来自芽孢杆菌的新型甲醇脱氢酶

摘要

本发明涉及核酸分子，其编码具有醇脱氢酶活性、特别是甲醇脱氢酶活性的多肽，其包含或具有选自下组的核苷酸序列：(i)如SEQ ID NOs:1(mdh2-MGA3)、3(mdh3-MGA3)或5(mdh2-PB1)中任一项示出的核苷酸序列；(ii)与SEQ ID NOs:1、3或5中任一项示出的核苷酸序列具有至少90％序列同一性，更特别是至少91、92、93、94、95、96、97、98或99％的序列同一性的核苷酸序列；(iii)与核苷酸序列SEQ ID NOs:1、3或5中的任一条简并的核苷酸序列；(iv)为SEQ ID NOs:1、3或5中的任一项核苷酸序列一部分的或与序列SEQ ID NOs:1、3或5简并的核苷酸序列的一部分的核苷酸序列；(v)编码SEQ ID NOs:2(Mdh2-MGA3)、4(Mdh3-MGA3)或6(Mdh2-PB1)中任一项示出的氨基酸序列的多肽的全部或部分的核苷酸序列；(vi)编码多肽的全部或部分的核苷酸序列，所述多肽具有与SEQ ID NOs:2、4或6中任一项示出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性，更特别是至少91、92、93、94、95、96、97、98或99％的序列同一性的氨基酸序列；或者核酸分子，其包含与(i)到(vi)中任一项核苷酸序列互补的核苷酸序列。还提供了包含这种核酸分子和由其编码的多肽的重组构建体、载体和宿主细胞。这种分子可以有利地用于宿主细胞的基因修饰，以例如引入或修饰甲醇脱氢酶活性。

说明书

本发明涉及在甲基营养菌中鉴定的以前未知的甲醇脱氢酶(MDH)， 特别是涉及在甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)MGA3和甲醇芽孢杆 菌PB1中鉴定的新的MDH编码基因。生化性质不同的这些甲醇芽孢杆 菌菌株中存在多个MDH同种型，本发明基于该意料之外的发现。编码先 前未知的MDH同种型的新基因可以用在宿主微生物的基因工程化中，例 如在使用甲醇和/或其它C1化合物作为生长底物的背景中。因此，新的 基因/酶可用于引入或修饰，如启用/增强宿主微生物中的MDH活性。

甲基营养微生物可以利用一碳(C1)来源，例如甲烷和甲醇作为能量和 生物量生成的唯一来源，且甲基营养菌中存在各种不同的酶和C1代谢途 径。将在温度高达60℃的甲醇上具有生长能力的革兰氏阳性杆菌分离并 归类为甲醇芽孢杆菌。甲醇芽孢杆菌是所谓的受限甲基营养菌，这意味 着它可以利用少数多碳来源用于能量和生长。这些生物体的科学兴趣已 经主要集中在它们作为在升高的温度下从甲醇工业生产氨基酸、尤其是 L-赖氨酸和L-谷氨酸盐的细胞工厂的潜能，但已经提出其作为生产其他 有用产品包括维生素、细胞色素、辅酶和重组蛋白的宿主的潜在用途。

甲醇芽孢杆菌MGA3(ATCC53907)最初是从Minnesota的土样分离 (Schendel,Bremmon et al.(1990)Appl Environ Microbiol(应用环境微生物 学)56(4):963-970)，它已被用作这种细菌的代谢工程的主要模型菌株 (Brautaset,Jakobsen et al.(2007)Appl Microbiol Biotechnol(应用环境微生 物学)74(1):22-34；Jakobsen,Brautaset et al.(2009)Appl Environ Microbiol (应用环境微生物学)75(3):652-661；Brautaset,Jakobsen et al.(2010)Appl  Microbiol Biotechnol 87(3):951-964)。甲醇芽孢杆菌有几个独特的特点， 包括用于甲醇氧化的NAD-依赖性甲醇脱氢酶(MDH)(de Vries,Arfman et  al.(1992)J Bacteriol 174(16):5346-5353；Arfman,Hektor et al.(1997)Eur J  Biochem(欧洲生物化学)244(2):426-433；Hektor,Kloosterman et al.(2002) J Biol Chem 277(49):46966-46973)。甲醇脱氢酶(MDH)的活性为甲基营养 菌生长的关键属性，并且参与甲醇发酵的第一步骤，即甲醇氧化为甲醛。 甲醛是甲醇代谢的中间产物，因此该细胞毒性代谢物的解毒非常重要。 甲醛可以通过RuMP途径被同化。已经提出将甲醛直接转化成CO₂的另 外一种线性异化途径。异化途径被认为对甲醇上生长的细胞的总能量生 成是重要的。与RuMP途径一起，异化的途径还可以在调节细胞内甲醛 低于毒性水平方面发挥作用。因此，高效的甲醇氧化和伴随的甲醛同化 对于生长和能量流进初级代谢和生成所需的产物是至关重要的。此外， 所有这一切必须小心地平衡，以确保甲醇有效转化同时避免细胞内甲醛 的毒性累积。在这方面，MDH在细菌甲基营养菌中起着至关重要的作用。

细菌的MDHs根据它们的反应机理和使用的辅因子(S)可以分为几 组。研究最多的是两个亚基的吡咯喹啉醌(PQQ)依赖性醌蛋白MDHs，其 广泛存在于革兰氏阴性甲基营养菌中。革兰氏阳性甲基营养菌通常编码 NAD(P)⁺-依赖性甲醇脱氢酶，并且除来自以上讨论的菌株MGA3的MDH 外，已经在甲醇芽孢杆菌菌株C1的另一菌株中鉴定出NAD⁺-依赖性MDH (Vonck,Arfman et al(1991)J Biol Chem 266(6):3949-3954；de Vries, Arfman et al.(1992)J Bacteriol 174(16):5346-5353)。甲醇芽孢杆菌MDH 与含铁醇脱氢酶显示主序列相似性，并因此被归类为NAD-依赖性醇脱氢 酶的第三家族。这种酶是由10个相同的亚基组成，每个亚基包含一个紧 密的但非共价结合的NAD(H)分子，除Zn²⁺离子和1-2个Mg²⁺离子外。

已发现甲基营养菌中的甲醇芽孢杆菌是质粒依赖性并参与质粒和染 色体基因的一致募集。在甲醇芽孢杆菌MGA3中已经鉴定了携带mdh和 五个RuMP途径基因的天然质粒pBM19；pBM19的固化导致在甲醇上生 长的能力丧失。在导致本发明的研究中，且以前没有报道，在生理上非 常不同的替代模型菌株PB1(NCIMB13113)中显示一个相应的类似质粒， 其被命名为pBM20。

已显示NAD依赖性MDH酶可由被分类为nudix水解酶家族中的激 活蛋白Act催化激活。

甲醇氧化是试图在宿主微生物中工程化甲基营养菌的主要瓶颈。事 实上，即使在宿主生物体是天然甲基营养菌如甲醇芽孢杆菌的上下文中， MDH活性或表达的修饰对于改善所需产物的的生长和/或产率是有益的。 因此持续需求MDH酶，特别是新型mdh基因，其可用于生物体的遗传 工程化，特别是编码相对于本领域的MDH酶具有改变的或者改进的性质 的新型酶的基因，例如提高的活性或稳定性，或可以以任何方式有利于 用于所需宿主的遗传修饰。

为更好地理解甲基营养菌宿主细胞甲醇芽孢杆菌的生理学，本发明 人对MGA3和可替代的野生型菌株PB1的基因组进行了测序。出人意料 的是，在此测序的过程中，已经发现这两种菌株具有多个同种型MDH； 在这两种菌株中鉴定出编码三种独立的NAD依赖性MDH蛋白的三个基 因。因此，在甲醇芽孢杆菌MGA3中，除了先前报道的编码质粒的 mdh-MGA3基因，还鉴定出两个新的基因，这里被称为mdh2-MGA3和 mdh3-MGA3。有趣的是，这些新的mdh基因位于染色体上。在甲醇芽孢 杆菌PB1中，也已鉴定出三个新的基因，这里称为mdh-PB1、mdh1-PB1 和mdh2-PB1，第一个位于质粒(质粒pBM20)且后两个位于染色体。所有 这些基因已经被体外重组表达、纯化和进行生化表征。虽然显示一些相 似之处，但很显然，这些不同的MDH酶具有不同的特性，包括它们的活 性。基于这些研究特别是序列分析，已经鉴定出两种不同的MDH亚家族 (sub-family)。

第一亚家族包括之前描述的菌株MGA3(mdh-MGA3)的质粒源性mdh 基因，以及来自菌株PB1的两个基因mdh-PB1和mdh1-PB1(mdh-PB1是 质粒来源的且mdh1-PB1位于染色体)，并在此确定为“mdh/mdh1型家族”。 第二亚家族包括新型染色体基因mdh2-MGA3、mdh3-MGA3和 mdh2-PB1，且在本文确定为“mdh2/mdh3型家族”。正是后一亚族构成了 本发明的主题。

该mdh2/mdh3型家族的成员相互之间在DNA水平上(参见图1)和所 编码的蛋白质的氨基酸序列水平上具有至少90％的序列同一性(参见图 2)。特别是，mdh2-MGA3(SEQ ID NO.1)和mdh3-MGA3(SEQ ID NO.3) 的编码序列共享96％的DNA序列同一性，并且编码的多肽 Mdh2-MGA3(SEQ ID NO.2)和Mdh3-MGA3(SEQ ID NO.4)共享96％的 氨基酸同一性(参见图2B)。编码的Mdh2-PB1多肽(SEQ ID NO.6)与编码 的Mdh2-MGA3多肽(SEQ ID NO.2)91％相同，且其与编码的 Mdh3-MGA3多肽(SEQ ID NO.4)92％相同的(参见图2B)。

另一方面，两个不同的亚家族成员间在60-66％的区域的序列同一性 非常低。例如，mdh2-MGA3编码序列(SEQ ID NO.1)与mdh-MGA3编码 序列(SEQ ID NO.7)65％相同，并且编码的Mdh2-MGA3多肽(SEQ ID NO. 2)与编码的Mdh-MGA3多肽(SEQ ID NO.8)61％相同。mdh3-MGA3基因 (SEQ ID NO.3)的编码序列与mdh-MGA3(SEQ ID NO.7)66％相同，并且 编码的Mdh3多肽(SEQ ID NO.4)与Mdh-MGA3(SEQ ID NO.8)62％相 同。

如上面所指出的，生化特性的研究已经揭示了mdh2/mdh3型家族的 MDH酶和mdh/mdh1型家族的那些之间的差异。例如，Mdh3-MGA3(SEQ  ID NO.4)和Mdh2-PB1(SEQ ID NO.6)具有改善的热稳定性。也观察了底 物特异性和不同醇底物活性水平的差异。这开辟了在不同的醇(例如，乙 醇或丙醇)而不只是甲醇的氧化中使用这些酶的可能性。

还进行研究以在不同的非甲基营养菌宿主中异源表达基因。这些研 究建立了本发明的新mdh2/mdh3型家族序列在大量不同的宿主细胞遗传 工程化中的效用，以引入MDH活性，从而使甲醇得到利用。在涉及不同 宿主的情况下，建议本发明具有广泛的适用性，并在本文所述的研究中， 使用了两种在生物技术表征和生理表征方面非常不同的细菌宿主菌株， 即革兰阴性大肠埃希氏菌和革兰氏阳性枯草芽孢杆菌，并且当修饰以表 达本发明的新的MDH酶时，特别是来自甲醇芽孢杆菌MGA3和甲醇芽 孢杆菌PB1的mdh2/mdh3型家族的酶，每一种菌株都表现出提高的MDH 活性。

值得注意的是，本文中所呈现的结果表明，不同的特定的酶在不同 的宿主中可以呈现提高的活性。例如，为了在宿主大肠杆菌中表达MDH 活性，甲醇芽孢杆菌Mdh2-MGA3(SEQ ID NO.1)给出了最好的结果。 MDH酶的选择还可以依赖于表达的环境和宿主细胞的确切性质和/或培 养条件，例如，哪一个特定的act基因共表达。因此，本发明的新型酶及 其编码序列有利地提供了MDH酶和编码的核酸分子的新的和扩大的集 合，用于醇包括甲醇的氧化，特别是用于宿主细胞的遗传修饰(例如，用 于生产重组宿主细胞)，例如在宿主细胞中引入或修饰醇脱氢酶活性，特 别是MDH的活性，或将甲基营养菌引入宿主细胞。如下面进一步描述的， 编码本发明的新酶的核酸分子可以单独使用或组合使用。

因此，在第一方面，本发明提供了核酸分子，特别是分离的核酸分 子，其编码具有醇脱氢酶活性、特别是甲醇脱氢酶活性的多肽(或蛋白质)， 其包含或具有(例如由以下组成)选自下组的核苷酸序列：

(i)如SEQ ID NOs:1(mdh2-MGA3)、3(mdh3-MGA3)或5(mdh2-PB1) 中任一项所示的核苷酸序列；

(ii)与如SEQ ID NOs:1、3或5中任一项所示的核苷酸序列具有至少 90％序列同一性，更特别是至少91、92、93、94、95、96、97、98或99 ％的序列同一性的核苷酸序列；

(iii)与核苷酸序列SEQ ID NOs:1、3或5中的任一条简并的核苷酸 序列；

(iv)为SEQ ID NOs:1、3或5中任一项核苷酸序列的一部分或与SEQ  ID NOs:1、3或5的序列简并的核苷酸序列的一部分的核苷酸序列；

(v)编码所有或部分多肽的核苷酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID NOs: 2(Mdh2-MGA3)、4(Mdh3-MGA3)或6(Mdh2-PB1)所示；以及

(vi)编码多肽的全部或部分的核苷酸序列，所述多肽具有与SEQ ID  NOs:2、4或6中任一项示出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性，更 特别是至少91、92、93、94、95、96、97、98或99％的序列同一性的氨 基酸序列；

或者核酸分子，其包含与(i)到(vi)中任一项核苷酸序列互补的核苷酸 序列。

在另一方面，本发明提供了具有醇脱氢酶活性、特别是甲醇脱氢酶 的活性的多肽，其包含或具有(例如由以下组成)选自下组中的氨基酸序 列：

(i)如SEQ ID NOs：2，4或6中任一项所述的氨基酸序列的全部或部 分；以及

(ii)与SEQ ID NOs：2、4或6中任一项所示的氨基酸序列具有至少 90％序列同一性，优选至少91、92、93、94、95、96、97、98或99％序 列同一性的氨基酸序列的全部或部分。

本发明的核酸分子有利地允许在宿主生物体引入醇脱氢酶特别是 MDH活性或对其进行修饰。这可以通过修饰生物体来实现，以表达本发 明的一种或多种核酸分子。如上面所指出的，所述核酸分子可以由甲醇 芽孢杆菌菌株、特别是MGA3和PB1菌株的mdh基因获得或者衍生。在 一个具体的实施方案中，编码不同的MDH酶(例如，不同的同工酶或来 自不同菌株的酶，或不同的多肽变体等)的核酸分子或由编码不同的MDH 酶的核酸分子衍生的核酸分子可以组合使用。因此可以共表达两种或以 上不同的核酸分子。

因此，本发明提供了通过在所述生物体中表达本发明的一个或多个 核酸分子用于在宿主生物体中引入或修饰MDH活性的方法。特别的是， 所述核酸分子可以是与宿主生物体异源的或者非天然的。它可以在天然 或非天然启动子的控制下表达。

因此，在又一个方面，本发明提供了用于在宿主生物体中引入或修 饰醇脱氢酶活性特别是MDH活性的方法，所述方法包括向所述生物体引 入如上文所定义的本发明的核酸分子，以及在表达所述核酸分子的条件 下生长(或培养)所述生物体。

从这个方面可知，本发明也可以看作提供了用于产生具有醇脱氢酶 活性、特别是MDH活性的多肽的方法，所述方法包括向宿主生物体中引 入如上定义的本发明的核酸分子；以及在产生所述多肽的条件下生长(或 培养)所述生物体。宿主生物体可以是天然(例如，野生型)不具有MDH活 性的有机体(即没有或不具有内源性MDH)，并因此在这样一个实施方案 中，本发明提供了向宿主中引入MDH活性。或者，在这样一个实施方案 中，可以修饰宿主以引入将甲醇转化为甲醛的能力，或者，换句话说， 修饰宿主以允许利用C1-碳源、特别是利用甲醇的初始步骤。

在一个可选的实施方案中，宿主生物体可以具有或拥有内源性MDH 酶，因此，本发明的方法可以涉及通过引入编码另外或其他的MDH酶的 核酸分子以在宿主中修饰MDH活性，MDH酶例如可以与宿主是异源的。 还包括通过在所述生物体(即，其中引入的核酸分子编码内源性MDH酶) 中引入编码天然MDH酶的核酸分子来过表达MDH活性。

可以使用任何期望的碳源作为底物培养或生长经修饰的宿主生物 体，底物包括但不限于甲醇或高级醇。因此在一个实施方案中，本发明 的方法可以包括培养或生长含有编码如本文所定义的外源引入的MDH 的一个或多个核酸分子的宿主生物体。

在另一个方面，本发明提供经过修饰以引入如上文所定义的本发明 的核酸分子的宿主生物体。

特别是，在本发明的这一方面，引入的核酸分子包含与宿主有机体 异源的核苷酸序列。异源序列可以是编码醇脱氢酶(例如MDH)多肽的核 苷酸序列，或者它可以是异源表达调控序列或一些其它序列(例如载体或 标记序列)。在内源性表达醇脱氢酶的宿主生物体的情况下，通过含有编 码醇脱氢酶多肽的核酸分子的另一副本可以将经修饰的宿主与未修饰的 宿主生物体区分。换句话说，它可以比未修饰的宿主包含编码核苷酸序 列的更多个拷贝。

如上面提到的，可以从甲醇芽孢杆菌、特别是MGA3和PB1的菌株 获得(例如分离或克隆)编码本发明的新型MDH酶的核酸分子。因此， MDH酶可以是来自MGA3的Mdh2或Mdh3(分别是SEQ ID NOs：2或 4)，或来自PB1的Mdh2(SEQ ID NO：6)。然而，除了如上所示的特定的 天然(“野生型”)序列之外，还包括这些序列的变体，其与天然序列具有 至少90％的核苷酸序列同一性且其保留醇脱氢酶活性、特别是MDH活 性。此类变体可包括天然变体，例如自然环境中菌株天然产生的或获自 甲醇芽孢杆菌菌株的不同变体，并且其编码与SEQ ID NOs.2、4或6的 MDH多肽功能上等同的MDH多肽。可选地，变体可以是合成的或人工 变体，例如通过修饰(如突变)SEQ ID NOs.2、4或6的氨基酸序列或SEQ  ID NOs.1、3或5的氨基酸序列而获得或衍生。可以使用如上所述本发 明的两种或以上不同的核酸分子的组合。本发明的核酸分子可选地包括 两个或以上不同的核苷酸序列，如本文所定义，其编码具有醇脱氢酶活 性的多肽或其补体。修饰可以基于相应变体的提高的甲醇脱氢酶活性来 选择，或者使用分子结构或模型基于蛋白质设计算法预测提高的酶活性 来构建。

本发明的MDH多肽还可以包括由SEQ ID NOs.1、3或5的核苷酸 序列的片段(部分)编码的多肽，或可以包含SEQ ID NOs.2、4或6的氨 基酸序列的片段(或部分)或由其组成。本发明的核苷酸或氨基酸序列的 “部分”可以包括或包含至少50、55、60、65、70、75、80、81、82、 83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98 或99％或更多个序列的连续核苷酸或氨基酸。

宿主生物体可以是任何合适的宿主生物体，但特别是微生物宿主生 物体(即微生物)。它可以是任何原核有机体，但特别是细菌。可以使用任 何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌，但特别提及可以由下列类或属组成的 细菌：埃希氏菌属(Escherichia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)和芽孢杆 菌属。代表性的宿主生物体包括大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B. subtilis)和谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)。如上所述，也可使用甲醇芽孢杆 菌或其它甲基营养宿主生物体，例如，甲基单胞菌(Methylomonas)、甲基 菌(Methylobacillus)、甲基杆菌(Methylobacterium)、噬甲基菌(Methylophilus) 或甲基球菌(Methylococcus)。然而，本发明并不限于这些生物体并延及任 何微生物宿主。

谷氨酸棒杆菌是杆状、非致病性革兰氏阳性土壤细菌。它在需氧和 厌氧条件下生长，且其是生物素营养缺陷型。谷氨酸棒杆菌能够在作为 碳和能量的单一或组合来源的各种底物上生长。其中代谢的底物是糖类 如葡萄糖、果糖或蔗糖，和有机酸如L-乳酸和醋酸。此外，谷氨酸棒杆 菌能够在作为唯一碳源的乙醇上生长。它被广泛用于大规模工业生产氨 基酸L-谷氨酸和L-赖氨酸。最近代谢工程的研究表明，谷氨酸棒杆菌也 能生产各种其它商业上关注的化合物，例如其他L-氨基酸、D-氨基酸、 二胺如尸胺或腐胺、有机酸如琥珀酸，和生物燃料如乙醇或异丁醇。

根据本发明，本发明的一个或多个核酸分子可以在宿主生物体表达， 特别是包括至少一个异源核酸分子(即包含与宿主异源的核苷酸序列的核 酸分子)，并且特别是包含编码MDH多肽的异源序列。因此，可以修饰 宿主生物体以表达核酸分子的一个或多个拷贝，或者可修饰其以表达本 发明的许多不同核酸分子的一个或多个拷贝。

因此，经修饰(或“工程化”)而表达本发明的MDH的微生物会包含 如本文定义的外源引入的编码MDH的核酸分子。换句话说，该生物体可 以用此种编码MDH的核酸分子转化，并可以被认为是转基因的或重组的 有机体。如上所述，所述核酸分子可以编码与宿主同源的或异源的(即天 然或非天然的)MDH酶。因此，可以引入与宿主是天然的基因的其他(或 更多)拷贝。引入的核酸分子可以包括从天然基因或从不同的来源衍生的 核苷酸序列。

MDH可以与其他酶联合表达以允许生物体的新功能。

本文所用的“表达”是指核苷酸序列转录为mRNA以及随后所述 mRNA翻译成多肽产物。

如本文所指，“过表达”是指核苷酸序列的表达相比或相对于其中没 有被根据本发明的未修饰的生物体中产生的表达水平提高的表达。表达 可以在多肽产物(例如MDH酶)产生的量方面予以考虑，其可以由本领域 已知的任何常规方法来确定。例如，可以通过测定蛋白质活性(即表达的 MDH多肽的活性)来确定表达。可选地，可以测定所产生的蛋白质的量 以确定表达水平，例如蛋白质印迹或其他抗体检测系统，或者实际上通 过评估或定量蛋白的任何方法来确定。也可以使用实时PCR。该测定可 以是体内或体外测定。

可以通过本领域已知的和文献中描述的步骤通过测定醇脱氢酶活性 来确定活性，例如，如下面的实施例中所述。编码的蛋白质的MDH活性 例如可以催化甲醇转化为甲醛，并且在本文中所述活性被定义为每分钟 生产1微摩尔的NADH所需的酶的量，各种醇类可以用作基质，例如乙 醇、甲醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、异丙醇和1,3-丙二醇。如Hektor et  al.(2002；chem277(49)：46966-46973)先前所描述的，可以用分光光度法 测定乙醇脱氢酶活性。

通过本领域已知的任何方法例如从相对于天然基因更强的或未调节 的启动子表达或过表达醇脱氢酶多肽，如通过引入包含编码MDH多肽的 核酸序列的核酸分子，例如，天然基因的拷贝，和/或通过引入编码MDH 的核酸分子的多个拷贝。

也可工程化生物体以引入额外的或可替代的调控要素。

在一个具体的实施方案中，编码MDH的核酸分子可以从非天然的或 异源的启动子表达(即启动子与编码MDH的核苷酸序列是异源的，即不 是天然MDH基因的启动子)，特别是非天然或异源的强启动子。因此， 在具体实施方案中，编码MDH的基因中不使用其天然启动子。可以在非 天然启动子的控制下引入编码MDH的基因。如本文所指，强启动子是指 其表达的基因在较高水平，或至少高于其天然启动子影响的水平。术语 “强启动子”是本领域众所周知的并广泛使用的术语，许多强启动子是 本领域已知的，或者可以通过常规实验来鉴定。可选地，启动子是甲醇 芽孢杆菌的mdh启动子。然而，对启动子的选择没有特别限定。

另外，可以使用天然启动子表达MDH基因。本发明包括使用可内源 性表达mdh基因或不内源性表达的微生物。在前者的情况下，可以引入 天然基因或其变体或另一MDH的天然基因或编码核酸分子的一个或多 个额外的拷贝，并且它们可以在天然或非天然启动子的控制下引入。例 如可以使用具有天然启动子的多拷贝载体。在后者的情况下，引入与宿 主是异源的MDH(或编码其的核酸分子)，但它可以在与衍生核酸分子的 MDH基因是天然或非天然的启动子的控制下。

用于引入基因或核酸分子的方法是本领域已知的并且在文献中有广 泛描述，并且可以使用任何所需的方法。因此可以使用载体引入基因(核 酸分子)，它可以是自主复制型载体或允许基因(核酸分子)整合到宿主基 因组(如染色体组)的载体。因此可将表达的基因(核酸分子)引入到表达载 体，然后将表达载体引入到宿主细胞中。用于构建表达载体并将其引入 宿主细胞的方法是本领域公知的。方便的是，可以用质粒载体引入编码 MDH的基因并可以用该质粒载体如通过电穿孔转化宿主微生物。方法的 选择取决于所使用的微生物。用于将核酸和载体引入微生物的方法是众 所周知的并在文献中有广泛描述。

该核酸分子优选编码MDH或其具有MDH活性的部分的多肽或蛋 白。

优选地，如上述(i)至(vi)部分定义的核酸分子编码多肽或蛋白质，其 具有或保持由SEQ ID NOs:2、4或6中任一项的氨基酸序列限定的MDH 多肽的功能或活性。

术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且包括任何长 度的氨基酸链(即氨基酸的任何聚合物或低聚物)。

如上所指，本发明延及如上文所定义的核苷酸序列的部分或功能片 段，其中是指编码与上述定义的全长蛋白具有相同或基本相同的活性的 蛋白质或多肽的部分或片段。确定由这样的部分或片段编码的蛋白质/多 肽是否具有与如上定义的全长多肽/蛋白相同或基本相同的活性(例如催 化或酶促活性)的测试包括上面讨论的那些。通常核酸分子的部分或功能 性片段相对于全长核酸分子会仅具有小的删除，例如，小于50、40、30、 20或10个核苷酸的删除，例如在编码蛋白质的N-末端的5'端、编码蛋 白质C末端的3'端或在编码区域内部，但是如果该片段与如上定义的全 长蛋白具有相同或基本相同的活性(例如催化或酶促活性)，也可以进行较 大的删除，例如至少60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、 600或700个核苷酸，或小于60、70、80、90、100、150、200、300、 400、500、600或700个核苷酸的删除。可以容易地测试所编码的多肽或 蛋白质的活性，以确定它是否具有与全长多肽或蛋白相同的活性，例如， 如上所述。

代表性部分或片段可以包含如SEQ ID NOs:1、3或5所示的核酸序 列的至少50％，优选至少60、70、75、80、85、90或95％的连续核苷 酸。示例性的部分或片段的大小包括至少620、700、800、850、900、950、 1000、1050、1100和1150个核苷酸。

本发明的核酸分子的较短片段可用作探针，例如用于PCR或杂交方 案。较短的片段可以是例如10-30、20-25个核苷酸的长度。这样的探针 可用于鉴定与本发明的核酸分子具有同源性的其他核酸分子的方案。

本文所用的术语“核酸分子”指单链或双链的RNA或DNA的聚合 物，其任选地包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。这样的多核 苷酸的实例包括cDNA、基因组DNA和双链RNA等。优选地，所述核 酸分子是DNA。

虽然本文提到的核酸序列包括胸腺嘧啶(“t”)的核苷酸，但可以理 解，本发明还涉及其中胸苷被尿苷取代(“u”)的相应序列。

如上所述，本发明包括为SEQ ID NOs:1、3或5核酸分子的变体的 核酸分子，尤其是功能性等同变体。相比于SEQ ID NOs:1、3或5的核 酸分子，“变体”的核酸分子由此可以有一个或多个核苷酸的改变。例如， 该变体可能具有1、2、3、4或5个或更多个核苷酸的添加、取代、插入 或删除。

在其他方面，本发明提供了具有醇脱氢酶活性、特别是MDH活性的 蛋白质(或多肽)，如上文所定义。

蛋白质或多肽优选是MDH或其具有MDH活性的部分。更特别的是， 该部分保留衍生其的MDH的特性的功能或活性(参照氨基酸序列SEQ ID  NOs.2、4或6所定义的)。

蛋白质或多肽可替代地参照编码其的核酸序列所定义的，并且由此， 如上所述，本发明的蛋白质或多肽可以通过任何本发明的核酸分子编码。

本发明延及全长蛋白质分子的功能部分或片段，其中是指与如上所 定义的全长蛋白质具有相同或基本相同的活性的部分或片段，即它们应 被认为是功能等同变体。如本文其他地方所指出的，可以以简单的方式 用不同的方法测试该特性。通常，这些功能性片段相对于全长蛋白质分 子会仅具有小的删除，例如小于50、40、30、20或10个氨基酸，虽然 如上所述，但是核酸分子的较大删除也可能是适合的，例如如高达60、 70、80、90、100、150、200个氨基酸，或至少60、70、80、90、100、 150、200个氨基酸。在所有情况下，片段应与如上述所定义的全长蛋白 质具有相同或基本相同的活性，即它们应被认为是功能上等同的变体。 这些删除可以在N末端、C末端，或者它们可以是内部删除。

代表性部分或片段可以包含如SEQ ID NOs:2、4或6所示的氨基酸 序列的至少50％，优选至少60、70、75、80、85、90或95％的连续氨 基酸。

如上定义的本发明的多肽因此包括SEQ ID NOs:2、4或6的变体， 例如与所记载的序列具有序列一定水平同一性的序列。这样的变体可以 是天然存在的变体，如在其他物种中发现的可比蛋白质或同源物，或者 更具体的是其他微生物内发现的变体(其具有如本文其他地方所定义的编 码的蛋白质的功能特性)。

也可以例如通过使用本领域已知的标准分子生物学技术合成地生成 如本文所定义的天然存在的多肽的变体，例如标准诱变技术，如定点突 变或随机突变(例如使用基因改组或易错PCR)。这样的诱变技术可以用于 开发具有改进的或不同的催化性质的酶。

也可使用如本文所定义的多肽的衍生物。衍生物是指代替天然存在 的氨基酸的上述多肽或其变体，其含有氨基酸的结构类似物。也可以发 生衍生或修饰(例如，蛋白质中的氨基酸的标签化、糖基化、甲基化)，只 要该蛋白质的功能没有受到不利的影响。

“结构类似物”是指非标准氨基酸。可使用的这种非标准或结构类 似物的氨基酸的实例是D氨基酸、酰胺等排物(如N-甲基酰胺，逆酰胺 (retro-inverse amide)、硫代酰胺、硫酯、磷酸酯、酮亚甲基、羟基亚甲基、 氟乙烯基、(E)-乙烯基、亚甲基氨基、硫代亚甲基(methylenethio)或烷烃)、 L-N甲基氨基酸、D-α甲基氨基酸、D-N-甲基氨基酸。

可以通过任何方便的方法评估序列同一性。然而，为了确定序列之 间的序列同一性程度，进行序列的多重比对的计算机程序是有用的，例 如Clustal W(Thompson et al.,(1994)Nucleic Acids Res.(核酸研究),22: 4673-4680)。比较和比对序列对的程序，如ALIGN(Myers et al.,(1988) CABIOS,4:11-17)、FASTA(Pearson et al.,(1988)PNAS,85:2444-2448； Pearson(1990),Methods Enzymol.(酶学方法),183:63-98)和有缺陷的 BLAST(Altschul et al.,(1997)Nucleic Acids Res.(核酸研究),25: 3389-3402)，也可用于该目的。此外，在欧洲生物信息研究所的大理服务 器(Dali server)提供了基于结构的蛋白质序列比对(Holm(1993)J.Mol. Biol.,233:123-38；Holm(1995)Trends Biochem.Sci.,20:478-480；Holm (1998)Nucleic Acid Res.,26:316-9)。

可以使用标准的BLAST参数来确定多重序列比对和同一性百分比 计算(使用来自可用的所有生物的序列、矩阵Blosum 62、成本差距：存 在11，延长1)。或者，可使用下列程序和参数：程序：Align Plus 4，4.10 版(Sci Ed Central Clone Manager Professional Suite)。DNA比较：全局比较， 标准线性评分矩阵，错配罚分＝2，开放空位罚分＝4，延长空位罚分＝1。 氨基酸比较：全局比较，BLOSUM62评分矩阵。

本发明的另一实施方案提供了构建体，例如重组构建体，其包含可 操作地连接于异源表达调控序列的本文所定义的本发明的核酸分子。在 上下文中，应当理解的是，表达调控序列与核酸分子会是异源的(即非天 然的)，更具体为与编码醇脱氢酶多肽的核苷酸序列是异源的。在这点上， 当编码核苷酸序列不是天然存在的序列时，表达调控序列将与衍生其的 核苷酸序列是异源的。如上所述，可使用不同核酸分子的组合。

这种表达调控序列通常会是启动子。因此，构建体将优选包括非天 然启动子，特别是非天然强启动子。任选地，所述构建体还可以含有另 外的一个或多个基因和/或一个或多个合适的调控序列。可选的另外的一 个或多个基因可以在与本发明的编码MDH的核酸分子相同的启动子的 控制下。任选的一个或多个调控序列可以是非天然调控序列(即相对于编 码核苷酸序列或核苷酸序列是非天然的)。

在本发明的上下文中，术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上 的两个或多个核酸分子的连接，从而其中一个的功能受到另一个的影响。 例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即编码序列在启动子的转录控 制下)时，启动子可操作地与编码序列连接。编码序列可以可操作地连接 有义或反义方向的调控序列。

术语“调控序列”指位于编码序列上游(5'非编码序列)、内部或下游 (3'非编码序列)的核苷酸序列，并且其影响相关编码序列的转录、RNA加 工或稳定性、或翻译。调控序列可包括启动子、操纵基因、增强子和翻 译前导序列。本文所用的术语“启动子”指能够控制编码序列或RNA的 表达的核苷酸序列。一般而言，编码序列位于启动子序列的3'端。启动 子可以整个源于天然基因，或者由源于自然界中发现的不同启动子的不 同要素组成，或甚至包括合成的核苷酸区段。还应当进一步认识到，由 于在大多数情况下，尚未完全确定调控序列的确切边界，因此不同长度 的核酸片段可以具有相同的启动子活性。

本发明的另一个实施方案提供了包含如本文所定义的核酸分子或构 建体的载体。

更具体地，可以构建包含本发明的编码MDH的一种或多种核酸分子 (或本发明的构建体)的载体。载体的选择可取决于宿主微生物、将要用于 转化宿主细胞的方法、用于蛋白质表达的方法，或者载体的另一目的用 途。本领域技术人员清楚地知道，遗传因子必须存在于载体中以便成功 地转化、筛选并增殖含有本发明的编码MDH的核酸分子或构建体的宿主 细胞。本领域技术人员也将认识到不同的独立转化事件将导致不同的表 达水平和模式，因而可能需要筛选多个事件以获得显示期望的表达水平 和模式的细胞。这种筛选可以尤其通过DNA的Southern分析法、mRNA 表达的Northern分析法、蛋白质表达的Western分析法来完成。

本发明还提供了微生物或宿主，其可以是如上讨论的任何宿主生物 体，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌,其含有本发明的一种或 多种的核酸分子、构建体或载体。可以从遗传上对宿主进行操作从而引 入或改变MDH的表达。这可通过在非天然、优选强启动子的控制下引入 本发明的编码MDH的核酸的一个或多个拷贝来实现。因而遗传物质存在 于宿主生物体(即存在外源遗传物质)中而不存在于天然存在的生物体中。

一般情况下，使用转化方法引入外源遗传物质。转化通常会涉及还 包含能够鉴定成功转化的微生物的基因质粒或其它载体，如用于抗生素 耐药性的基因(例如针对氨苄青霉素)或一些其它标记物。用于筛选转化体 的其他方法是本领域技术人员已知的，并且其包括使用光敏感载体即勒 克斯基因，这会导致阳性集落在黑暗背景中突出。用于细菌转化的其他 合适的媒介包括粘粒和噬菌体分子。

现参照以下非限制性实施例进一步描述本发明。但是应当理解，这 些实施例虽然说明本发明的实施方案，但仅是以示例性的方式给出。从 上面的讨论和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的必要特征， 并且在不背离其精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种变化或修 改，以使其适应各种用途和条件。因此，除了那些本文示出和描述的， 从前面的描述可知，本发明的各种修改对本领域技术人员而言将是显而 易见的。这些修改也意图落入所附权利要求书的范围内。本文所引用的 所有文件都通过引用并入本文。

在实施例中，参考了下述附图：

图1：对甲醇芽孢杆菌mdh-MGA3、mdh2-MGA3、mdh3-MGA3、 mdh-PB1、mdh1-PB1和mdh2-PB1的核苷酸序列比对；

图2：(A)对编码的甲醇芽孢杆菌MGA3Mdh、Mdh2和Mdh3以及 PB1Mdh、Mdh1和Mdh2蛋白质的基本序列比对。(B)对mdh2/mdh3亚 家族(即甲醇芽孢杆菌MGA3 Mdh2和Mdh3以及PB1 Mdh2蛋白)的基本 序列比对。

图3：体外测试纯化的Mdh(黑色)、Mdh2(暗灰色)和Mdh3(浅灰色) 对各种醇(200mM)的催化活性。(A)体外分析来自甲醇芽孢杆菌MGA3 的MDHs的底物特异性。除了戊醇(300mM)和己醇(50mM)之外，使用 的醇底物的浓度为500mM。根据以一式三份进行的两个实验的平均值来 计算数据。(B)体外分析来自甲醇芽孢杆菌PB1的MDH的底物特异性。 除了戊醇(300mM)和己醇(50mM)之外，使用的醇底物的浓度为500mM。 根据以一式三份进行的两个实验的平均值来计算数据。

图4：(A)体外测定用于Mdh、Mdh2和Mdh3催化活性的最适温度。 (B)在体外进行对来自甲醇芽孢杆菌PB1的MDH蛋白催化的最适温度条 件的测定：计算对于500mM乙醇的比活性；以一式三份进行测定。

图5：(A)体外测试MGA3 Mdh、Mdh2和Mdh3的温度稳定性。酶 测定前，在45℃或60℃时孵育酶。(B)体外测试PB1 Mdh、Mdh1和Mdh2 的温度稳定性。酶测定前，在45℃或60℃时孵育酶。

图6：在Act的存在下测试Mdh、Mdh2和Mdh3的催化活性，并与 Act不存在时测定的活性水平进行比较。(A)体外测试来自甲醇芽孢杆菌 MGA3的MDHs的活化。用500mM酒精和5μg/ml的MDH和Act蛋白 质以一式三份进行测试。(B)体外测试来自甲醇芽孢杆菌PB1的MDH 的活化。用500mM酒精和5μg/ml的MDH和Act蛋白质以一式三份进 行测试。

图7：(A)克隆策略。(B)act-pHCMC04质粒的物理图谱。

图8：使用乙醇和甲醇作为底物进行体外测试时重组枯草芽孢杆菌菌 株的活性。

图9：¹³C-甲醇的加入前(即零时间点)和加入后(即30和90分钟的时 间点)不同代谢产物的质量同位素分数M1的％。三条线表示来自三个独 立生物学重复的结果。A：谷氨酸棒杆菌Δald pEKEX3；B：表达 Mdh2(pVWEx1-Mdh2)、Hps和Phi(pEKEX3–Hps+Phi)的谷氨酸棒杆菌 Δald菌株。PEP：磷酸烯醇丙酮酸盐；2/3P：2-和3-磷酸甘油酸盐；FBP： 果糖二磷酸盐；R5P：核糖-5-磷酸盐。

图10：用¹³C甲醇或¹³C甲醛作为底物的代谢标记。(A)表达mdh2 和hps phi的ΔfrmA细胞且¹³C甲醇作为碳源。(B)表达hps和phi的Δ frmA细胞且¹³C甲醛作为碳源。

图11：合成操纵子的装配。将每个连续基因引入SwaI/BglⅡ限制性 位点中。该操纵子中最后一个基因含有His₆标签。在¹³C-标记的试验(见 实施例18)中使用AMAhxlB-和AMABGFTPrpe-pHCMC04质粒。RBS： 核糖体结合位点。

图12：在枯草芽胞杆菌168中表达SDS-PAGE纯化的蛋白。使用的 枯草芽孢杆菌菌株中包含图11所示的任一项构建体。用HisTrap柱纯化 蛋白并使用Vivaspin柱浓缩。用框形表示蛋白条带。M：分子量标记。

图13：¹³C-甲醇加入前(即零时间点)和加入后(即30和90分钟的时 间点)不同代谢产物的质量同位素分数M1的％。两条线表示来自两个独 立的生物学重复的结果。(A)：枯草芽孢杆菌168pHCMC04；(B)：枯草 芽孢杆菌168AM3AhxlB-pHCMC04；(C)：枯草芽孢杆菌168 AM3ABGFTPrpe-pHCMC04。PEP：磷酸烯醇丙酮酸盐；2/3PG：2-和3- 磷酸甘油酸盐；FBP：果糖二磷酸盐。

实施例

表1：本研究中使用的细菌菌株和质粒

Amp^r,氨苄青霉素抗性；Cm^r,氯霉素抗性

材料和方法

生物材料、DNA操作和生长条件

在本研究中使用的细菌菌株和质粒列于表1中。大肠杆菌DH5α用 作标准克隆宿主，而大肠杆菌ER2566用作MDH蛋白、Act和NudF重 组表达的宿主。大肠杆菌菌株通常在37℃下在液体中生长，或在视情况 补充有氨苄青霉素(100μg/ml)或氯霉素(10μg/ml)的固体Luria-Bertani (LB)培养基(Sambrook(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press)上生 长。如Sambrook and Russell(2001；Cold Spring Harbor Laboratory Press) 所述，进行重组大肠杆菌的步骤。通过使用高保真PCR扩增系统(Roche  Applied Science,Indianapolis,IN)来进行PCR，并且通过Eurofins MWG操 纵子(Ebersberg,Germany,www.eurofinsdna.com)进行DNA测序。如先前 所述(Brautaset et al.,(2004)J Bacteriol 186(5):1229-1238；Bra utaset et al., (2010)Appl Microbiol Biotechnol 87(3):951-964)，分离甲醇芽孢杆菌 MGA3和PB1总DNA并在大肠杆菌ER2566中重组生产MDH、Act和 NudF蛋白。通过电穿孔(Jakobsen et al.,(2006)J Bacteriol 188(8): 3063-3072)进行甲醇芽孢杆菌MGA3的转化。50℃于含200mM甲醇的 100ml MeOH₂₀₀培养基、含有10g/L甘露醇的Mann10培养基或SOBsuc 培养基(Jakobsen,Benichou et al.(2006)J Bacteriol 188(8):3063-3072)中生 长甲醇芽孢杆菌细胞，并且视情况加入氯霉素(5μg/l)。

表达载体的构建

pET21a_mdh-MGA、pET21a_mdh2-MGA3、pET21a_mdh3-MGA3和pET21a_act-MGA3：

由于MGA3的mdh2和mdh3编码区之间的高序列相似性，基于代表 各基因的周边区域的独特序列设计用于PCR扩增和伴随的克隆的引物， 如下所示：

con16_rev：5'-AACCATGGATGAGGAGGATGTTTGTATGAC-3'(SEQ  ID NO：13)和

con18_rev： 5'-AACCATGGCAAACAAAGGGGATGTATGTATG-3'(SEQ ID NO：14)；

con41_rev：5'-AGGATCCCCTCCGTTTTGTCGTATTAC-3'(SEQ ID  NO：15)和

con43_rev：5'-TGGATCCTCTTCGTCTTTGGCGAATTAC-3'(SEQ ID  NO：16)。

用NcoI+BamHI(引物序列中标下划线的识别位点)酶切相应的DNA 片段，并将其连接到产生质粒、携带mdh2的pTMB1和携带mdh3的 pTMB2的pLITMUS28的相应位点。然后对两种质粒中克隆的MDH基 因进行测序。接着，通过使用下列PCR引物对，分别从甲醇芽孢杆菌 MGA3总DNA PCR扩增mdh和act的编码区，并从质粒pTMB1和pTMB2 PCR扩增mdh2和mdh3的编码区：

mdh_fwd-MGA3：5'-CATATGACAACAAACTTTTTCATTCC-3'(SEQ  ID NO：17)和

mdh_rev-MGA3： 5'-CTCGAGCATAGCGTTTTTGATGATTTGTG-3'(SEQ ID NO：18)；

mdh2_fwd-MGA3：5'-CATATGACAAACACTCAAAGTGC-3'(SEQ ID  NO：19)和

mdh2_rev-MGA3： 5'-CTCGAGCATCGCATTTTTAATAATTTGG-3'(SEQ ID NO：20)；

mdh3_fwd-MGA3： 5'-CATATGAAAAACACTCAAAGTGCATTTTAC-3'(SEQ ID NO：21)和

mdh_rev-MGA3： 5'-CTCGAGCATAGCGTTTTTGATGATTTGTG-3'(SEQ ID NO：22)；

act_fwd-MGA3：5'-AAACATATGGGAAAATTATTTGAGG-3'(SEQ ID  NO：23)和

act_rev-MGA3： 5'-AAACTCGAGTTTATTTTTGAGAGCCTCTTG-3'(SEQ ID NO：24)；

在正向和反向引物中标下划线的分别是NdeI和XhoI的限制性位点。 将所得的PCR产物mdh-MGA3(1149bp)、mdh2-MGA3(1163bp)、 mdh3-MGA3(1165bp)和act-MGA3(570bp)直接A/T-连接到常规克隆载体 pGEM-T中，并通过DNA测序来验证各个克隆的插入物。然后用XhoI 和NdeI酶切所得的载体，并将插入物连接入具有质粒pET21a的6-His 标签序列的框架中的相应位点，分别得到质粒pET21a_mdh-MGA3、 pET21a_mdh2-MGA3、pET21a_mdh3-MGA3和pET21a_act-MGA3。

pET21a_mdh-PB1、pET21a_mdh1-PB1、pET21a_mdh2-PB1和pET21a_act-PB1：

使用以下引物对从PB1总DNA PCR扩增mdh-PB1，mdh1-PB1和 mdh2_PB1基因的编码区：

mdh_fwd-PB1： 5'-ATACATATGACGCAAAGAAACTTTTTCATTC-3'(SEQ ID NO：25)和

mdh_rev-PB1： 5'ATACTCGAGCAGAGCGTTTTTGATGATTTG-3'(SEQ ID NO：26)；

mdh1_fwd-PB1： 5'-ATACATATGACTAAAACAAAATTTTTCATTC-3'(SEQ ID NO：27)和

mdh_rev-PB1(见上文)；

mdh2_fwd-PB1： 5'-ATACATATGACAAACACTCAAAGTATATTTTAC-3'(SEQ ID NO：28) 和

mdh2_rev-PB1： 5'-ATACTCGAGCATAGCATTTTTAATAATTTGTATAAC-3'(SEQ ID NO： 29)。

将得到的三种PCR产物mdh-PB1(1164bp)、mdh1-PB1(1164bp)和 mdh2-PB1(1170bp)A/T-连接到质粒pGEM-T中。将所得的质粒分别用XhoI 和NdeI(引物中标下划线的限制性位点)酶切，并连接到质粒pET21a的相 应位点，分别得到质粒pET21a_mdh-PB1、pET21a_mdh1-PB1和 pET21a_mdh2-PB1。使用引物对从PB1总DNA PCR扩增act-PB1编码区：

act_frw-PB1：5'-TTTTCATATGGGAAAATTATTTGAGGAAA-3'(SEQ  ID NO：30)和

act_rev-PB1： 5'-TTTTCTCGAGTTTATTTTTGAGAGCCTCTTG-3'(SEQ ID NO：31)。

将PCR产物act-PB1用NdeI和XhoI(引物中标下划线的限制性位点) 酶切，并连接到pET21a的相应位点，得到质粒pET21a_act-PB1。

pET21a_nudF：

使用下列引物对从枯草芽孢杆菌168总DNA PCR扩增nudF的编码 区：

nudF-fwd： 5'-TTTTCATATGAAATCATTAGAAGAAAAAACAATTG-3'(SEQ ID NO： 32)和

nudF-rev：5'-TTTTCTCGAGTTTTTGTGCTTGGAGCGCTT-3'(SEQ ID  NO：33)。

将所得的PCR产物(572bp)A/T-连接入pGEM-T中，并通过DNA测 序验证克隆的插入物。所得载体用XhoI和NdeI(引物中标下划线的限制 性位点)酶切，并将插入物连接到pET21a的相应位点，得到质粒 pET21a_nudF。

将构建的所有载体转化入表达宿主大肠杆菌ER2566。

重组蛋白的亲和纯化

基本上如先前所述(Brautaset et al.,(2010)Appl Microbiol Biotechnol (微生物生物技术)87(3):951-964)，通过使用亲和层析法从各自的重组大 肠杆菌ER2566菌株的细胞提取物中纯化六种不同的MDH蛋白、两种不 同的Act蛋白和NudF。用NanoDrop分光光度计(Nano Drop Technologies, Wilmington,Delaware)分光光度学地估计蛋白质浓度，同时使用Expasy 普罗特参数工具(Expasy Prot Param tool,expasy.org/tools/protparam.html) 计算MDHs、Act和NudF蛋白的分子量和消光系数设定(数据未示 出)(Gasteiger et al.(2003)Nucleic Acids Res.(核酸分子研究)31(13): 3784-3788)。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)(Sambrook and Russel,(2001)Cold Spring Harbor Laboratory  Press)以及随后目测得到的图像来分析纯化蛋白的纯度。将纯化的蛋白快 速冷冻在液氮中，并储存在-80℃下，直到它们在冰上解冻，并用于生物 化学分析。

酶测定

基本上如先前所述(Hektor,Kloosterman et al.(2002)Chem 277(49): 46966-46973)，用分光光度计测定醇脱氢酶活性，反应混合物含有：100 mM pH为9.5的甘氨酸-KOH(除非另有说明)，5mM MgSO₄，0.5mM的 NAD⁺和500mM的醇(甲醇、乙醇、丙醇、1,3-丙二醇、或丁醇)。用相 同浓度的NADP⁺，FMN⁺和FAD⁺替换NAD⁺。测定甲醛还原酶活性的反 应混合物含有：50mM pH＝6.7的磷酸钾缓冲液、0.15mM NADH，1mM DTT和11.6mM(0.1-116mM)甲醛。除非另有说明，在小容器中混合测定 组分并预热至45℃。该反应通过加入5-40μg纯化的MDH蛋白启动，并 在340nm处对NADH的生产监测4分钟。一个单位的MDH活性定义为 在上述条件下每分钟生产1μmol NADH需要的酶的量。如文中所述，将 纯化的Act(0.1-40μg)或NudF(20μg)蛋白质加入反应混合物。

纯化酶的体外生化表征

纯化的MDH和Act蛋白(20μg)用于进行如上所述的甲醇脱氢酶和甲 醛脱氢酶的动力学实验。为确定甲醇的K_m(K_m,MeOH)和V_max，NAD⁺的浓 度保持在饱和水平(0.5mM或0.15mM)，而甲醇的浓度变化(0.1-2000 mM)。为确定NAD⁺的K_m(K_m,NAD+)和V_max，甲醇浓度保持在饱和水平(500 mM)不变，而NAD⁺的浓度变化(5-1000mM)。为确定甲醛的K_m(K_m,FA) 和V_max，NADH的浓度保持在饱和水平(0.5mM或0.15mM)，而甲醛的 浓度(0.1-40mM)变化。Act(20μg)加入到反应混合物中用于测定活化剂的 存在下Kμ、ΜεΟΗ和V_max的值，如文中所述。在一般情况下，测定期间 活性随时间变化的斜率是线性的(数据未示出)。如先前所述(Jakobsen et  al.,(2009)Appl Environ Microbiol(应用环境微生物学)75(3):652-661)，通 过使用非线性回归用Microsoft Excel求解程序工具使测量数据拟合(fit)米 氏方程来计算K_m和V_max值。然后将从回归获得的值与从Lineweaver-Burk 和Hanes-Woolf图获得的值进行比较，以确保已发现的全局最小值，而不 是局部最小值。

总RNA、cDNA合成和实时PCR的分离

基本上如前所述(Brautaset et al.,(2010)Appl Microbiol Biotechnol(应 用环境微生物学)87(3):951-964)，进行实时PCR实验。使用RNAqueous 试剂盒(Ambion)从用甘露糖醇或甲醇作为唯一碳源的指数生长(OD600＝ 1.0)的MGA3和PB1细胞培养物中分离总RNA。用NanoDrop分光光度 计(Nano Drop Technologies,Wilmington,Delaware)测定RNA的浓度，并 用Agilent生物分析仪2100和RNA 6000Nano LabChip Kit(Agilent  Technologies,Palo Alto,CA)评价总RNA的完整性。根据制造商的说明使 用第一链cDNA合成试剂盒(Amersham)由分离的总RNA合成cDNA，并 将其用作实时PCR实验的模板。使用具有默认设置的ABI PRISM7700 序列检测系统(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)进行实时PCR分 析。用引物Express 2.0software(Applied Biosystems)选择所使用的PCR 引物，其示出如下：

mdh-MGA3fwd(正向)：5'-ATTCCACCAGCCAGCGTAAT-3'(SEQ ID  NO：34)和

mdh-MGA3-rev(反向)： 5'-CTTAGCTCCAATTTGCTTAAGTCTTG-3'(SEQ ID NO：35)；

mdh2-MGA3-fwd： 5'-GGATACATGTCAAACACTCAAAGTGC-3'(SEQ ID NO：36)和

mdh2-MGA3-rev： 5'-TCTAGACACCATCGCATTTTTAATAATTTGG-3'(SEQ ID NO：37)；

mdh3-MGA3-fwd： 5'-GGATACATGTAAAACACTCAAAGTGC-3'(SEQ ID NO：38)和

mdh3-MGA3-rev： 5'-TCTAGACACCATAGCATTTTTAATAATTTGGATG-3'(SEQ ID NO： 39)；

mdh-PB1-fwd：5'-TCCACCAGCTAGCGTAATTGG-3'(SEQ ID NO： 40)和

mdh-PB1-rev：5'-AACCTGTGCCATGAAGAAATGC-3'(SEQ ID NO： 41)；

mdh1-PB1-fwd：5'-TCCATCATCCACTGTATTTGG-3'(SEQ ID NO： 42)和

mdh1-PB1-rev：5'-ACCTGTGCTGTGAAGGAATGC-3'(SEQ ID NO： 43)；

mdh2-PB1-fwd：5'-CGTGAAGCTGGTGTGGAAGTATT-3'(SEQ ID NO：44)和

mdh2-PB1-rev：5'-TCCAAACCTTCTGCGACGTT-3'(SEQ ID NO：45)。

如前所述(Heid,Stevens et al.(1996)Genome Res(基因组研究)6(10): 986-994；Jakobsen,Benichou et al.(2006)J Bacteriol 188(8):3063-3072； Brautaset,Jakobsen et al.(2010)Appl Microbiol Biotechnol(应用环境微生 物学)87(3):951-964)，通过使用比较Ct方法(2-ΔΔCt方法)标准化结果来 对讨论中的基因相对于16s RNA(内源性对照)和基准样品进行相对定量。 通过计算如下给出的ΔCT值来阻止这三个基因在转录水平的相对差异： mdh2(Ct MDH2-Ct mdh)和mdh3(Ct mdh3-Ct mdh)的ΔCT值。在进行其他 实验之前，测试这三个基因的引物效率。

对编码MDH蛋白质进行3D建模

采用全自动化的蛋白质结构同源建模服务器 SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)(Peitsch(1995) Bio-Technology(生物技术)13(7):658-660；Arnold,Bordoli et al.(2006) Bioinformatics(生物信息学)22(2):195-201；Kiefer,Arnold et al.(2009) Nucleic Acids Res(核酸分子研究)37(Database issue):D387-392)对MGA3 Mdh和Mdh2蛋白质进行结构建模。由于编码的MGA3Mdh2和Mdh3 蛋白的一级结构之间具有高度同源性，没有对Mdh3的模型进行研究。 空位BLAST搜索(Altschul et al(1997)J Mol Biol 215(3):403-410；et al.(2001)Nucleic Acids Res.(核酸分子研究)29(14):2994-3005)得到9 个共同的模板标的(hit)，其中Mdh的E值从1·e^-98(pdb:3bfj,1,3-丙二醇氧 化还原酶)到1·e^-17(pdb:1oj7,E.coli K12YQHD)变化，并且Mdh2的E值 从1·e^-112(pdb:3bfj)到2·e^-14(pdb:1oj7)变化。使用Deep view/Swiss pdb  viewer(Guex and Peitsch(1997)Electrophoresis 18(15):2714-2723)进行模 板文件的3D比对，显示它们都具有非常相似的折叠，并且选择基于对 Mdh和Mdh2都具有最高的氨基酸相似性评分的3bfj模板的结构模型来 代表Mdh和Mdh2。Deep view/Swiss pdb viewer也被用于可视化MDHs 的结构模型。

实施例1：甲醇芽孢杆菌野生型菌株MGA3和PB1中甲醇脱氢酶和激活蛋白基因的基因组织

甲醇芽孢杆菌MGA3基因组序列的电脑模拟筛选(Heggeset et al., 2011)鉴定了MGA3基因组中质粒pBM19编码的mdh，这里表示为 mdh-MGA3，和另两个推定的MDH编码基因，这里表示为mdh2-MGA3 和mdh3-MGA3，这两个基因在染色体上的位置较远。该mdh2-MGA3和 mdh3-MGA3编码序列彼此的同一性为96％，且其与mdh-MGA3编码序 列的同一性分别为65％和66％。编码的Mdh2-MGA3和Mdh3-MGA3多 肽的基本序列比对表明，它们相同之间的同一性为96％，且其与 Mdh-MGA3编码序列的同一性分别为65％和66％(图2)。

我们最近获得的分批甲醇发酵的结果表明，这两种甲醇芽孢杆菌野 生型菌株MGA3和PB1在甲基营养特性方面大不相同。对PB1基因组序 列的检测证实，存在三种不同的MDH编码基因和一个类似于MGA3的 Act基因。位于质粒pBM20的mdh-PB1基因与MGA3 mdh-MGA3基因 具有92％的同一性，并且其各自的基因产物显示93％的基本序列同一性 (图2)。在MGA3对比，PB1的两个染色体基因(表示为mdh1-PB1和 mdh2-PB1)的序列并不十分相似。该mdh1-PB1基因编码与MGA3 Mdh 蛋白具有92％的基本序列同一性的编码的MDH1蛋白，而mdh2-PB1编 码与MGA3 Mdh2和Mdh3蛋白分别具有91％和92％的基本序列同一性 的编码的Mdh2蛋白。基于这些序列分析，看起来MGA3和PB1拥有 MDH编码基因的两种子类型的“mdh/mdh1”型和“mdh2/mdh3型”。MGA3 具有一种mdh/mdh1型基因(pBM19)和两个mdh2/mdh3型基因(染色体)， 而PB1具有两种mdh/mdh1型基因(pBM20和染色体)和一种mdh/mdh3型 基因(染色体)。以下进一步研究这些差异的生物学影响。

实施例2：3D建模表明甲醇芽孢杆菌MDH属于Ⅲ型的Fe-NAD依赖性醇脱氢酶超家族

使用BLAST(Altschul,Gish et al.(1990)J Mol Biol 215(3):403-410) 用数据库中的蛋白质对编码的MGA3 Mdh、Mdh2和Mdh3基本序列进行 序列比较，这表明可推定它们属于III型醇脱氢酶(ADHs)(de Vries,Arfman  et al.(1992)J Bacteriol 174(16):5346-5353)，其是含铁ADHs的超家族。 MDHs的具有已知的三维结构的最接近的同源物是肺炎克雷伯菌 (Klebsiella pneumoniae)(PDB ID:3BFJ)的1,3-丙二醇脱氢酶，其显示与 Mdh具有46％的基本序列同一性和与Mdh2和Mdh3具有52％的基本序 列同一性。该种1,3-丙二醇脱氢酶是催化3-羟基丙醛转化成1,3-丙二醇 (1,3-PD)的III型Fe-NAD依赖性醇脱氢酶。先前已通过电子显微镜分析 了甲醇芽孢杆菌C1 MDH的结构，得出其是10个亚基被组织成5个亚基 的2个环的十聚体(Vonck,Arfman et al.(1991)J Biol Chem 266(6): 3949-3954)。有趣的是，最近的实验表明，1,3-PD脱氢酶具有类似的四级 结构。基于此，我们决定使用来自1,3-PD脱氢酶的求解三维结构的信息 来预测甲醇芽孢杆菌MGA3 Mdh的三维结构，以了解NAD依赖性醇脱 氢酶的有关催化活性位点的更多信息。MGA3 Mdh的主要氨基酸序列被 发送到Swiss模型(Swissmodel)，并且构建模型。1,3-PD脱氢酶的单体折 叠成被裂口分开的两个结构域。N末端结构域包含NAD⁺辅因子的结合位 点，且C末端结构域包括参与铁结合的残基。甲醇芽孢杆菌C1 MDH的 N末端区域中发现参与NAD⁺辅酶结合的保守基序GGGSX2DX2K。该基 序还存在于甲醇芽孢杆菌MGA3 Mdh中的位置95-104，它还存在于肺炎 克雷伯菌的1,3-PD脱氢酶的N末端区域。甲醇芽孢杆菌C1 MDH的 258-290区域包含若干组氨酸残基，并因此预测其参与金属结合。这与肺 炎克雷伯菌中的发现保持良好地一致，发现1,3PD脱氢酶为负责铁金属 的协调位置的4个残基。这些残基是保守的，并且对应于甲醇芽孢杆菌 MGA3 Mdh中的残基Asp193、His197、His262和His276，并且最有可能 负责该酶中锌的结合。总之，这些数据表明，甲醇芽孢杆菌MDH属于Ⅲ 型Fe-NAD依赖性醇脱氢酶，其得到本研究(参见下文)所提供的实验结果 的支持。

实施例3：来自MGA3和PB1的纯化的MDH蛋白都显示在体外具有NAD依赖性MDH活性

将mdh-MGA3、mdh2-MGA3、mdh3-MGA3、mdh-PB1、mdh1-PB1 和mdh2-PB1编码区域进行PCR扩增并克隆到大肠杆菌载体pET21a，分 别得到表达质粒pET21a_mdh-MGA3、pET21a_mdh2-MGA3、 pET21a_mdh3-MGA3、pET21a_mdh-PB1、pET21a_mdh1-PB1和 pET21a_mdh2-PB1。在所得的载体中，重组基因由强T7启动子转录，并 在它们的3'末端框内融合至6-组氨酸标签的编码序列，以简化纯化。将 该MGA3和PB1 act基因和类似的枯草杆菌nudF基因类似地克隆到 pET21a，分别得到质粒pET21a_act-MGA、pET21a_act-PB1和 pET21a-nudF(表1)。将构建的所有表达载体分别转化入大肠杆菌ER2566， 并将所得的重组菌株进行摇瓶培养用于生产各自的重组蛋白。通过亲和 层析法将该蛋白纯化至由SDS-PAGE(数据未示出)判断的95％以上的纯 度，并存储act和NudF蛋白供以后使用(参见下文)。

然后利用甲醇作为底物分析六种纯化的MDH蛋白质，结果表明所有 的酶都具有催化活性(参见图3)。为了排除这些蛋白质是否可以使用替代 的辅因子，通过用FAD⁺、FMN⁺和NADP⁺替代NAD⁺重复该分析，所有 情况下均没有检测到催化活性(数据未显示)，证实在这些条件下没有 MDHs可以使用的可替代辅因子。这些结果表明，甲醇芽孢杆菌菌株 MGA3和PB1两者具有三个不同的基因，1个位于质粒上且两个位于染 色体上，所有基因都编码有活性的NAD依赖性MDHs。

实施例4：所有的MDHs在体外都具有广泛的底物特异性和不同的醇偏好

通过使用多个替代醇类测试纯化的MDH蛋白的催化活性，并且所有 的酶都显示对乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、异丙醇和1,3-丙二醇作为 底物的活性(图3)。出人意料的是，对所有六种MDHs，对大多数可替代 底物的相对催化活性远高于对甲醇的活性。对每个不同的醇的相对催化 活性在三种MDHs之间大幅变化，这表明这些蛋白中不同的底物偏好。 例如，Mdh3-MGA3和Mdh2-PB1酶对丙醇的活性高于对甲醇活性的约 25-35倍。有趣的是，在测试条件下，这两种酶显示比剩余酶对所有这些 底物显著较高的催化活性。所有六种酶还显示甲醛和乙醛还原酶活性， 这在下面进一步探讨。基于这些数据，使得将这些蛋白质归类为ADHs 而非能够催化一系列不同的伯醇和仲醇转化为醛或酮的MDHs。

实施例5：MDH蛋白在体外表现出相似的最佳pH值和温度

为了建立可靠的测定条件用于可比较的生化表征，对六种MDH蛋白 的最佳pH和温度进行了分析。由于相对于甲醇，所有的MDHs对乙醇 显示高得多的催化活性(参见图3)，我们用乙醇作为底物进行这些实验， 以增加数据的敏感性。先前已报道来自甲醇芽孢杆菌菌株C1的MDH蛋 白的最佳pH值为9.5(Kloosterman,Vrijbloed et al.(2002)J Biol Chem  277(38):34785-34792)，和因此8.5-10.5之间的pH值范围内测试六种纯 化的MDH(20μg)的活性。所有的酶在pH为9.5至10之间显示最高的催 化活性(数据未示出)。接着，于25℃-50℃的温度范围在pH为9.5时测定 MDH的活性,结果表明,它们都具有45℃-50℃的(图4)之间的最佳温度。 基于这些数据,所有其他的MDH测定法都在pH为9.5和45℃进行。

实施例6：Mdh3-MGA3和Mdh2-PB1在体外显示比剩下的MDHs高的温度稳定性

通过在45℃和60℃预孵育蛋白来测试六种MDHs的热稳定性，并在 不同的时间点取样以用于酶测定。正如预期的那样，在45℃预孵育后所 有的酶基本上都保留了全部催化活性(图5)。在60℃预孵育6分钟后， Mdh-MGA3、Mdh2-MGA3，Mdh-PB1和Mdh1-PB1的催化活性强烈降低 (高达90％)，而推测这种处理仅对Mdh-MGA3和Mdh2-PB1的催化活性 有适度的负面影响(图5)。在存在等量纯化的Act时重复进行选择的实验， 这对任何MDHs的温度稳定性都没有影响(数据未示出)。

实施例7：通过Act体外催化刺激所有六种MDH蛋白

MGA3和PB1基因组序列都只有一个位于染色体上的act基因，其 与先前从MGA3克隆的act基因类似(Brautaset,Jakobsen et al.(2004)J  Bacteriol 186(5):1229-1238)。因此有兴趣研究各自的Act蛋白是否能够体 外刺激所有MDH蛋白的催化活性。为建立可靠的条件，首先在蛋白的不 同相对浓度(1:2-20:1)下使用甲醇作为底物测试Mdh-MGA3连同 Act-MGA3。在相对浓度为1:1和5:1之间时达到完全活化，并且没有观 察到由于相对高的激活剂浓度所致的抑制(数据未显示)。为了进一步测 试，总是使用相同浓度(1:1)的MDH和Act。接着，使用甲醇作为底物用 所有六种MDHs进行类似的测定，且数据表明，在存在Act的情况下， MGA3MDHs的MDH活性被诱导5-7倍(图6A)，PB1MDHs的活性被诱 导4-10倍(图6B)。

然后，我们进行了类似的分析，但使用乙醇作为底物，结果表明， MGA3 MDHs的催化活性提高了6-8倍(图6B)和PB1 MDH的催化活性提 高了2-5倍(图6B)。有趣的是，用甲醛或乙醛作为底物，Act的存在对任 何一种MDHs的催化活性都没有引起显著刺激(数据未示出)。因此，Act 提高了所有六种MDH蛋白体外的脱氢酶与还原酶的活性比。

实施例8：枯草芽孢杆菌NudF蛋白也可以在体外催化刺激Mdh

Nudix水解酶基因在细菌基因组中广泛存在，并且甲醇芽孢杆菌是这 个家族中已知的编码调节蛋白的唯一成员。枯草芽孢杆菌nudF基因产物 NudF显示与Act33％的总的基本序列同一性，并且已实验性地证实NudF 属于ADP-核糖焦磷酸酶亚家族。NudF和Act在证明对于底物和/或抑制 剂结合、金属结合和催化位点是重要的残基方面是相同的。研究NudF能 否替代Act体外激活甲醇芽孢杆菌MDHs。培养重组菌株大肠杆菌 ER2566(pET21a-nudF)用于NudF的重组生产和伴随的纯化。如上所述， 选择MdhDH-MGA3作为模型蛋白，并使用乙醇作为底物对其连同NudF 进行测试，结果清楚地表明，在这些条件下用NudF对MDH活性的刺激 与用Act的同样好(约8倍)(数据未示出)。该结果首次显示异源Nudix水 解酶可发挥激活蛋白功能，并且这应当也对我们目前对不同类蛋白质的 生物作用的认识有影响。

实施例9：在缺少Act时MDHs在体外具有类似的V_max和K_m,MeOH值

使MDHs经历动力学表征以确定V_max值和K_m值，并获得生物学相 关数据。通过使用甲醇作为底物进行这些实验。在如上所述的最适测定 条件下，测定三种MDH蛋白的初始反应速率(参见材料和方法)，并且数 据表明，它们显示相似的和非线性的米氏动力学。这些结果与MDH的来 自甲醇芽孢杆菌C1(Hektor,Kloosterman et al.(2002)Chem 277(49): 46966-46973；Kloosterman,Vrijbloed et al.(2002)J Biol Chem 277(38): 34785-34792)的MDH的类似的生化特征一致。他们建议，非激活状态的 MDH显示乒乓式反应机制，其中氧化还原活性辅因子发挥临时电沉积 (electron deposit)的功能，而激活状态的MDH催化辅因子独立反应，显示 三元配合物反应机制。通过使用非线性回归用Microsoft Excel solvertool 将所测量的数据与米氏方程拟合来分别计算K_m和V_max值。甲醇的K_m值 类似，且对于MGA3 MDHs而言，介于150mM和250mM之间，对于 PB1 MDHs而言，介于160mM和220mM之间。对于MGA3 MDHs而言， 相应V_max值介于0.04U/mg和0.09U/mg之间，且对于PB1 MDHs而言， 相应V_max值介于0.013和0.065U/mg之间(表2)。这些数据共同表明，在 测试条件下所有六种MDHs的动力学常数相对相似。我们还选择测试三 种MGA3 MDHs的初始反应速率同时改变NAD⁺的浓度，这表明它们显 示线性米氏动力学(数据未示出)。从米氏方程的非线性拟合，确定K_m,NAD+的值介于14μM-40μM之间(表2)。

表2：在存在和不存在Act时纯化的甲醇芽孢杆菌MDHs的体外动 力学常数。测定是在45℃和在pH为9.5下进行。

实施例10：在存在Act的情况下MDH的V_max值提高了4-6倍

然后通过在反应混合物(20μg MDH+20μg Act)中使用等浓度的 MDH和Act进行动力学实验。相比单一酶测定(表2)，Vmax值提高了 4-6倍，这证实Act刺激所有六种MDHs的催化活性。这些数据与图6中 给出的数据一致。

实施例11：在存在Act的情况下Mdh-MGA3、Mdh-PB1和Mdh1-PB1的K_m,MeOH值显著降低(高达70倍)

有趣的是，当将Act加入到反应中时，Mdh-MGA3的K_m,MeOH值显著 降低(17倍)至12mM，而Mdh2-MGA3和Mdh3-MGA3的相应K_m,MeOH值与无Act时测试的基本上保持相同。对于三种PB1酶，这是不同的。 在存在Act的情况下，Mdh-PB1和Mdh1-PB1的K_m,MeOH值显著降低(分 别为16倍和70倍)，Mdh2-PB1的该值被Act适度地降低(4-6倍)(表2)。 有趣的是，基于序列比对，我们将MGA3-Mdh、PB1-Mdh和PB1-Mdh1 蛋白列入一个MDH亚家族(见上文)，并且对这些发现的生物影响进行了 讨论(见下文)。

实施例12：相比对于甲醇，MDHs对于甲醛通常具有较高的V_max和较低的K_m值

在甲基营养型生长期间，MDH对于甲醇氧化的生物学意义是明确 的，而对这种酶在甲醇消耗细胞中作为甲醛解毒系统的生物学作用研究 较少。此处显示，所有的酶均表现出甲醛和乙醛还原酶活性(见上文)，我 们选择动力学表征该特性。通过使用甲醛作为底物，对于MGA3Mdh、 Mdh2和Mdh3蛋白而言，其K_m值分别为1mM、5mM和15mM，相应 的V_max值分别为1.4U/mg、1.5U/mg和5U/mg(表2)。对于PB1蛋白而 言，用于甲醛的K_m值分别为2.5mM、4mM和1.3mM，相应的V_max值 分别为0.45U/mg、0.53U/mg和1.12U/mg。总之，这些结果表明，相比 甲醇为底物，当甲醛为底物时，所有六种MDHs通常具有较高的亲和力 和较高的V_max。

实施例13：在指数式生长的甲醇芽孢杆菌细胞中以不同水平转录三种mdh基因

先前已证明，mdh-MGA3转录推测在甲醇芽孢杆菌细胞非常高，且 在相对甘露醇生长于甲醇的细胞中略微上调(约3倍)，而act转录水平在 两种生长条件下相似(Jakobsen et al.,(2006)J Bacteriol 188(8): 3063-3072)。此处，在一个类似的分析中包括来自MGA3的所有三种MDH 编码基因，并且结果表明，mdh-MGA3和mdh2-MGA3在甲醇上的相对 转录水平比在甘露醇上分别高2倍和3倍。在两种不同的生长条件下 mdh3-MGA3的转录水平基本类似。对于MDH，该结果与以前的数据 (Jakobsen et al.,(2006)J Bacteriol 188(8):3063-3072)相比有所不同，其原 因尚未可知。有趣的是，在标准条件下获得的三种基因的各自的Ct值高 度不同，其中mdh-MGA3显示迄今为止最低的值，这表示最高的转录水 平。发现Ct mdh2-Ct mdh是8且Ct mdh3-Ct mdh是14(考虑到在所有这 些实验中约100％的引物效率，这些数字应当意味着在测试条件下 mdh2-MGA3和mdh3-MGA3的转录水平分别低于mdh转录水平的约250 倍和10.000倍)。

该mdh2-MGA3和mdh3-MGA3编码序列在DNA水平上是96％相同 的，并且这些试验中排除rt-PCR引物的任何交叉杂交，针对携带各自 mdh2和mdh3基因序列的质粒DNA即pTMB1和pTMB2，测试各个 rt-PCR引物对(见材料与方法)。结果清楚地表明，当mdh2特异性引物与 pTMB2 DNA一起使用，或当mdh3特异性引物与pTMB1 DNA模板一起 使用时，没有获得可检测的PCR产物(数据未显示)。这些数据证实，用 于mdh2-MGA3和mdh3-MGA3的rt-PCR引物对其各自靶标具有特异性， 从而证实所获得的数据是可靠的。

对来自PB1的mdhs进行类似的分析，结果表明，mdh-PB1和 mdh2-PB1在甘露醇上相对于甲醇生长的转录水平基本类似。出人意料的 是，mdh1-PB1在甘露醇上的转录水平比在甲醇上高14倍，其对生物的 影响仍然是未知的。对于MGA3，我们认识到，PB1的这三种基因的相 对转录水平推测非常不同，并且mdh-PB1基因的转录水平比mdh1-PB1 和mdh2-PB1高得多(数据未示出)。

实施例14：甲醇芽孢杆菌mdh基因在大肠杆菌中的的表达

表达载体的构建

编码Mdh和Mdh激活蛋白Act的基因从携带来自甲醇芽孢杆菌菌株 MGA3(mdh-MGA3、mdh2-MGA3、mdh3-MGA3和act-MGA3)和 PB1(mdh-PB1，mdh1-PB1和mdh2-PB1)基因的pET21a-质粒扩增。然后 将所述基因克隆到pSEVA424质粒(mdh基因)或pSEVA131质粒(act基因) 中。对于mdh-MGA3、mdh-PB1、mdh1-PB1和act-MGA3的克隆，使用 EcoRI和HindIII限制位点，而使用EcoRI和PstI限制性位点克隆 mdh2-MGA3、mdh2-PB1和mdh3-MGA3。将所得的表达载体转化到电感 受态野生型大肠杆菌K-12(BW25113)和frmA基因删除的大肠杆菌 K-12(BW25113)中。

表达实验

对于表达的实验，将细胞培养在Luria-Bertani(LB)培养基中用于体外 测定或者M9培养基中用于体内测定，两种培养基都含有用于pSEVA424 的20μg/ml链霉素。当Act共表达时，培养基补充有100μg/ml氨苄青霉 素。通过在6小时内加入0.1mM IPTG(最终浓度)细胞达到OD 0.5(用于 体外测试)或OD 1(用于体内试验)时，诱导表达。然后通过离心收集细胞。 对于体外测定，超离心后通过在French press中裂解细胞来制备细胞粗提 取物。或者，将细胞重悬浮于不含葡萄糖的M9培养基中，用于体内活 性测定。

酶测定

Mdh活性的体外测定：为了测定细胞粗提取物中Mdh活性，在340nm 处监测Mdh依赖形成的NADH。该测定在37℃或45℃下在预热的缓冲 溶液中进行。Mdh测定含有10-20μg酶、50mM磷酸氢二钾缓冲液，pH 7.4的2.5mM氯化镁和0.5mM的NAD⁺(最终浓度)。预孵育5分钟后， 用1M甲醇(最终浓度)开始反应。

Mdh活性的体内测定：为了测定细胞悬浮液中Mdh的活性，经IPTG 诱导后，收集细胞，洗涤并重悬浮于不含葡萄糖的M9培养基和IPTG中。 将OD 600值设定为1，用于标准化。在37℃或45℃的振荡水浴中进行 测定。该测定通过加入1M的甲醇开始，随后测定由甲醇脱氢酶催化甲 醇氧化所得上清液中累积的甲醛。计算出的活性基于以下假设，即1升 OD 1培养物含有0.3克生物量，其中50％是蛋白质。

结果

来自甲醇芽孢杆菌菌株MGA3和PB1的在大肠杆菌中重组表达的不 同Mdhs的体内和体外活性概括于下文的表3中。从二甲醇芽孢杆菌 MGA3克隆act。

表3：来自大肠杆菌中重组表达的菌株MGA3和PB1的不同Mdh的 体内和体外活性。

n.a.＝不可用

在体外所有Mdhs在45℃下比在37℃下显示更高的活性。此外，Act 共表达时，来自MGA3的Mdhs体外活性显著增加。在体内，温度的影 响远远小于在体外的影响，并且未检测到Act的有利影响。在测试的所 有基因中，MGA3-Mdh2显示在体外和体内的总的最高活性。对于来自 PB1的Mdhs，图像看起来不一样。这里的Mdh1,其在结构上与来自MGA3 的Mdh密切相关，在测试的大多数条件下都显示出最高的活性。令人惊 讶的是，在体内测试时,来自PB1的所有3种Mdhs都没有显示活性或只 显示非常弱的活性。这一发现出乎意料，因为在37℃的体外活性看起来 是有希望的。其原因尚不清楚。根据可用的数据，mdh2-MGA3似乎是用 于最大化体外和体内测试的大肠杆菌中甲醇脱氢酶的活性的整体最佳选 择。

实施例15：甲醇芽孢杆菌mdh基因在枯草芽孢杆菌中的表达

表达载体的构建

使用大肠杆菌DH5α细胞进行所有的克隆步骤。用含有枯草杆菌 mntA核糖体结合位点(RBS)的正向引物和含有短连接体和His6标签的反 向引物，从甲醇芽孢杆菌MGA3基因组DNA克隆act-MGA3基因(图7A)， 所述短连接体含有SwaI和BglII限制性位点。使用SpeI和BamHI限制 性位点将基因插入pHB201和pHCMC04质粒中。以同样的方式，从来自 甲醇芽孢杆菌MGA3的pBM19质粒克隆mdh-MGA3基因，并由甲醇芽 孢杆菌MGA3基因组DNA克隆mdh2-MGA3和mdh3-MGA3基因。还将 这三个基因连接到pHB201和pHCMC04质粒中。

为构建用于共表达act和这三种不同的甲醇脱氢酶基因的载体，用含 有终止密码子和枯草芽胞杆菌mntA RBS的正向引物和含有含SwaI和 BglII限制性位点的短连接体的反向引物，PCR扩增甲醇脱氢酶基因(图 7B)。然后用StuⅠ和BglII末端酶切各个基因，并连接到载体act-pHB201 的SwaI和BglII位点。以这种方式在act基因后引入终止密码子，并且 甲醇脱氢酶基因现在包含His6标签。测序后，用SpeI和BamHI限制位 点将基因转移到pHCMC04质粒中(图7B)。通过测序证实插入物。

建立表达甲醇脱氢酶的重组枯草芽孢杆菌细胞

将枯草芽孢杆菌168细胞用act-MGA3、mdh-MGA3、mdh2-MGA3 和mdh3-MGA3表达质粒，以及类似的共表达每一种甲醇脱氢酶基因和 act-MGA3基因的载体转化。从平板上挑取阳性菌落，分离质粒，并通过 限制检查阳性克隆。从平板上挑取菌落，并在37℃(250rpm)培养过夜， 并在含有氯霉素(5μg/ml)的20ml LB中稀释至OD 600＝0.1。在37℃(250 转)生长3小时后，向培养物中加入500μl 40％的木糖以诱导表达。另外 生长该培养物3小时并取样2ml。将样品11.000×G下离心2分钟，并 除去上清液。将沉淀物重悬浮于300μl的BirnboimA用于枯草芽孢杆菌 (pH为8.0的10mM Tris-盐酸；20％蔗糖；50mM氯化钠；0.25mg/ml 溶菌酶；蛋白酶抑制剂)，并在37℃下孵育30分钟。使用前将样品保存 在-80℃。此外，体外测定中我们利用了表达来自pET21a质粒的 mdh-MGA3、mdh2-MGA3、mdh3-MGA3和act-MGA3的项目中构建的重 组大肠杆菌细胞的优点。

体外测定甲醇脱氢酶活性

通过分光光度计计量NADH的形成后测定Mdh蛋白质的活性。该反 应混合物含有：

-100μl甘氨酸-KOH(pH值9.5)

-100μl 5M甲醇(或5M乙醇)

-5μl 1M硫酸镁

-10μl 50nM的NAD+

-10μl样品

-(10μl大肠杆菌act-pET21a裂解物)

-775μl水

在50℃预孵育小容器和无细胞裂解物的反应混合物。随后于50℃在 340nm处进行NADH的形成10分钟。每分钟吸收单位的增加除以消光 系数(6,23cm^-1mm^-1)和以U/mg总蛋白表示的总蛋白浓度来计算总活性。 所有测定都是通过使用甲醇和乙醇作为替代底物进行。

结果

测试的三个基因mdh-MGA3、mdh2-MGA3和mdh3-MGA3均在宿主 枯草芽孢杆菌中表达活性的甲醇脱氢酶，而act-MGA3单独未表达可检测 到的甲醇脱氢酶活性(图8)。在一般情况下，对于测试的所有三种基因， 使用乙醇代替甲醇作为底物时，活性显著更高(这类似于从重组大肠杆菌 细胞中纯化这些酶时所观察到的)。在所有情况下，甲醇脱氢酶的活性受 到Act的显著刺激。当act与甲醇脱氢酶基因在枯草芽孢杆菌168中由相 同的质粒共表达时，似乎Mdh2蛋白是最活跃的。然而，我们注意到， 当从大肠杆菌裂解物中提供Act时，则mdh-MGA3基因是最活跃的。因 此，体外测试时，mdh2-MGA3基因与act-MGA3一起共表达是最大化枯 草芽孢杆菌中甲醇脱氢酶活性的整体最佳选择。

实施例16：将甲醇掺入基因工程谷氨酸棒杆菌

¹³C标记实验

对于标记实验，我们使用表达Mdh2-MGA3(pVWEx1-Mdh2)、Hps 和Phi(pEKEX3-Hps+Phi)的谷氨酸Δald菌株。使用带有空pEKEX3质 粒的谷氨酸棒杆菌Δald菌株作为阴性对照。在含有(每升)3.48g Na₂HPO₄·12H₂O、0.60g KH₂PO₄、0.51g NaCl、2.04g NH₄Cl、0.10g MgSO₄、4.38mg的CaCl₂、15mg Na₂EDTA·2H₂O、4.5mg ZnSO₄·7H₂O、 0.3mg CoCl₂·6H₂O、1mg MnCl₂·4H₂O、1mg H₃BO₃、0.4mg Na₂MoO₄·2H₂O、3mg FeSO₄·7H₂O和0.3mg CuSO₄·5H₂O的M9培养基上 生长所有谷氨酸棒杆菌菌株。对于所有的培养(M9或LB)，使用1mM IPTG作为诱导剂，且将100μg/ml壮观霉素和25μg/ml卡那霉素加入培 养基中作为抗性标记物。所有的培养于30℃下进行。将来自甘油原液的 细胞菌株铺板于LB琼脂板(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10 g/LNaCl和16g/L琼脂)上，之后在LB液体培养基上生长6小时。由LB 培养物，以最终OD 600为0.6，将含M9培养基加3g/L核糖的液体预培 养物接种12小时。对于标记实验，由M9(+核糖)培养物，以最终OD 600 为0.8，接种含M9培养基的液体培养物。在加入¹³C-甲醇(即零分钟时间 点)之前采集一种培养样品，然后加入40mM13C-甲醇，在30和90分钟 时采集两种样品。为了淬灭代谢活性和提取细胞内的代谢物，将培养的 样品分散到乙腈/甲醇/0.1M甲酸水溶液(40/40/20体积/体积)的冷溶液(-20 ℃)中。使用连接到三重四极杆的QTrap4000质谱仪(Applied Biosystems, Foster City,USA)的Dionex ICS2000系统(Dionex,Sunnyvale,USA)测定细 胞内代谢物的标记模式。

结果

正如所预期的，在¹³C-甲醇脉冲后，在野生型菌株中没有检测到质 量同位素分数M1(即有一个标记的碳原子的分子)中的标记(图9A)。在表 达来自RuMP途径的两种重组反应物(Hps和Phi)和来自甲醇芽孢杆菌菌 株MGA3(Mdh2-MGA3)的NAD依赖性甲醇脱氢酶的突变体中，观察标 记向代谢产物中的明显掺入(图9B)。当果糖-二磷酸和核糖-5-磷酸中的标 记量在30和90分钟之间增加时，标记量在磷酸烯醇丙酮酸和2/3-磷酸甘 油酸保持不变。这些数据清楚地表明，所引入的甲基营养型途径在体内 运行，导致甲醇同化到中心碳代谢中。

应当注意的是，在这些和以下描述的其他实验中，技术上的限制意 味着不能直接检查甲醛的¹³C-标记。然而，通过还表达下游的RuMP途 径的酶，可以分析¹³C向代谢物的掺入，从而间接地检测¹³C-标记的甲醇 的同化作用。此外，在上述实验中已证实重组表达的MDH在体外的活性， 参见上面的示例实施例3-6。

实施例17：将甲醇掺入基因工程大肠杆菌中

结果

我们用代谢标记实验，证明Mdh、Hps和Phi在活细胞中是有功能的。 用¹³C标记的甲醇或¹³C甲醛饲喂表达所有三种蛋白的细胞，并且可以证 明两种C-1化合物掺入到若干代谢物中。

对于所述实验，我们使用的大肠杆菌细胞缺乏表达甲醛脱氢酶的基 因(ΔfrmA)，表达仅来自不同pSEVA质粒(424和131)的mdh2、hps和phi 或hps和phi。用于该实验的所有基因均来自甲醇芽孢杆菌MGA3。在37 ℃下于优化的含有核糖作为唯一碳源的M9基本培养基中获得预培养物。 将细胞转移到新鲜的无核糖的M9培养基中，用于实验。该实验通过加 入¹³C-标记的甲醇或甲醛来开始。为检查掺入，在不同的时间点取样， 由冷淬火停止代谢，随后将样品随后通过LC-MS分析对样品进行分析。

当加入甲醇作为唯一底物时(图10A)，可以在若干代谢物，如戊糖 5-磷酸、己糖6-磷酸、磷酸烯醇丙酮酸盐和乙酰辅酶A中检测到标记。 更深入的分析表明，对RuMP循环必要的若干代谢物如戊糖5-磷酸，显 示出多种标记的碳化合物的掺入，这表示进行了完整的功能循环。当使 用甲醛时(图10B)，也出现标记的碳原子的掺入(事实上，相对于甲醇掺 入它出现得更快，这表明Hps和Phi比Mdh更快起作用，或者甲醛掺入 或由甲醇生产甲醛浓度所需的C-5前体分子的量是有限的)。在使用¹³C- 标记的甲醇作为底物的对照实验中，发现Hps和Phi单独的表达并不允 许¹³C-标记的甲醇同化(数据未示出)。

这些发现清楚地表明，三种引入的甲基营养型模块被功能性地表达。 我们还证明，三种蛋白的表达导致甲醇和甲醛通过建立的RuMP循环掺 入到生物质中。用甲醇或甲醛作为碳源，我们可以证明，通过Hps和和 Phi甲醛的同化比甲醇的同化快得多，但可能会受到可利用的C5-前体分 子的限制。

实施例18：将甲醇掺入到基于工程枯草芽孢杆菌中

表达载体的构建

使用大肠杆菌DH5α细胞进行所有的克隆步骤。用含有枯草芽孢杆 菌mntA核糖体结合位点(RBS)的正向引物和含有含SwaI和BglII限制性 位点的短连接体和His6标签的反向引物，由甲醇芽孢杆菌MGA3基因组 DNA克隆act-MGA3基因(图7A)。使用SpeI和BamHI限制性位点将该 基因插入到pHB201质粒中。

为了构建用于共表达act、mdh3、hxlA、hxlB、glpX、fba、tkt、pfk 和rpe的载体，用含有终止密码子和枯草芽胞杆菌mntA RBS的正向引物 和含有含SwaI和BglⅡ限制性位点的短连接体的反向引物，PCR扩增这 些基因(图11)。为了扩增act和mdh3，使用MGA3的基因组DNA，并且 对于glpX、fba、tkt、pfk和rpe基因，使用甲醇芽孢杆菌MGA3的pBM19 质粒，而对于hxlA和hxlB基因，使用枯草芽孢杆菌168的DNA。然后 用Stu Ⅰ和BglII末端酶切各个基因，并连接到载体的SwaI和BglII位点。 将这些基因依次引入载体中，从而建立9个基因的合成操纵子(图11)。以 这种方式，在每个基因后引入终止密码子，且合成操纵子的最后一个基 因现在包含His6标签。在合成操纵子引入各基因后，通过测序验证正确 的插入。测序后，用SpeI位和BamHI限制位点将合成操纵子转移至 pHCMC04质粒中(图7B)。通过测序证实插入物。

RuMP途径基因在枯草芽孢杆菌168中的表达

为了建立表达RuMP途径的酶的重组枯草芽孢杆菌细胞，用含RuMP 途径基因的载体转化枯草芽孢杆菌168细胞(图7A)。从平板上挑取阳性 菌落，分离质粒，并通过限制检查阳性克隆。从平板上挑取菌落，并在 37℃(250rpm)培养过夜，并在补充有维生素和氯霉素(5μg/ml)的100ml MSR培养基(25g/L酵母提取物、15g/L的胰蛋白胨，3g/L K₂HPO4、1 ％的葡萄糖)中稀释至OD 600＝0.1。在37℃(250rpm)生长3小时后，将 1.25ml 40％的木糖加入到培养物中以诱导表达。另外生长该培养物3小 时，4000×G下离心细胞10分钟，并除去上清液。将沉淀物用MSR培 养基洗涤，并重新悬浮于用于枯草芽孢杆菌的4ml Birnboim A(含有2mM Tris-HCl(pH 7.4)、20％蔗糖、50mM的NaCl和0.25mg/ml溶菌酶的裂解 缓冲液中)中，并在37℃下孵育30分钟。将样品在4℃以13,000XG离心 20分钟，且上清液用于HisTrap纯化。

将纯化的蛋白质的级分合并，并使用Vivaspin(商标)柱(GE Healthcare) 浓缩。使纯化的蛋白质通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色(图12)可视。我 们证明，包含His6标签的每种蛋白从合成操纵子表达(图11)。

¹³C-标记实验

我们使用了表达Act、Mdh3、HxlA和HxlB的枯草芽孢杆菌菌株及 表达Act、Mdh3、HxlA、HxlB、GlpX、Fba、Tkt、Pfk和Rpe的菌株， 用于标记实验。使用带有空pHCMC04质粒的枯草芽孢杆菌菌株作为阴 性对照。在含有(每升)3.48g Na₂HPO₄·12H₂O、0.60g KH₂PO₄、0.51g NaCl、2.04g NH₄Cl、0.10g MgSO₄、4.38mg CaCl₂、15mg Na₂EDTA·2 H₂O、4.5mg ZnSO₄·7H₂O、0.3mg CoCl₂·6H₂O、1mg MnCl₂·4H₂O、 1mg H₃BO₃、0.4mg Na₂MoO₄·2H₂O、3mg FeSO₄·7H₂O和0.3mg CuSO₄·5H₂O、10g木糖(即诱导剂)和5mg氯霉素的M9培养基中，生 长所有的枯草芽孢杆菌菌株。所有的培养均在37℃下进行。将来自甘油 原液的细胞菌株铺板于含有5μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上(10g/L胰蛋 白胨、5g/L酵母提取物、10g/L的NaCl、和16g/L琼脂)，之后在LB+ 氯霉素的液体培养基中生长约5小时。在最终OD 600为1.4和1.8之间 时，接种来自LB培养物的含M9培养基的液体预培养物。加入¹³C-甲醇 (即零分钟时间点)之前采集一个样品，然后加入40mM的¹³C-甲醇，并 在30和90分钟时采集两个样品。为了淬灭代谢活性和提取细胞内的代 谢物，将培养的样品分散到的乙腈/甲醇/0.1M甲酸水溶液(40/40/20体积/ 体积)冷溶液(-20℃)中。用连接到三重四极杆的QTrap4000质谱仪 (Applied Biosystems,Foster City,USA)的Dionex ICS2000系统(Dionex, Sunnyvale,USA)测定细胞内代谢物的标记模式。

结果

正如所预期的，在¹³C-甲醇脉冲后，在野生型菌株中没有检测到质 量同位素分数M1标记(即有一个标记的碳原子的分子)(图13A)。此外， 在表达来自RuMP途径的两种重组反应物(HxlA和HxlB)、激活蛋白(Act) 和NAD依赖性甲醇脱氢酶(Mdh3)的突变体中没有检测到标记，但来自戊 糖磷酸途径(PPP)的基因没有一个过表达(图13B)。然而，除了前面的四 个基因，当PPP基因过表达时，检测到明显的标记掺入(图13C)。这些数 据清楚地表明，引入的甲基营养菌途径在体内运行，导致甲醇同化到中 心碳代谢中。这些结果还表明，通过PPP供给C-5前体分子为枯草芽孢 杆菌中甲醇掺入的瓶颈。然而，这可以通过过表达编码PPP相关的酶的 基因来减轻。