的39码是由起始符、编码符、终止符构成，39码的起始符和终止符是相同的均由“*”码表示。39码被挑选出来应用到本实验中是因为它编码规则简单且没有校验码。本实验利用39码表示的“+”码和“-”码，这两个条形码的起始符、终止符完全相同，并且其编码区的仅有后四个单元不同，利用“+”码和“-”码结构的特性，在“+”码的虚线部位作为检测区（图1），检测区反应完毕后，用智能手机安装的条形码扫描软件对此条码扫描，如果扫描结果为“-”，代表结果显阴性；扫描结果为“+”，代表结果显阳性。

发明内容

本发明要解决的具体技术问题是现有农残快速检测比色法只能进行半定量检测，存在较多的假阳性结果，而快速定量检测法则需要专业的光谱仪，存在检测成本高，不利于推广的缺点。本发明提供一种基于智能手机可读条形码式样的有机磷农残检测方法，其目的是将待测样品制作成特殊的“生物条形码”，利用智能手机的条码扫描功能以及图像分析功能，实现对有机磷农残进行快速定量检测。

本发明上述所提供的一种基于智能手机可读条形码式样的有机磷农残检测方法，其所述方法是按下列步骤进行：

用于有机磷农残微通道的制备；

用于加入所述有机磷农残微通道中的农残快检试剂；

用于39码“+”码的打印制作；

用于智能手机扫描条形码获取扫描结果；

用于智能手机扫描条形码获取扫描区数字图片进行色度分析。

基于上述技术方案，本发明进一步的技术方案如下。

所述用于有机磷农残微通道的制备是由透明基底层、透明通道层与透明覆盖层通过物理吸附结合而构成。其中，透明基底层是透明塑料薄膜、透明薄硅片和透明薄石英片中的一种；透明通道层是由PDMS聚合物制成的厚度为1mm的薄片，并在薄片上开设有至少一条纵向通道的农残快检微通道孔，PDMS聚合物的组成及其含量按质量比为聚二甲基甲基乙烯基硅氧烷与聚二甲基甲基氢硅氧烷=10：1混合，再置于60~80℃的干燥箱中烘烤50~100min；透明覆盖层是PC板且PC板的长度短于PDMS上内嵌的两个纵向通道孔的长度，使两个纵向通道孔两端均形成一个矩形孔以用于加样和通气。

所述农残快检试剂的组成及其含量按体积比为碘代硫代乙酰胆碱﹕二硫代二硝基苯甲酸﹕乙酰胆碱酯酶﹕果蔬农残待检液 = 1﹕1﹕1﹕20，进行混合获得。其中，果蔬农残待检液是苹果、蔬菜或芹菜中的一种的农残提取液。

所述用于39码“+”码的打印制作，是将39码的“+”码打印到A4纸上，在“+”码的检测区剪切两个20mm×3mm的矩形镂空形状且与检测区相应位置对应的矩形检测区。

所述用于智能手机扫描条形码获取扫描结果是用智能手机对条形码进行扫描，“+”代表结果为阳性，“-”代表结果为阴性。

所述有机磷农残检测微通道数字图片的获取是截屏获取智能手机扫描条形码工作区域的图片，并利用手机图像分析应用程序获取色度值Y，从而得到待检样品中有机磷农残的浓度。

实施本发明上述所提供的一种基于智能手机可读条形码式样的有机磷农残检测方法，与现有农残检测技术相比，具有如下优点：（1）自制农残检测微通道具有多通量检测、重复使用、成本低廉等优点；（2）条形码处于扫描模式下手机截屏获取图片；（3）扫描条形码时打开手机闪光灯从而避免检测区出现阴影而导致乱码的出现同时保证每次扫描的条形码的照度值一致；（6）采用手机图像分析软件直接读取检测图片的颜色信息，方便快捷；（7）智能手机已普及到每个家庭当中，条形码扫描软件及手机图像分析软件均可从网上免费下载安装。

附图说明

图1 是本发明所基于39码“+”与“-”结构特殊性的通道设计原理图。

图2是本发明有机磷农残检测微通道设计及本发明有机磷农残用智能手机扫描条形码过程图。

图3是本发明“生物条形码”设计原理图。

图4是本发明有机磷农残检测标准品检测条码扫描工作区域条码截屏图片。

图5是本发明有机磷农残标准曲线。

具体实施方式

实施一种基于智能手机可读条形码式样的有机磷农残检测方法，其所述方法是以PC为基底，在其上面分别覆盖按照一定尺寸设计好的PDMS微通道薄膜和PC表面覆盖层，形成厚度为几毫米厚的透明、多通量、每个通道均留有溶液加入孔和通气孔的微通道。将有机磷农残检测液加入微通道中，再将微通道放到39码“+” 码的检测区，用智能手机条形码扫描软件对此“生物条形码”进行扫描，记录扫描结果。在扫描的同时，手机截屏获取工作区域的条形码图片，最后利用手机图像分析软件分析检测区的色度值Y，Y值的变化量定量检测农残的浓度。

下面以甲基对硫磷农残检测为例，对本发明的具体实施方式做出进一步的说明。

一种基于智能手机扫描条形码用于有机磷农残速测方法的实施， 

（1）条形码模板设计：利用Coreldraw软件设计39码“+”码，本实验甲基对硫磷检测液最终呈黄色，故条形码的条用CMYK通道设计填充颜色，C、M、K值均设为0，Y值设为100，得到黄色“+”码，条形码高度设置为20mm，宽单元宽度为6mm，窄单元宽度为3mm；用喷墨打印机将设计好的条形码按照1:1比例打印到A4纸上；在“+”码的检测区（即编码区的 第6个单元和第9个单元的后半部分），并制作成两个20mm×3mm的矩形镂空形状。

（2）有机磷微通道的制备：选用道康宁公司产品Sylgard 184硅橡胶来制备PDMS薄膜，具体步骤是：（1）选用方形培养皿作为陈放PDMS液体混合物的载体。分别取制备PDMS所用材料基质与固化剂按照10:1比例放入上述培养皿中混合均匀。 (2)按上述步骤1所述模板的检测区，对检测区所需要的PDMS通道进行剪切得到两个间隔3mm的22mm×4mm的透明通道层，裁剪长度为50mm×35mm的透明PC，将透明通道层通过物理吸附作用吸附在PC上，裁剪28mm×20mm的透明PC层通过物理吸附作用覆盖在透明通道层上面，覆盖层PC的两端分别留有加样孔和通气孔，即完成微通道的制备。

（3）农残检测标准曲线制作：以100μg/mL丙酮中的甲基对硫磷农药标准品作为母液溶于缓冲液中，配制成浓度分别为0、0.005、0.008、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、μg/mL的甲基对硫磷农药，将不同浓度甲基对硫磷农药200μL置于离心管内，再分别取10μL显色液和10μL酶液置于每个离心管内，30~40℃下，温育20~30min。取10μL底物分别加入每个离心管内，反应5~10min后，从离心管内取50~100μL农残检测液加入上述步骤2所述微通道内。

（4）“生物条形码”制备：将上述步骤3中加入反应完毕的有机磷农残检测液的微通道至于上述步骤1中的矩形镂空检测区“1”“2”下，条形码反面粘一层胶带（抠除检测区域胶带），将微通道与条形码粘合避免扫描因有缝隙出现阴影而得到乱码，从而也可以保证条形码可以反复使用，“生物条形码”制备完成。

（5）扫描获取微通道检测数字图片：将手机水平至于光学支架上，用手机上安装的条形码扫描软件对放在光学平台上的条形码扫描，结果出现前截屏获取扫描区域的条形码图片。

（6）色度分析制备标准曲线：手机图像分析软件打开上述步骤5中保存的图片，分别读取不同浓度下检测区域的色度值Y。结果表明：Y值的变化量随甲基对硫磷检测液浓度的增大而减小。以此制作标准曲线图，如图5所示。

（7）果蔬中的有机磷农残检测：以果蔬中的苹果、梨、葡萄、菠菜、油麦菜中的苹果为例进行甲基对硫磷农残检测。以100μg/mL丙酮中的甲基对硫磷农药标准品作为母液溶于缓冲液中，配制成浓度为100, 60, 40, 20μg/mL的甲基对硫磷溶液。超纯水清洗3次，表皮水珠自然风干后，将以上浓度的甲基对硫磷农药喷洒在苹果表面上，等待3~10个小时以后，苹果表皮农残自然风干。削取5~10g苹果表皮溶于5~10mL的缓冲液中，快速摇匀1~5min，提取上述溶液，于离心机内离心1~3min，取200μL上层清液作为农残待检液加入离心管内。再分别取10μL显色液和10μL酶液置于离心管内，30~40℃下，温育20~30min。取10μL底物分别加入离心管内，反应5~10min后，从离心管内取50~100μL农残快检试剂加入上述步骤2所述微通道中的任一微通道内等待扫描。