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2018-02-23
授权
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2015-07-29
著录事项变更 IPC(主分类):C07K16/28 变更前: 变更后: 申请日:20121130
著录事项变更
2015-03-04
实质审查的生效 IPC(主分类):C07K16/28 申请日:20121130
实质审查的生效
2014-12-17
公开
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发明领域
本发明涉及鉴定功能性TREM-1抗体的方法。本发明还涉及能够特异性地结合TREM-1并能够降低或阻断TREM-1活性(信号转导和/或活化)的抗体。此外，本发明涉及所述抗体的用途，例如治疗和药物用途。
发明背景
髓样细胞表达的触发受体-1 (TREM-1)是在单核细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞中表达的受体。当被激活时，TREM-1与信号转导蛋白质DAP12缔合，并触发促炎细胞因子从表达它的细胞中释放(Bouchon等，J. Immunol. 2000; 164(10): 4991-4995)。已知TREM-1 mRNA和蛋白质表达在患有脓毒症、类风湿性关节炎(RA)和炎性肠病(IBD)的个体的髓样细胞中增量调节。越来越多的科学证据支持TREM-1促成炎性疾病发生和发展的理论，因为募集到发炎区域的TREM-1阳性单核细胞和嗜中性粒细胞使炎症恶化(Bouchon等，Nature 2001; 410: 1103-1107；Schenk等，Clin Invest. 2007; 117(10): 3097–3106)；Kuai等，Rheumatology (Oxford). 2009; 48(11):1352-1358。
能够结合TREM-1的抗体是已知的，包括市售的TREM26和TREM37 (目录号分别为314902和316102，Biolegend，San Diego，CA 92121，USA)、MAB1278 (目录号MAB1278，R&D Systems，Minneapolis，MN 55413，USA)、mAb 6B1 (目录号HM2252，Hycult Biotech，Uden，Netherlands)和抗TREM-1 2E2 (目录号HPA005563，Sigma-Aldrich，Denmark)。所有已知的TREM-1抗体在固定时是激动性的；即它们增加细胞因子从单核细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞中释放。已知的TREM-1抗体的另一个特性是它们不与来自灵长类动物(例如食蟹猴(cynomolgus monkey)或恒河猴(rhesus monkey))的TREM-1交叉反应，这意味着在这些动物中无法测试已知的抗体。
因此，本领域需要能够结合和阻断TREM-1的功能的抗体。本领域需要能够防止TREM-1形成二聚体/多聚体的TREM-1抗体。本领域需要能够阻断TREM-1活化和信号转导的TREM-1抗体。本领域需要能够干扰TREM-1与其配体间的相互作用的TREM-1抗体。本领域需要能够阻断细胞因子从髓样细胞中释放的TREM-1抗体。本领域需要在溶解或固定时几乎没有或没有激动活性的TREM-1抗体。本领域还需要能够结合人TREM-1和来自一个或多个其它物种(例如灵长类动物)的TREM-1两者的抗体，从而能够在合适的动物模型中进行毒理学研究以及评价抗体的药代动力学和药效学。
本文公开了适宜用作药物的TREM-1抗体。所述抗体可能对患有脓毒症或慢性炎性疾病(例如类风湿性关节炎、银屑病性关节炎和炎性肠病)的个体的生命质量具有重大影响。
概述
本发明涉及鉴定功能性TREM-1抗体的方法，所述方法包括(a)培养表达TREM-1、信号转导蛋白和报道构建体(reporter construct)的第一细胞；(b)在将第一细胞与TREM-1调节剂一起温育时测量所述细胞的活性；(c)使(b)的共培养物与TREM-1抗体接触；和(d)测得第一细胞的活性小于或大于(b)中测量的活性。
可调整方法以鉴定阻断性TREM-1分子，例如抗体。鉴定阻断性TREM-1抗体的方法包括(a)培养表达TREM-1、信号转导蛋白和报道构建体的第一细胞；(b)在将第一细胞与激活性化合物(例如TREM-1配体)或激活的嗜中性粒细胞一起温育时测量所述细胞的活性；(c)使第一细胞和激活性化合物(例如TREM-1配体)或激活的嗜中性粒细胞的共培养物与TREM-1抗体接触；和(d)测得第一细胞的活性小于(b)中测量的活性。
可调整方法以鉴定刺激性TREM-1抗体。鉴定刺激性TREM-1抗体的方法包括(a)培养表达TREM-1、信号转导蛋白和报道构建体的第一细胞；(b)测量第一细胞的活性；(c)使所述细胞与TREM-1抗体接触/温育；和(d)测得第一细胞的活性大于(b)中测量的活性。
第一细胞可为造血起源。(b)的调节剂可为激活的嗜中性粒细胞或TREM-1配体。信号转导蛋白可为DAP10、DAP12、TCRζ、FcγRIII和Fc受体或其部分。信号转导蛋白可通过转录因子例如NFAT或NFκB传递信号。报道基因可为不在所述第一细胞中天然表达的基因，并可为编码β-半乳糖苷酶、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)或氯霉素转移酶的基因。本发明还涉及可借助本发明方法鉴定的刺激性TREM-1抗体。
本发明涉及能够与TREM-1特异性地结合且能够阻断TREM-1功能的抗体。所述抗体能够防止或减少TREM-1的二聚化或多聚化。所述抗体能够阻断TREM-1与其配体间的相互作用，或该抗体能够阻断被TREM-1配体诱导的TREM-1功能。TREM-1可为人TREM-1和/或来自另一非人物种的TREM-1，例如来自另一非人灵长类动物的TREM-1。
本发明的抗体能够与mAb 0170竞争结合人TREM-1。本发明的抗体能够特异性地结合包含SEQ ID NO: 1 (人TREM-1)的氨基酸D38-F48的多肽。本发明的抗体可具有包含选自SEQ ID NO: 1 (人TREM-1)的D38、V39、K40、C41、D42、Y43、T44和L45的1、2、3、4、5、6、7个或全部氨基酸残基和选自SEQ ID NO: 1 (人TREM-1)的E46、K47和F48的氨基酸残基的1、2个或全部氨基酸残基的表位，可采用HX-MS测定。本发明的抗体可具有包含选自SEQ ID NO: 1 (人TREM-1)的D42、E46、D92和H93的1、2、3个或全部氨基酸残基的表位，可通过测量与TREM-1的变体结合的抗体来测定。
本发明的抗体能够与mAb 0170竞争结合食蟹猴TREM-1。本发明的抗体能够特异性地结合包含食蟹猴TREM-1 (SEQ ID NO: 12)的氨基酸E19-L26或SEQ ID NO: 21的相应氨基酸的多肽，可采用HX-MS测定。
本发明的抗体可用作治疗患有一种或多种自身免疫病和/或慢性炎症的个体的药物。因此，本发明还涉及治疗患有一种或多种自身免疫病和/或慢性炎症的个体的方法。
附图简述
图1：BWZ.36/hTREM-1:DAP12:NFAT-LacZ细胞系(本文亦称为“BWZ/hTREM-1报道细胞”)的活化被抗体例如14F128和14F113降低，但不被市售抗体MAB1278 MAB1278 (R&D Systems，Minneapolis，MN 55413，USA：目录号MAB1278)、抗TREM-1 HPA (Sigma，USA：目录号HPA005563)、aTREM26 (Biolegend，San Diego，CA 92121，USA：目录号314902)和aTREM37 (Biolegend，San Diego，CA 92121，USA：目录号316102)降低。
图2：单独或与TLRL预刺激的嗜中性粒细胞共培养的BWZ/hTREM-1报道细胞。与未激活的嗜中性粒细胞相比，TLRL激活的嗜中性粒细胞能够诱导信号(发光)增加15倍(参见最后两栏)。阳性对照(板结合的激动性MAB1278 (R&D Systems，Minneapolis，MN 55413，USA：目录号MAB1278)在该实验中得到32倍诱导(参见第2栏)。以平均值± SEM (n = 3)对数据绘图。
图3：其中TREM-1被PGN-激活的嗜中性粒细胞刺激的归一化报道分子测定，显示市售抗体TREM-26 (目录号314902，Biolegend，San Diego，CA 92121，USA)、TREM-37 (目录号316102，Biolegend，San Diego，CA 92121，USA)、MAB1278 (目录号MAB1278，R&D Systems，Minneapolis，MN 55413，USA)和抗TREM-1 HPA (目录号HPA005563，Sigma，St Louis，MO，USA)在报道分子测定中是增强TREM-1依赖性发光信号的激动性抗体(给出高于1的信号)。表明标识为5F27A1和14F69的抗体是最佳阻断剂(给出小于0.5的信号)。以平均值± SEM (n = 3)对数据绘图。同种型对照MAB002 (目录号MAB002，R&D Systems，Minneapolis，MN 55413，USA)。所有抗体均以1 μg/ml使用。
图4：BWZ/hTREM-1报道分子测定中的活性。x轴上，TREM-1阻断性活性以在将0.2 μg/ml抗体加入BWZ/hTREM-1报道细胞中时所保持的活性表示，所述报道细胞用PGN刺激的嗜中性粒细胞预激活。当TREM-1抗体是板结合的时，一些(包括所有的市售TREM-1抗体)能够交叉结合TREM-1从而激活TREM-1。这种活性在y轴上表示。因此与已知抗体相比，在左下角方框中以小圆点表示的抗体全都显示不同的性质，是有利地阻断性的，而不是激动性的。
图5：人TREM-1抗体与来自恒河猴的PBMC的结合。在左上角，显示大多数抗体只结合人TREM-1 (每个黑色圆点代表一种抗体)。一些抗体，例如mAb 0025和14F128、14F11、14F29、14F113和14F69，能够与人TREM-1和恒河猴TREM-1两者结合，表明交叉反应性。
图6：抗人TREM-1抗体与来自食蟹猴的PBMC的结合。在左上角，显示了大多数抗体仅结合人TREM-1 (每个黑色圆点代表一种抗体)。一些抗体，例如mAb 0025和14F128、14F11、14F29，能够结合人和食蟹猴TREM-1两者，表明交叉反应性。一些抗体，例如14F69 (mAb 0044)，能够同样好地结合食蟹猴PBMC (图6B)和人PBMC (图6C)。
图7：在mAb 0023或mAb 0026 (A)、mAb 0024或Biolegend Clone 26 (B)、mAb 0025 (C)或RnD Biosystems的MAB1278 (D)存在或不存在时HX分析的hTREM-1肽的序列覆盖。在HX分析的肽之上显示一级序列(如水平条形柱所示)。在mAb存在或不存在时都显示类似交换模式的肽用白色表示，而在mAb结合时显示氘掺入减少的肽使用黑色。用方框标出的序列区限定表位。
图8：hTREM-1上mAb 0025的表位的结构作图。hTREM-1 (pdb 1Q8M)的结构用二聚体的一部分作为黑色C-α丝线表示。hTREM-1二聚体的另一部分用灰色条带表示，其中0025表位用黑色表示。
图9：与TREM-1配体复合物共培养的BWZ/hTREM-1报道细胞反映了TREM-1功能性，其被TREM-1 mAb-0170剂量依赖性地抑制。
图10：TNFα从受PGLYRP-1刺激的M2巨噬细胞中的释放被TREM-1抗体阻断。
图11：对人和食蟹猴TREM-1序列进行比对。在两种之间不同的氨基酸残基用粗体表示。突出显示已表明位于表位内的残基(使用HX-MS和表面等离子共振测定)。
序列简述
SEQ ID NO: 1表示野生型(wt)人TREM-1的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 2表示m14F69抗体可变重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 3表示m14F69抗体可变轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 4表示第一人源化TREM-1抗体(mAb 0170)重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 5表示第一人源化TREM-1抗体(mAB 0170)轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 6表示第二人源化TREM-1抗体(mAb 0122)重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 7表示第二人源化TREM-1抗体(mAb 0122)轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 8表示m14F128抗体重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 9表示m14F128抗体轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 10表示m14F113抗体重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 11表示m14F113抗体轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 12表示在大肠杆菌(E. coli)中表达时野生型(wt)食蟹猴(c) TREM-1胞外域的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 13表示K20A-hTREM-1-Cmyc2-His6 (构建体0222)的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 14表示A24T/Y28F/N30S/R32Q/P70H-cTREM-1-Cmyc2-His6 (构建体0244)的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 15表示A24T/Y28F/N30S/R32Q/E54K-cTREM-1- Cmyc2-His6 (构建体0245)的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 16表示引物的核酸序列。
SEQ ID NO: 17表示引物的核酸序列。
SEQ ID NO: 18表示人(h) TREM-1(1-134)-His6的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 19表示cTREM-1-Cmyc2-His6 (构建体0238)的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 20表示hTREM-1-Cmyc2-His6 (构建体0247)的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 21表示全长cTREM-1的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 22表示全长鼠(m) TREM-1的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 23表示全长hPGLYRP1的氨基酸序列。
发明描述
TREM-1是由234个氨基酸组成的跨膜蛋白质，包括单一胞外免疫球蛋白结构域和没有明显的信号转导基序的短胞质尾。当被激活时，TREM-1与含ITAM的信号转导衔接物蛋白DAP12缔合。下游信号转导可包括NFAT转录因子的活化，引起促炎细胞因子产生增量调节。
本发明涉及能够特异性地结合并阻断TREM-1的功能的抗体。本发明的抗体可通过减少/阻断TREM-1活化和下游信号转导来阻断TREM-1功能。
本发明的抗体可通过直接或间接阻断TREM-1的数种不同机制的一种或组合中的一种，来阻断TREM-1。例如，本发明的抗体可阻止TREM-1的天然配体肽聚糖识别蛋白1 (PGLYRP1)与TREM-1产生功能性复合体，和/或本发明的抗体可通过阻止各个TREM-1分子形成二聚体或多聚体来阻断TREM-1。能够结合否则将驻留在TREM-1二聚体界面的TREM-1的一部分，因此防止各个TREM-1分子彼此缔合的TREM-1抗体可减少或阻止TREM-1二聚化或多聚化。干扰TREM-1与配体相互作用的TREM-1抗体可减少或防止TREM-1二聚化或多聚化。本发明的抗体可阻断PGLYRP1诱导的TREM-1活化。PGLYRP1，一种高度保守的由信号肽和肽聚糖结合结构域组成的196个氨基酸长的蛋白质，在嗜中性粒细胞中表达，并在其活化时释放。本发明的抗体可减量调节促炎细胞因子从髓样细胞中释放。如本文所公开的，本发明的抗体可阻断TNFα、MIP-1β、MCP-1、IL-1β、GM.CSF、IL-6和/或IL-8从巨噬细胞、嗜中性粒细胞、滑膜组织细胞和/或报道细胞中释放。
本发明的抗体能够结合人TREM-1和来自另一非人物种的TREM-1两者。本文所用术语“TREM-1”因此包括可来源于任何合适生物的任何天然存在的形式的TREM-1。例如，如本文所述使用的TREM-1可为脊椎动物TREM-1，例如哺乳动物TREM-1，例如来自灵长类动物(例如人、黑猩猩、食蟹猴或恒河猴)；啮齿动物(例如小鼠或大鼠)、兔类动物(例如兔)或偶蹄动物(例如牛、绵羊、猪或骆驼)的TREM-1。优选TREM-1是SEQ ID NO: 1 (人TREM-1)。TREM-1可为成熟形式T的REM-1，例如在合适细胞内进行翻译后加工的TREM-1蛋白。例如，这种成熟的TREM-1蛋白可被糖基化。TREM-1可为全长TREM-1蛋白。
就本发明的抗体直接或间接来源于B淋巴细胞的单个克隆的意义而言，它们可为单克隆抗体。TREM-1抗体可采用例如实施例所述方法产生、筛选和纯化。简单地说，合适的小鼠例如TREM-1或TREM-1/TREM-3敲除(KO)小鼠可用TREM-1、表达TREM-1的细胞或两者的组合免疫。
从本发明的单克隆抗体的混合物的意义来说，本发明的抗体可为多克隆。
杂交瘤上清液的初步筛选可采用直接ELISA或FMAT进行，二级筛选可采用流式细胞术进行。然后可在报道基因测定中筛选阳性杂交瘤上清液。
抗体可在原核或真核细胞中重组表达。原核细胞可为大肠杆菌。真核细胞可为酵母、昆虫或哺乳动物细胞，例如来源于是灵长类动物(例如人、黑猩猩、食蟹猴或恒河猴)、啮齿动物(例如小鼠或大鼠)、兔类动物(例如兔)或偶蹄动物(例如牛、绵羊、猪或骆驼)的生物的细胞。合适的哺乳动物细胞系包括但不限于HEK293细胞、CHO细胞和HELA细胞。TREM-1抗体还可通过本领域技术人员已知的其它方法产生，例如噬菌体展示或酵母展示。
一旦产生，可采用实施例所述方法，针对与例如全长TREM-1或其突变体的结合筛选抗体。
本发明的一个实施方案是鉴定功能性TREM-1抗体的方法。能够特异性地结合TREM-1且对TREM-1活化和下游信号转导具有任何作用的抗体在本文称为“功能性TREM-1抗体”。“功能性” TREM-1抗体在本文是指能够阻断或刺激TREM-1的抗体。鉴定功能性TREM-1抗体的方法包括(a)培养表达TREM-1、信号转导蛋白和报道构建体的第一细胞；(b)在将第一细胞与TREM-1调节剂一起温育时测量所述细胞的活性；(c)使(b)的共培养物与TREM-1抗体接触；和(d)测得第一细胞的活性小于或大于(b)中测量的活性。
(a)的“第一细胞”可为造血起源的细胞，例如髓样细胞，例如T细胞。(a)的信号转导蛋白可为能够与TREM-1形成复合体的任何信号转导蛋白。合适的信号转导蛋白包括DAP10、DAP12、TCRζ、FcγRIII和Fc受体或其部分。(a)的报道构建体可为能够通过信号转导蛋白被激活并产生可识别信号的任何构建体。合适的报道构建体包含转录因子和报道基因。信号转导蛋白可通过选自NFAT和NFkB的转录因子传送信号。报道基因是不在所述第一细胞中天然表达的基因，并且可为编码β-半乳糖苷酶、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)或氯霉素转移酶的基因。所述第一细胞可采用本领域众所周知的方法用转录因子和报道基因转染。
实施例中描述的“BWZ/hTREM-1报道细胞”是“第一细胞”的一个实例。
(b)的调节剂可为TREM-1配体或激活的嗜中性粒细胞。(c)的“TREM-1抗体”可为TREM-1特异性杂交瘤上清液或纯化的抗体。在(d)中测量的活性是由报道构建体产生的信号。这种信号转导的实例是由NFAT驱动的LacZ (β-内酰胺酶萤光素酶)产生引起的发光。
可调整方法以鉴定阻断性TREM-1抗体。鉴定阻断性TREM-1抗体的方法包括(a)培养表达TREM-1、信号转导蛋白和报道构建体的第一细胞；(b)在将所述细胞与激活的嗜中性粒细胞一起温育时测量第一细胞的活性；(c)使第一细胞和激活的嗜中性粒细胞的共培养物与TREM-1抗体接触；和(d)测得第一细胞的活性小于(b)中测量的活性。
还可调整方法以鉴定刺激性TREM-1抗体。鉴定刺激性TREM-1抗体的方法包括(a)培养表达TREM-1、信号转导蛋白和报道构建体的第一细胞；(b)测量第一细胞的活性；(c)使所述细胞与TREM-1抗体接触/温育；和(d)测得第一细胞的活性大于(b)中测量的活性。
本发明涉及可通过本文公开的鉴定阻断抗体的方法鉴定的阻断性TREM-1抗体。当用上文和实施例中描述的方法测试时，本发明的抗体能够以小于100 μg/ml的浓度(例如小于90 μg/ml、例如小于80 μg/ml、例如小于70 μg/ml、例如小于60 μg/ml、例如小于50 μg/ml、例如小于40 μg/ml、例如小于30 μg/ml、例如小于20 μg/ml、例如小于10 μg/ml、例如小于5 μg/ml、例如小于1 μg/ml)降低所述第一细胞的活性达50%、例如60%、例如70%、例如80%、例如90%、例如95%、例如100%。本发明的抗体能够完全消除第一细胞的活性。当用上文和实施例中描述的方法测试时，本发明的抗体能够以小于1 μg/ml的浓度(例如小于0.9 μg/ml、例如小于0.8 μg/ml、例如小于0.7 μg/ml、例如小于0.6 μg/ml、例如小于0.5 μg/ml、例如小于0.4 μg/ml、例如小于0.3 μg/ml、例如小于0.2 μg/ml)消除第一细胞的活性。
本发明还涉及可通过非本文公开方法的其它方法鉴定的阻断性TREM-1抗体。
术语“抗体”在本文是指来源于种系免疫球蛋白序列的蛋白质，其能够与抗原(TREM-1)或其部分特异性地结合。该术语包括任何类别或同种型(即IgA、IgE、IgG、IgM和/或IgY)的全长抗体及其任何单链或片段。与抗原或其部分特异性结合的抗体可排他性地与该抗原或其部分结合，或可与数量有限的同源抗原或其部分结合。全长抗体通常包含至少4条多肽链：通过二硫键互相连接的2条重(H)链和2条轻(L)链。特殊药用价值的一个免疫球蛋白亚类是IgG家族。在人中，根据其重链恒定区的序列，可将IgG类别再分为4个亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。根据其序列组成的差异，可将轻链分成两个类型κ和λ。IgG分子由2条重链(通过两个或更多个二硫键互连)和2条轻链组成(每条轻链通过二硫键与重链连接)。重链可包含重链可变区(VH)和至多3个重链恒定(CH)区：CH1、CH2和CH3。轻链可包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。可将VH和VL区进一步细分成超变区，称为互补决定区(CDR)，中间散布有更保守的区，称为构架区(FR)。VH和VL区通常由3个CDR和4个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的超变区形成能够与抗原相互作用的[结合]结构域，同时抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子结合，所述宿主组织或因子包括但不限于免疫系统的各种细胞(效应细胞)、Fc受体和经典补体系统的第一组分(Clq)。
本发明的抗体可以是分离的。术语“分离的抗体”是指与其所产生的环境中的其它组分分离和/或从中回收和/或从其所产生的环境中存在的组分的混合物中纯化的抗体。
抗体的某些抗原结合片段在本发明的情况下可能是合适的，因为已表明抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段进行。术语抗体的“抗原结合片段”是指保持与本文所述抗原(例如TREM-1)特异性结合的能力的抗体的一个或多个片段。抗原结合片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、F(ab)S、Fv (通常抗体单臂的VL和VH结构域)、单链Fv (scFv；参见例如Bird等，Science 1988；242:42S-426；以及Huston等，PNAS 1988；85:5879-5883)、dsFv、Fd (通常VH和CHI结构域)和dAb (通常VH结构域)片段；VH、VL、VhH和V-NAR结构域；包含单一VH和单一VL链的一价分子；微型抗体(minibody)、双抗体(diabody)、三抗体、四抗体和κ体(kappa bodies) (参见例如Ill等，Protein Eng 1997;10:949-57)；骆驼IgG；IgNAR；以及一种或多种分离的CDR或功能性抗原互补位，其中分离的CDR或抗原结合残基或多肽可缔合或连接在一起以形成功能性抗体片段。抗体片段的各种类型已描述或综述于例如Holliger和Hudson，Nat Biotechnol 2005;2S:1126-1136；WO2005040219和已公开的美国专利申请20050238646和20020161201。这些抗体片段可采用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且可以与完整抗体相同方式针对效用来筛选片段。
本发明的抗体可为人抗体或人源化抗体。本文所用术语“人抗体”意指包括具有其中至少一部分的构架区和/或至少一部分的CDR区来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。(例如，人抗体可具有其中构架区和CDR区两者来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区)。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也来源于人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包括非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点专一诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。
这种人抗体可为人单克隆抗体。这种人单克隆抗体可通过包括获自转基因非人动物(例如转基因小鼠)的B细胞的杂交瘤产生，所述动物具有包含与永生化细胞融合的人重链转基因和轻链转基因的基因组。
人抗体可自建立在人种系序列选择基础上的序列文库分离，以天然和合成序列多样性使之进一步多样化。
可通过人淋巴细胞的体外免疫，然后将淋巴细胞用埃巴病毒(Epstein-Barr virus)转化来制备人抗体。
术语“人抗体衍生物”是指人抗体的任何修饰形式，例如抗体和另一种作用剂或抗体的缀合物。
本文所用术语“人源化抗体”是指含有来源于非人免疫球蛋白的一个或多个序列(CDR区或其部分)的人/非人嵌合抗体。因此，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中至少来自受体超变区的残基被来自非人物种(例如来自小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的抗体(供体抗体)超变区(具有所需的特异性、亲和力、序列组成和功能性)的残基置换。在一些实例中，人免疫球蛋白的FR残基被相应的非人残基置换。这类修饰的一个实例是引入一个或多个所谓的回复突变(back-mutation)，其通常是来源于供体抗体的氨基酸残基。抗体的人源化可采用本领域技术人员已知的重组技术进行(参见例如Antibody Engineering, Methods in Molecular Biology, 第248卷, Benny K. C. Lo主编)。轻链和重链可变结构域两者的合适的人受体构架可通过例如序列或结构同源性鉴定。或者可根据例如结构、生物物理和生物化学性质的知识使用固定的受体构架。受体构架可以是种系来源的或来源于成熟抗体序列。来自供体抗体的CDR区可通过CDR移植转移。可通过鉴定其中来自供体抗体的氨基酸残基的重新引入(回复突变)对人源化抗体的性质具有有益作用的关键构架位置，针对例如亲和力、功能性和生物物理性质进一步优化CDR移植的人源化抗体。除供体抗体来源的回复突变以外，可通过在CDR或构架区中引入种系残基、消除免疫原性表位、位点定向诱变、亲和力成熟等，对人源化抗体进行工程改造。
此外，人源化抗体可包含不存在于受体抗体或供体抗体中的残基。进行这些修饰以进一步精修抗体性能。一般来说，人源化抗体可包含至少一个(通常2个)可变结构域，其中所有或基本所有的CDR区相当于非人免疫球蛋白的CDR区，且其中所有或基本所有的FR残基是人免疫球蛋白序列的FR残基。人源化抗体还可任选包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc) (通常人免疫球蛋白的恒定区)。
术语“人源化抗体衍生物”是指人源化抗体的任何修饰形式，例如抗体和另一种作用剂或抗体的缀合物。
本文所用术语“嵌合抗体”是指其轻链和重链基因通常通过遗传工程自来源于不同物种的免疫球蛋白可变区和恒定区基因构建的抗体。例如，来自小鼠单克隆抗体基因的可变区段可与人恒定区段连接。
抗体的片段可结晶区(“Fc区”/”Fc结构域”)是包含恒定CH2和CH3结构域的抗体的N端区。Fc结构域可与称为Fc受体的细胞表面受体以及补体系统的一些蛋白质相互作用。Fc区使得抗体能够与免疫系统相互作用。本发明的一个方面，抗体可被工程改造以包括Fc区内的修饰，通常改变其功能性质的一个或多个，尤其例如血清半衰期、补体结合、Fc-受体结合、蛋白质稳定性和/或依赖抗原的细胞毒性或其缺乏。此外，本发明的抗体可经化学修饰(例如一个或多个化学部分可与抗体连接)或被修饰以改变其糖基化，再次改变抗体的一个或多个功能性质。IgG1抗体可携带修饰的Fc结构域，其包含一个或多个、或许所有下列突变：分别将导致对某些Fc受体的亲和力降低(L234A、L235E和G237A)和C1q介导的补体结合减少(A330S和P331S) (残基编号按照EU指数)。
本发明抗体的同种型可为IgG，例如IgG1，例如IgG2，例如IgG4。如有需要，抗体的类别可通过已知技术“转换”。例如，最初作为IgM分子产生的抗体可被类别转换成IgG抗体。类别转换技术还可用来将一种IgG亚类转化成另一种亚类，例如由IgG1转化成IgG2或IgG4；由IgG2转经成IgG1或IgG4；或由IgG4转化成IgG1或IgG2。还可通过来源不同IgG亚类区域的组合，对抗体进行工程改造以产生恒定区嵌合分子。
在一个实施方案中，CH1的铰链区被修饰使得铰链区的半胱氨酸残基的数目发生改变，例如增加或减少。这种方法进一步描述于例如Bodmer等人的美国专利号5,677,425。
恒定区可被修饰以稳定抗体，例如从而降低二价抗体分离成两个一价VH-VL片段的风险。例如，在lgG4恒定区中，残基S228 (残基编号按照EU指数)可突变成脯氨酸(P)残基以稳定铰链处的重链间二硫桥形成(参见例如Angal等，Mol Immunol. 1995; 30: 105-8)。
抗体或其片段也可根据其互补决定区(CDR)定义。当在本文使用时，术语“互补决定区”或“超变区”是指其中参与抗原结合的氨基酸残基所处的抗体区域。超变区或CDR可鉴定为在抗体可变结构域的氨基酸比对中具有最高可变性的区域。数据库可用于CDR鉴定，例如Kabat数据库，例如CDR定义为包含轻链可变结构域的氨基酸残基24-34 (L1)、50-56 (L2)和89-97 (L3)和重链可变结构域的31-35 (H1)、50-65 (H2)和95-102 (H3)；(Kabat等(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH公布号91-3242)。或者CDR可定义为来自“超变环”的那些残基(轻链可变结构域的残基26-33 (L1)、50-52 (L2)和91-96 (L3)和重链可变结构域的26-32 (H1)、53-55 (H2)和96-101 (H3)；Chothia和Lesk, J. Mol. Biol 1987; 196: 901-917)。通常，该区氨基酸残基的编号通过Kabat等人(同上)描述的方法进行。短语例如“Kabat位置”、“Kabat残基”和“按照Kabat”在本文是指重链可变结构域或轻链可变结构域的这种编号系统。采用Kabat编号系统，肽的实际的线性氨基酸序列可含有较少的或其它的氨基酸，相当于可变结构域的构架(FR)或CDR的缩短或插入。例如，重链可变结构域可包括CDR H2残基52后的氨基酸插入(残基52a、52b和52c，按照Kabat)和重链FR残基82之后插入的残基(例如残基82a、82b和82c等，按照Kabat)。可通过在抗体序列同源性区域与“标准” Kabat编号序列的比对，来确定指定抗体残基的Kabat编号。
术语“构架区”或“FR”残基是指不在本文定义的CDR内的VH或VL氨基酸残基。
m14F69抗体具有SEQ ID NO: 2所示的可变重链序列和SEQ ID NO: 3所示的可变轻链序列。本发明的抗体可包含这个可变重链序列和/或这个可变轻链序列。m14F69抗体具有SEQ ID NO: 2的氨基酸31-35、50-68和101-110和SEQ ID NO: 3的氨基酸24-38、54-60和93-101中所示的CDR序列。本发明的抗体可包含这些CDR序列的1、2、3、4、5个或所有6个。本发明的抗体可包含SEQ ID NO: 2的氨基酸101-110。
本发明抗体的重链可包含SEQ ID NO: 2的氨基酸31-35 (TYAMH)的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可被不同的氨基酸取代。
本发明抗体的重链可包含SEQ ID NO: 2的氨基酸50-68 (RIRTKSSNYATYYADSVKD)的CDR2序列，其中这些氨基酸的1、2或3个可被不同的氨基酸取代。
本发明抗体的重链可包含SEQ ID NO: 2的氨基酸101-110 (DMGQRRQFAY)的CDR3序列，其中这些氨基酸的1、2或3个可被不同的氨基酸取代。
本发明抗体的轻链可包含SEQ ID NO: 3的氨基酸24-38 (RASESVDTFDYSFLH)的CDR1序列，其中这些氨基酸的1、2或3个可被不同的氨基酸取代。
本发明抗体的轻链可包含SEQ ID NO: 3的氨基酸54-60 (RASNLES)的CDR2序列，其中这些氨基酸的1或2个可被不同的氨基酸取代。
本发明抗体的轻链可包含SEQ ID NO: 3的氨基酸93-101 (QQSNEDPYT)的CDR3序列，其中这些氨基酸的1或2个可被不同的氨基酸取代。
mAb 0170抗体具有SEQ ID NO: 4所示重链序列和SEQ ID NO: 5所示轻链序列。本发明的抗体可包含这个重链序列和/或这个轻链序列。mAb 0170抗体具有SEQ ID NO: 4的氨基酸31-35、50-68和101-110和SEQ ID NO: 5的氨基酸24-38、54-60和93-101所示的CDR序列。本发明的抗体可包含这些CDR序列的1、2、3、4、5个或所有6个。
mAb 0122抗体具有SEQ ID NO: 6所示重链序列和SEQ ID NO: 7所示轻链序列。本发明的抗体可包含这个重链序列和/或这个轻链序列。mAb 0122抗体具有SEQ ID NO: 6的氨基酸31-35、50-68和101-110和SEQ ID NO: 7的氨基酸24-38、54-60和93-101所示的CDR序列。本发明的抗体可包含这些CDR序列的1、2、3、4、5个或所有6个。
本发明抗体的重链可包含SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 6的氨基酸31-35 (TYAMH)的CDRH1序列，其中这些氨基酸之一可被不同的氨基酸残基取代。
本发明抗体的重链可包含SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 6的氨基酸50-68 (RIRTKSSNYATYYAASVKG)的CDRH2序列，其中这些氨基酸的1、2或3个可被不同的氨基酸取代。
本发明抗体的重链可包含SEQ ID NO: 4的氨基酸101-110 (DMGIRRQFAY)的CDRH3序列，其中这些氨基酸的1、2或3个可被不同的氨基酸取代。
本发明抗体的重链可包含SEQ ID NO: 6的氨基酸101-110 (DMGQRRQFAY)的CDRH3序列，其中这些氨基酸的1、2或3个可被不同的氨基酸取代。
本发明抗体的轻链可包含SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7的氨基酸24-38 (RASESVDTFDYSFLH)的CDRL1序列，其中这些氨基酸的1、2或3个可被不同的氨基酸取代。
本发明抗体的轻链可包含SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7的氨基酸54-60 (RASNLES)的CDRL2序列，其中这些氨基酸的1或2个可被不同的氨基酸取代。
本发明抗体的轻链可包含SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7的氨基酸93-101 (QQSNEDPYT)的CDRL3序列，其中这些氨基酸的1或2个可被不同的氨基酸取代。
m14F128抗体具有SEQ ID NO: 8所示重链和SEQ ID NO: 9所示轻链。本发明的抗体可包含这个可变重链序列和/或这个可变轻链序列。m14F128抗体具有SEQ ID NO: 8的氨基酸31-35、50-68和101-110和SEQ ID NO: 9的氨基酸24-38、54-60和93-101所示CDR序列。本发明的抗体可包含这些CDR序列的1、2、3、4、5个或所有6个。
m14F113抗体具有SEQ ID NO: 10所示重链和SEQ ID NO: 11所示轻链。本发明的抗体可包含这个可变重链序列和/或这个可变轻链序列。m14F113抗体具有SEQ ID NO: 10的氨基酸31-35、50-68和101-110和SEQ ID NO: 11的氨基酸24-38、54-60和93-101所示的CDR序列。本发明的抗体可包含这些CDR序列的1、2、3、4、5个或所有6个。本发明的抗体可包含SEQ ID NO: 10的氨基酸101-110。
术语“抗原” (Ag)是指用于免疫有免疫活性的脊椎动物以产生识别Ag的抗体(Ab)的分子实体。在本文中，Ag的范围更宽泛，一般意指包括被Ab特异性识别的靶分子，因此包括用于免疫方法或用于产生Ab的其它方法(例如噬菌体展示)的分子的片段或模拟物。
在“抗原结合多肽” (例如抗体(Ab))与其相应抗原(Ag)间的分子相互作用的情况下定义本文所用术语“表位”。“表位”一般是指Ab与之特异性地结合的Ag的区域或区，即与Ab物理接触的区域或区。物理接触可通过Ab和Ag分子中原子的各种标准(例如2-6?、例如3?、例如4?、例如5?的距离截止值；或溶剂可及性)定义。蛋白质表位可包含直接参与结合Ab的Ag的氨基酸残基(亦称表位的免疫显性组分)和不直接参与结合的其它氨基酸残基，例如被Ab有效阻断的Ag的氨基酸残基，即Ab的“溶剂排斥表面(solvent-excluded surface)”和/或“足迹(footprint)”内的氨基酸残基。
本文的术语表位包括与TREM-1抗体特异性地结合的TREM-1的任何特定区的两种类型的结合区。TREM-1可包含许多不同的表位，它可包括而不限于构象表位(由彼此接近位于成熟TREM-1构象的一个或多个非连续氨基酸组成)和翻译后表位(其全部或部分由与TREM-1共价连接的分子结构例如糖基组成)。
可采用各种实验和计算表位作图方法，以不同的细节层次描述和表征给定抗体(Ab)/抗原(Ag)对的表位。实验方法包括诱变、X射线晶体学、核磁共振(NMR)波谱学、氢氘交换质谱法(Hydrogen deuterium eXchange Mass Spectrometry，HX-MS)和各种竞争结合方法、本领域已知的方法。由于每种方法依赖于独特的原理，因此表位的描述与测定表位的方法密切相关。因此，根据所采用的表位作图方法，可对给定Ab/Ag对的表位进行不同的描述。
在其最详细的层次上，可通过界定存在于Ag-Ab相互作用中的原子接触的空间座标以及有关它们对结合热力学的相对贡献的信息，来描述Ag和Ab之间相互作用的表位。在不太详细的层次上，表位可通过界定Ag和Ab之间原子接触的空间座标来表征。在甚至更不详细的层次上，表位可通过它包括的如通过特定标准界定的氨基酸残基来表征，所述标准例如Ab:Ag复合物中原子的距离或溶剂可及性。在更少细节的层次上，表位可通过功能(例如通过与其它Ab的竞争结合)来表征。表位还可以更普通地定义为包含其被另一个氨基酸取代时将改变Ab和Ag间相互作用特性的氨基酸残基。
在通过Ab (例如Fab片段)和其Ag间的复合物的空间座标界定的来源于X射线的晶体结构的情况下，除非另有说明或与上下文抵触，否则术语表位在本文明确定义为其特征在于距Ab重原子的距离例如4?内具有重原子(即非氢原子)的TREM-1残基。
根据在不同细节层次上获得的表位的描述和定义(取决于所采用的表位作图方法)的事实，因此断定在相同Ag上不同Ab的表位的比较可在不同的细节层次上类似地进行。
如果表位含有相同的一组氨基酸残基，则氨基酸水平上描述的表位(例如通过X射线结构测定)被称为相同的。如果至少一个氨基酸被表位共有，则表位被称为重叠。如果无氨基酸残基被表位共有，则表位被称为单独的(独特的)。
还可通过将抗体对野生型人TREM-1的结合动力学与抗体对在预计表位上具有丙氨酸突变的人TREM-1变体的结合动力学进行比较，来间接定义表位。抗体对其中氨基酸残基被丙氨酸残基置换的人TREM-1的变体的亲和力降低或结合消除表明突变的氨基酸有助于所述抗体和野生型人TREM-1间的相互作用。该方法提供负的表位鉴定。由于蛋白质错折叠或解折叠会给出与相互作用消除类似的结果的事实，有损该方法界定表位的有效性。如果交叉反应性抗体存在，则通过直系同源靶蛋白(例如食蟹猴TREM-1)的功能突变分析的比较获益来补充分析。比较将界定不与例如食蟹猴TREM-1交叉反应的抗体和交叉反应性抗体间的表位差异。
还可通过测量抗体(或抗体片段)与野生型抗原(TREM-1)的变体的结合，提供表位的间接鉴定。如果抗体或其片段结合例如人但非食蟹猴TREM-1，且如果所述抗体或其片段能够结合食蟹猴TREM-1的部分人源化变体，则这种重新获得的结合表明被取代的氨基酸残基对抗体与抗原的相互作用是重要的。同样地，与人TREM-1相比与食蟹猴TREM-1具有较弱结合的抗人TREM-1抗体(或其Fab片段)对食蟹猴TREM-1的人源化变体的亲和力增加，可提供有关组成结合表位的残基特征的信息。
相同突变对任何给定交叉反应性抗体的作用使得可能区分可能的蛋白质错折叠(与两种抗体的结合消除)和人TREM-1中相互作用丧失(与抗体之一结合，与另一种抗体的结合消除)，同时明确提供有关不交叉反应的抗体和交叉反应性抗体间在氨基酸水平上的表位差异的信息。
本发明的抗体能够结合人TREM-1的变体。本发明的抗体能够结合K20A-hTREM-1-Cmyc2-His6 (SEQ ID NO: 13)，采用例如表面等离子共振测定。
本发明的抗体能够结合食蟹猴TREM-1的变体。本发明的抗体能够结合A24T/Y28F/N30S/R32Q/P70H-cTREM-1-Cmyc2-His6 (SEQ ID NO: 14)，采用例如表面等离子共振测定。本发明的抗体能够结合A24T/Y28F/N30S/R32Q/E54K-cTREM-1-Cmyc2-His6 (SEQ ID NO: 15)，采用例如表面等离子共振测定。
本发明的抗体能够特异性地结合TREM-1，其中所述抗体能够特异性地结合人TREM-1的(i)选自以下的至少一个氨基酸残基：A21、T22、K23、L24、T25、E26，和(ii)选自以下的至少一个氨基酸残基：A49、S50、S51、Q52、K53、A54、W55、Q56、I57、I58、R59、D60、G61、E62、M63、P64、K65、T66、L67、A68、C69、T70、E71、R72、P73、S74、K75、N76、S77、H78、P79、V80、Q81、V82、G83、R84、I85；和(iii)选自以下的至少一个氨基酸残基：C113、V114、I115、Y116、Q117、P118和P119。
本发明的抗体能够特异性地结合包含SEQ ID NO: 1 (人TREM-1)的氨基酸D38-F48的多肽，采用例如HX-MS测定。
本发明的抗体可具有包含以下的表位：SEQ ID NO: 1 (人TREM-1)的氨基酸残基D38、V39、K40、C41、D42、Y43、T44和L45的1、2、3、4、5、6、7个或全部和选自SEQ ID NO: 1 (人TREM-1)的E46、K47和F48的氨基酸残基的1、2个或全部，采用例如HX-MS测定。
本发明的抗体可具有包含以下的表位：选自SEQ ID NO: 1 (人TREM-1)的D42、E46、D92和H93的氨基酸残基的1、2、3个或全部，使用TREM-1的变体和表面等离子共振测定。
本发明的抗体可具有至少包含SEQ ID NO: 1 (人TREM-1)的氨基酸残基E46和/或D92的表位，使用TREM-1的变体和表面等离子共振测定。
本发明的抗体还包含选自SEQ ID NO: 1 (人TREM-1)的L31、I86和V101的氨基酸残基的1、2个或全部。
本发明的抗体能够特异性地结合包含食蟹猴TREM-1 (SEQ ID NO: 12)的氨基酸残基E19-L26或SEQ ID NO: 21的相应氨基酸的多肽，采用例如HX-MS测定。
本发明的抗体能够特异性地结合人TREM-1，其中所述抗体的表位包含选自SEQ ID NO: 1的V39、K40、C41、D42、Y43、L45、E46、K47、F48和A49的氨基酸残基的1、2、3、4、5、6、7、8、9个或全部。
本发明的抗体能够特异性地结合人TREM-1，其中所述抗体的表位包含SEQ ID NO: 1的D42。本发明的抗体能够特异性地结合人TREM-1，其中所述抗体的表位包含SEQ ID NO: 1的E46。所述抗体的表位可包含SEQ ID NO: 1的V39、C41、D42、Y43、L45。所述抗体的表位可包含SEQ ID NO: 1的E46、K47和A49。所述抗体的表位还包含SEQ ID NO: 1的F48。
术语“抗原互补位”的定义通过将含义反转而来源于“表位”的上述定义。因此，术语“抗原互补位”是指Ag与之特异性结合的Ab上的区域或区，即Ab以此与Ag物理接触。
在来源于X射线的晶体结构的情况下，由Ab (例如Fab片段)与其Ag之间的复合物的空间座标界定，除非另有说明或与上下文抵触，否则术语抗原互补位在本文明确定义为特征在于在距TREM-1中重原子4?距离内具有重原子(即非氢原子)的Ag残基。
指定抗体(Ab)/抗原(Ag)对的表位和抗原互补位可通过常规方法鉴定。例如，可通过评价抗体结合不同的片段或变体TREM-1多肽的能力，来确定表位的总体位置。还可采用常规方法，确定TREM-1内与抗体接触的特定氨基酸(表位)和抗体中与TREM-1接触的特定氨基酸(抗原互补位)。例如，可将抗体和靶分子混合，并且可使Ab:Ag复合物结晶。可测定复合物的晶体结构，并用来鉴定抗体与其靶之间相互作用的特定部位。
根据抗体同时与其共同抗原结合的能力，来表征与相同抗原结合的抗体，并可对抗体进行“竞争结合”/“框并(binning)”。在本文的情况下，术语“框并”是指将与相同抗原结合的抗体归类的方法。抗体的“框并”可在基于标准技术的测定法(例如表面等离子共振(SPR)、ELISA或流式细胞术)中以两种抗体与其共同抗原的竞争结合为基础。
抗体的“框(bin)”使用参比抗体定义。如果第二抗体不能够在与参比抗体相同的时间内与抗原结合，则第二抗体被称为属于与参比抗体相同的“框”。在这种情况下，参比抗体和第二抗体竞争性地结合抗原的相同部分，并被称作“竞争性抗体”。如果第二抗体能够在与参比抗体相同的时间内与抗原结合，则第二抗体被称为属于单独的“框”。在这种情况下，参比和第二抗体不竞争性地结合抗原的相同部分，并被称为“非竞争性抗体”。
抗体“框并”不提供有关表位的直接信息。竞争性抗体，即属于相同“框”的抗体可具有相同的表位、重叠表位或甚至单独的表位。后者是如果与其抗原表位结合的参比抗体占据了第二抗体接触其抗原表位所需空间(“位阻”)的情况。非竞争性抗体一般具有单独的表位。
本发明的抗体可与mAb 0170竞争与人TREM-1结合。本发明的抗体可与mAb 0170竞争与食蟹猴TREM-1结合。换句话说，本发明的抗体可属于与mAb 0170相同的“框”。
术语“结合亲和力”在本文是指两种分子(例如抗体或其片段和抗原)间非共价相互作用的强度的度量。术语“结合亲和力”用来描述一价相互作用(内在活性)。
可通过测定平衡解离常数(KD)，定量测定通过一价相互作用的两种分子(例如抗体或其片段和抗原)间的结合亲和力。接着可通过测量复合物形成和解离的动力学，例如通过SPR方法，测定KD。相当于一价复合物缔合和解离的速率常数分别称为缔合速率常数ka (或kon)和解离速率常数kd (或koff)。KD通过方程式KD = kd /ka与ka和kd相关。
根据上述定义，可通过各个抗体/抗原复合物的KD值的比较，来比较与不同分子相互作用有关的结合亲和力，例如不同抗体对给定抗原的结合亲和力的比较。
本发明的抗体可以1 x 10-7M或更小、1 x 10-8M或更小、或1 x 10-9M或更小、或1 x 10-10M或更小、1 x 10-11M或更小、1 x 10-12M或更小或1 x 10-13M或更小的亲和力(KD)结合人TREM-1，采用表面等离子共振测定。本发明的抗体可以1 x 10-7M或更小、1 x 10-8的M或更小、或1 x 10-9M或更小、或1 x 10-10M或更小、1 x 10-11M或更小、1 x 10-12M或更小或1 x 10-13M或更小的亲和力(KD)结合食蟹猴TREM-1，采用表面等离子共振测定。
术语“结合特异性”在本文是指分子(例如抗体或其片段)与单种唯一的抗原或与有限数目的高度同源的抗原(或表位)的相互作用。相比之下，能够特异性地结合TREM-1的抗体不能够结合不相似的分子。本发明的抗体不能够结合Nkp44。
可通过众所周知的方法，直接测定相互作用的特异性和平衡结合常数的值。评价配体(例如抗体)结合其靶的能力的标准测定法是本领域已知的，包括例如ELISA、蛋白质印迹、RIA和流式细胞术分析。抗体的结合动力学和结合亲和力还可通过本领域已知的标准测定法(例如SPR)来评价。
可进行竞争结合测定法，其中将抗体与靶的结合与所述靶被该靶的另一配体(例如另一种抗体)的结合相比较。
另一方面，本发明提供包含本发明的分子(例如本文所述TREM-1抗体、多核苷酸、载体和细胞)的组合物和制剂。例如，本发明提供包含与药学上可接受的载体配制在一起的本发明的一种或多种TREM-1抗体的药物组合物。
因此，本发明的一个目的是提供包含所述TREM-1抗体的药物制剂，所述抗体以0.25 mg/ml-250 mg/ml的浓度、例如10-200 mg/ml的浓度存在，且其中所述制剂的pH为2.0-10.0，例如pH为4.0-8.0。制剂还包含缓冲系统、防腐剂、张度剂、螯合剂、稳定剂和/或表面活性剂的一种或多种及其各种组合。药物组合物中防腐剂、等渗剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂的用途为本领域技术人员所熟知。可参照Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995。
在一个实施方案中，药物制剂为含水制剂。这类制剂通常为溶液剂或混悬剂，但也可包括胶体、分散剂、乳剂和多相材料。术语“含水制剂”定义为制剂包含至少50% w/w水。同样，术语“含水溶液剂”定义为包含至少50 % w/w水的溶液剂，术语“含水混悬剂”定义为包含至少50 % w/w水的混悬剂。
在另一个实施方案中，药物制剂是冻干制剂，医师或患者在用前向其中加入溶剂和/或稀释剂。
又一方面，药物制剂包含所述抗体的水溶液剂和缓冲剂，其中抗体以1 mg/ml或以上的浓度存在，且其中所述制剂的pH为约2.0-约10.0。
本发明的TREM-1抗体和包含所述抗体的药物组合物可用于治疗例如下列炎性疾病：炎性肠病(IBD)、克罗恩病(CD)、溃疡性结肠炎(UC)、肠易激综合征、类风湿性关节炎(RA)、银屑病、银屑病性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮肾炎、I型糖尿病、格雷夫斯病(Grave’s disease)、多发性硬化(MS)、自身免疫性心肌炎、川崎病、冠状动脉疾病、慢性阻塞性肺病、间质性肺病、自身免疫性甲状腺炎、硬皮病、全身性硬皮病、骨关节炎、特应性皮炎、白癜风、移植物抗宿主病、斯耶格伦综合征(Sjogrens’s syndrome)、自身免疫性肾炎、古德帕斯彻综合征(Goodpasture’s syndrome)、慢性炎症性脱髓鞘性多神经病、变态反应、哮喘和是急性或慢性炎症的结果的其它自身免疫病。
本发明的TREM-1抗体可适用于治疗患有炎性肠病的个体。炎性肠病(IBD)是可影响从口到肛门的胃肠道的任何部分的疾病，其引起各种不同症状。IBD主要引起腹痛、腹泻(其可以是带血的)、呕吐或体重减轻，但还可引起胃肠道以外的并发症，例如皮疹、关节炎、眼炎、疲劳和注意力缺乏。可将IBD患者分成两个主要类别，患溃疡性结肠炎(UC)的一类和患克罗恩病(CD)的一类。CD一般涉及回肠和结肠，它可影响肠的任何区域，但通常是不连续的(疾病病灶区散布在整个肠中)。UC总是涉及直肠(结肠的)，并且是更连续性的。CD中，炎症是透壁的，导致脓肿、瘘和狭窄，而在UC中，炎症通常局限于粘膜。对于克罗恩病没有已知的药物或手术治愈，而一些UC患者可通过手术切除结肠治愈。治疗选择限于控制症状，保持缓解和防止复发。可以CD的克罗恩病活性指数(CDAI)评分的降低来测量临床上炎性肠病的功效，该评分是基于实验室检验和生命质量问卷的得分量表。在动物模型中，功效通常通过体重增加以及疾病活性指数(DAI)来衡量，所述疾病活性指数是粪稠度、粪的重量和粪中的血液的组合。
本发明的TREM-1抗体可适用于治疗患有类风湿性关节炎的个体。类风湿性关节炎(RA)是影响几乎整个身体(如果不是全身的话)的全身性疾病，并且是关节炎最常见的形式之一。其特征在于关节炎症，它引起疼痛、僵硬、发热、发红和肿胀。这种炎症是炎性细胞侵入关节的结果，并且这些炎性细胞释放可消化骨和软骨的酶。因此，这种炎症可导致除其它生理作用以外的严重的骨和软骨损害及关节退化和严重疼痛。受累关节可能失去其形状和排列，导致疼痛和运动丧失。
有若干本领域已知的类风湿性关节炎动物模型。例如，在胶原诱发性关节炎(CIA)模型中，小鼠出现类似于人类风湿性关节炎的炎性关节炎。由于CIA与RA共有类似的免疫学和病理学特征，因此这使之成为筛选潜在人抗炎化合物的合适模型。在该模型中的功效通过关节肿胀减轻来衡量。临床上，在RA中的功效通过减轻患者症状的能力来衡量，所述症状作为关节肿胀、红细胞沉降率、C-反应性蛋白质水平和血清因子(例如抗瓜氨酸化蛋白抗体)水平的组合来衡量。
本发明的TREM-1抗体可适用于治疗患有银屑病的个体。银屑病是T细胞介导的炎性皮肤病症，它可引起相当的不适。它是一种目前尚无法治愈并且累及所有年龄的人的疾病。虽然患有轻度银屑病的个体常常可用局部药剂控制他们的疾病，但是全世界超过100万患者需要紫外光治疗或全身免疫抑制疗法。遗憾的是，紫外线幅射的不便和风险及许多疗法的毒性限制其长期使用。此外，患者常常具有银屑病复发，并且在一些情况下在停止免疫抑制疗法后不久便反弹。最新开发的基于CD4+ T细胞转移的银屑病模型模拟人银屑病的许多方面，因此可用于鉴定适用于银屑病治疗的化合物(Davenport等，Internat. Immunopharmacol 2:653-672, 2002)。使用评分系统，通过皮肤病理的减轻来衡量在该模型中的功效。同样，在患者中的功效通过皮肤病理减轻来衡量。
本发明的TREM-1抗体可适用于治疗银屑病性关节炎的个体。银屑病性关节炎(PA)是一种发生在患有银屑病的患者的子集中的炎症性关节炎类型。在这些患者中，皮肤病理/症状伴发类似于类风湿性关节炎中所见的关节肿胀。它的特征在于皮肤炎症的斑块状凸起的红色区域并带有鳞屑。银屑病通常累及肘和膝尖端、头皮、脐和生殖区或肛门四周。大约10%患有银屑病的患者还发生其关节的相关炎症。
本文所用术语“治疗”是指有需要的任何人或其它动物受试者的医学治疗。预期所述受试者已经历由医师或兽医医师进行的身体检查，医师已做出试验性或确定性诊断，该诊断可表明使用所述治疗有益于所述人类或其它动物受试者的健康。所述治疗的时机和目的可依据许多因素(例如受试者的健康现状)而在个体间不同。因此，所述治疗可以是预防性的、治标的、针对症状的和/或治愈性的。
就本发明而言，预防性的、治标的、针对症状的和/或治愈性的治疗可代表本发明的各个方面。
可经胃肠外(例如静脉内，例如肌内，例如皮下)给予本发明的抗体。或者，可通过非胃肠外途径(例如经口或局部)给予本发明的抗体。可预防性给予本发明的抗体。可治疗性给予(在要求时)本发明的抗体。
示例性的实施方案
1. 一种鉴定功能性TREM-1抗体的方法，所述方法包括(a)培养表达TREM-1、信号转导蛋白和报道构建体的第一细胞；(b)在将第一细胞与TREM-1调节剂一起温育时测量所述细胞的活性；(c)使(b)的培养物与TREM-1抗体接触；和(d)测得第一细胞的活性小于或大于(b)中测量的活性。
2. 一种鉴定阻断性TREM-1抗体的方法，所述方法包括(a)培养表达TREM-1、信号转导蛋白和报道构建体的第一细胞；(b)在将第一细胞与激活的嗜中性粒细胞一起温育时测量第一细胞的活性；(c)使第一细胞和激活的嗜中性粒细胞的培养物与TREM-1抗体接触；和(d)测得第一细胞的活性小于(b)中测量的活性。
3. 实施方案1-2中任一个的方法，其中(b)的调节剂是激活的嗜中性粒细胞或TREM-1配体。
4. 一种鉴定刺激性TREM-1抗体的方法，所述方法包括(a)培养表达TREM-1、信号转导蛋白和报道构建体的第一细胞；(b)测量第一细胞的活性；(c)使所述细胞与TREM-1抗体接触/温育；和(d)测得第一细胞的活性大于(b)中测量的活性。
5. 实施方案1-4中任一个的方法，其中第一细胞是造血起源的。
6. 实施方案5的方法，其中所述造血起源的细胞是髓样细胞。
7. 实施方案5的方法，其中所述造血起源的细胞是T细胞。
8. 实施方案1-7中任一个的方法，其中所述信号转导蛋白是DAP10。
9. 实施方案1-7中任一个的方法，其中所述信号转导蛋白是DAP12。
10. 实施方案1-7中任一个的方法，其中所述信号转导蛋白是TCRζ。
11. 实施方案1-7中任一个的方法，其中所述信号转导蛋白是FcγRIII。
12. 实施方案1-7中任一个的方法，其中所述信号转导蛋白是Fc受体。
13. 实施方案1-6中任一个的方法，其中所述报道构建体包含转录因子和报道基因。
14. 实施方案13的方法，其中所述转录因子是NFAT。
15. 实施方案14的方法，其中所述转录因子是NFkB。
16. 实施方案13-15中任一个的方法，其中所述报道基因编码β-半乳糖苷酶。
17. 实施方案13-15中任一个的方法，其中所述报道基因编码萤光素酶。
18. 实施方案13-15中任一个的方法，其中所述报道基因编码绿色荧光蛋白(GFP)。
19. 实施方案13-15中任一个的方法，其中所述报道基因是编码氯霉素转移酶的基因。
20. 一种鉴定阻断性TREM-1抗体的方法，所述方法包括(a)培养表达TREM-1、DAP12和编码萤光素酶的基因的T细胞；(b)在将所述T-细胞与激活的嗜中性粒细胞一起时温育测量T细胞的发光；(c)使(b)的共培养物与TREM-1抗体接触；和(d)测得T细胞的发光小于(b)中测量的活性。
21. 实施方案7的方法，其中所述细胞是BWZ.36/hTREM-1:DAP12:NFAT-LacZ T细胞系。
22. 通过实施方案1-3和5-21中任一个的方法鉴定的抗体。
23. 一种能够特异性地结合TREM-1并能够阻断TREM-1功能的抗体。
24. 实施方案22-23中任一个的抗体，其中所述抗体能够防止或减少TREM-1的二聚化/多聚化。
25. 实施方案22-24中任一个的抗体，其中所述抗体能够阻断TREM-1与其配体间的相互作用。
26. 实施方案22-25中任一个的抗体，其中所述抗体能够阻断PGLYRP1诱导的TREM-1功能。
27. 实施方案22-26中任一个的抗体，其中所述TREM-1是人TREM-1。
28. 实施方案27的抗体，其中所述抗体还能够特异性地结合并阻断来自另一非人物种的TREM-1的功能。
29. 实施方案28的抗体，其中所述来自另一物种的TREM-1是食蟹猴TREM-1。
30. 实施方案28的抗体，其中所述来自另一物种的TREM-1是恒河猴TREM-1。
31. 实施方案22-30中任一个的抗体，其能够特异性地结合K20A-hTREM-1-Cmyc2-His6 (SEQ ID NO: 13)。
32. 实施方案22-31中任一个的抗体，其能够特异性地结合A24T/Y28F/N30S/R32Q/P70H-cTREM-1-Cmyc2-His6 (SEQ ID NO: 14)。
33. 实施方案22-32中任一个的抗体，其能够特异性地结合A24T/Y28F/N30S/R32Q/E54K-cTREM-1-Cmyc2-His6 (SEQ ID NO: 15)。
34. 实施方案22-33中任一个的抗体，其与mAb 0170竞争以结合人TREM-1。
35. 实施方案22-34中任一个的抗体，其与mAb 0170竞争以结合食蟹猴TREM-1。
36. 实施方案22-35中任一个的抗体，其能够特异性地结合包含SEQ ID NO: 1 (人TREM-1)的氨基酸D38-F48的多肽，采用例如HX-MS测定。
37. 实施方案22-36中任一个的抗体，其具有包含选自SEQ ID NO: 1 (人TREM-1)的D38、V39、K40、C41、D42、Y43、T44和L45的1、2、3、4、5、6、7个或全部氨基酸残基和选自SEQ ID NO: 1 (人TREM-1)的E46、K47和F48的1、2个或全部氨基酸残基的表位，采用例如HX-MS测定。
38. 实施方案22-37中任一个的抗体，其能够特异性地结合包含食蟹猴TREM-1的氨基酸残基E38-L45的多肽，采用例如HX-MS测定。
39. 实施方案22-38中任一个的抗体，其具有至少包含选自SEQ ID NO: 1 (人TREM-1)的D42、E46、D92和H93的氨基酸残基的表位，采用表面等离子共振测定。
40. 实施方案22-39中任一个的抗体，其具有至少包含SEQ ID NO: 1 (人TREM-1)的氨基酸残基E46和/或D92的表位，采用表面等离子共振测定。
41. 实施方案22-40中任一个的抗体，其中所述抗体能够特异性地结合人TREM-1的(i)选自以下的至少一个氨基酸残基：A21、T22、K23、L24、T25、E26；和(ii)选自以下的至少一个氨基酸残基：A49、S50、S51、Q52、K53、A54、W55、Q56、I57、I58、R59、D60、G61、E62、M63、P64、K65、T66、L67、A68、C69、T70、E71、R72、P73、S74、K75、N76、S77、H78、P79、V80、Q81、V82、G83、R84、I85；和(iii)选自以下的至少一个氨基酸残基：C113、V114、I115、Y116、Q117、P118和P119。
42. 实施方案22-40中任一个的抗体，其中所述抗体能够特异性地结合(i)选自以下的至少一个氨基酸残基：V39、K40、C41、D42、Y43、T44、L45、E46、K47、F48、A49、S50、S51、Q52、K53、A54、W55、Q56；和(ii)选自以下的至少一个氨基酸残基：T70、E71、R72、P73、S74、K75、N76、S77、H78、P79、V80、Q81、V82、G83、R84、I85；和(iii)选自以下的至少一个氨基酸残基：C113、V114、I115、Y116、Q117、P118、P119。
43. 实施方案22-42中任一个的抗体，其重链包含相当于SEQ ID NO: 4的氨基酸残基101-110 (DMGIRRQFAY)的CDRH3序列，其中所述氨基酸残基的1、2或3个可被不同的氨基酸取代。
44. 实施方案22-42中任一个的抗体，其重链包含相当于SEQ ID NO: 6的氨基酸残基101-110 (DMGQRRQFAY)的CDRH3序列，其中1、2或3个氨基酸残基可被不同的氨基酸取代。
45. 实施方案43-44中任一个的抗体，其还包含相当于SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 6的氨基酸残基31-35 (TYAMH)的CDRH1序列，其中这些氨基酸残基之一可被不同的氨基酸残基取代；和/或相当于SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 6的氨基酸50-68 (RIRTKSSNYATYYAASVKG)的CDRH2序列，其中所述氨基酸的1、2或3个可被不同的氨基酸残基取代。
46. 实施方案43-45中任一个的抗体，其轻链包含：相当于SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7的氨基酸残基24-38 (RASESVDTFDYSFLH)的CDRL1序列，其中这些氨基酸的1、2或3个残基可被不同的氨基酸取代；和/或相当于SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7的氨基酸残基54-60 (RASNLES)的CDRL2序列，其中这些氨基酸的1或2个残基可被不同的氨基酸取代；和/或相当于SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7的氨基酸残基93-101 (QQSNEDPYT)的CDRL3序列，其中这些氨基酸的1或2个残基可被不同的氨基酸取代。
47. 实施方案43-46中任一个的抗体，其包含SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 6和/或SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7。
48. 实施方案22-47中任一个的抗体，其以1 x 10-7M或更小、1 x 10-8M或更小、或1 x 10-9M或更小、或1 x 10-10M或更小、1 x 10-11M或更小、1 x 10-12M或更小或1 x 10-13M或更小的结合亲和力(KD)结合人TREM-1，采用表面等离子共振测定。
49. 实施方案48的抗体，其中所述结合亲和力(KD)为1 x 10-10M或更小。
50. 实施方案22-49中任一个的抗体，其以1 x 10-7M或更小、1 x 10-8M或更小、或1 x 10-9M或更小、或1 x 10-10M或更小、1 x 10-11M或更小、1 x 10-12M或更小或1 x 10-13M或更小的结合亲和力(KD)结合食蟹猴TREM-1，采用表面等离子共振测定。
51. 实施方案50的抗体，其中所述结合亲和力为1 x 10-9M或更小。
52. 实施方案22-51中任一个的抗体，其是IgG。
53. 用作药物的实施方案22-52中任一个的抗体。
54. 用于治疗自身免疫病和/或慢性炎症的实施方案22-53中任一个的抗体。
55. 用于制备治疗自身免疫病和/或慢性炎症的药物的实施方案22-52中任一个的抗体。
56. 一种治疗自身免疫病和/或慢性炎症的方法，所述方法包括将实施方案22-52中任一个的抗体给予有需要的受试者。
57. 实施方案53-55中任一个的用途或实施方案56的方法，其中所述自身免疫病是类风湿性关节炎。
58. 实施方案53-55中任一个的用途或实施方案56的方法，其中所述自身免疫病是克罗恩病。
59. 实施方案53-55中任一个的用途或实施方案56的方法，其中所述自身免疫病是溃疡性结肠炎。
60. 实施方案53-55中任一个的用途或实施方案56的方法，其中所述自身免疫病是银屑病性关节炎。
通过下列实施例进一步说明本发明，所述实施例不应解释为进一步限制。本说明书全文中引用的所有附图和所有参考文献、专利和已公开的专利申请的内容均通过引用明确结合到本文中。
实施例
实施例1：BWZ.36人TREM-1:DAP12稳定细胞系的产生
BWZ.36/hTREM-1:DAP12:NFAT-LacZ细胞系(本文亦称为“BWZ/hTREM-1报道细胞”)来源于BW5147 T细胞(小鼠(Mus musculus)胸腺淋巴瘤细胞系，ATCC TIB-47，LGC Standards，Middelsex，UK)，并含有受4拷贝NFAT启动子元件调节的LacZ报道构建体(参见Karttunen, J.和Shastri, N. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3972-3976及Fiering, S., Northrop, J. P., Nolan, G. P., Matilla, P., Crabtree, G. R.和Herzenberg, L. A. (1990) Genes Dev. 4, 1823-1834)。使用Superfect转染试剂(目录号301305，Qiagen Nordic，Denmark)，将使用TREM-1 cDNA (Gene Bank Ref. ID: NM_018643.2, Sino Biological Inc., Beijing, China)作为模板和寡聚5’ TAGTAGGGATCCGCTGGTGCACAGGAAGG (SEQ ID NO: 16)和5’ TAGTAGGCGGCCGCTTCGTGGGCCTAGGGTAC (SEQ ID NO: 17)作为引物克隆至pIREShyg载体GenBank登录号U89672 (目录号6061-1，Clontech Laboratories，CA，USA)的TREM/DAP12/pMX-IRES载体(自SmaI位点至BamHI位点编码786 bp TREM-1)转染到PLAT-E包装细胞系(由W. Yokoyama, Washington University提供；或者，目录号RV-101，RV-101, Cell Biolabs Inc, Bio-Mediator KY, Vantaa, Finland)。如下使用含有TREM/DAP12/pMX-IRES病毒颗粒的PLAT-E上清液来感染BWZ.36细胞：将2x105个BWZ.36细胞在6孔板中培养，更换培养基为1.5 ml含有病毒颗粒+ 8 mg/ml聚凝胺(polybrene)的上清液。6-8小时后，将1.5 ml正常培养基加到板中，使细胞再温育24小时。将稳定表达TREM-1的BWZ.36细胞系用抗TREM-1单克隆抗体(克隆21C7)染色，并通过细胞分选来分离。
实施例2：BWZ.36人TREM-1:DAP12稳定细胞系的培养
将BWZ/hTREM-1报道细胞在补充了10% FCS (目录号16140-071，Gibco，New York，USA)、1%青霉素/链霉素(目录号15070-06，Gibco)、1 mM丙酮酸钠(目录号11360，Gibco)、5 μM -2ME (目录号31350-010，Gibco)和2 mM L-谷氨酰胺(目录号25030，Gibco)的无酚红RPMI 1640 (目录号11835，Gibco，Carlsbad CA，USA)中培养。不需要特殊的板或包被。加入10 ml Versene (目录号15040，Gibco)以剥离细胞，然后将细胞转移到管中，1200 rpm离心5分钟，并在新的无酚红RPMI 1640中洗涤。然后这些细胞准备就绪用于测定或再培养以进一步增殖。
实施例3：小鼠的免疫和mAb的鉴定
为了产生结合人TREM-1的抗体，用人(h) TREM-1 (SEQ ID NO:1)、表达hTREM-1的细胞(BWZ.36细胞)或两者的组合给野生型Balb/C小鼠和TREM-1敲除(KO)小鼠(C57BL/6背景)两者进行免疫。使用表达hTREM-1的BWZ.36细胞，通过对hTREM-1蛋白的直接ELISA或通过FMAT进行初步筛选。通过对表达hTREM-1的HEK293细胞的流式细胞术进行二级筛选。然后以实施例4所述BWZ/hTREM-1报道分子测定法，筛选阳性杂交瘤上清液。
从用hTREM-1蛋白以两周间隔免疫6次，接着加强注射的KO小鼠中，获得最高数目的阻断性抗体。分离出共200种以上的hTREM-1抗体，随后发现其中大约70种具有阻断作用。
在BWZ/hTREM-1报道分子测定中先作为上清液，稍后作为纯化的抗体，在从5000 ng/ml下至7 ng/ml的整个滴定中，作为可溶性抗体和作为板结合的抗体，测试了所有的TREM-1特异性杂交瘤上清液。来自各种不同供体的血液用作新鲜嗜中性粒细胞的来源。例如，图4显示来自一种融合物的抗体，其中报道分子测定中作为阻断活性的活性位于x轴，当抗体是板结合的时，激动活性位于y轴。
实施例4：作为嗜中性粒细胞表达的TREM-1配体的PGLYRP1的鉴定
通过采用与质谱法联用的免疫沉淀反应(IP-MS)，PGLYRP1被鉴定为TREM-1配体。可溶性TREM-1四聚体用作亲和力“诱饵”分子以鉴定配体。简单地说，将TREM-1-四聚体-Fc (SEQ ID NO: 2)和单独的CD83-Fc (SEQ ID NO: 5)分别以100 μg/ml的终浓度与2.70亿个人嗜中性粒细胞一起温育，在4℃下在1 mL PBS中轻轻振动90分钟，通过上述葡聚糖沉降纯化。在这些细胞沉淀后，将细胞重新悬浮于添加浓度为2 mM的交联剂3,3′-联硫基双[磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯] (DTSSP) (Thermo Scientific：21578，Rockford，IL，USA)的1 mL PBS缓冲液中，并在室温下温育30分钟。细胞用1 mL PBS洗涤3X，接着在1 mL RIPA缓冲液(Thermo Scientific，89901，Rockford，IL，USA)中裂解。在4℃下以15,000 X g将裂解液离心10分钟以除去不溶性材料。使用蛋白A Mag Sepharose?珠粒(GE Healthcare Life Sciences，28-9670-56，Piscataway，NJ，USA)，使与Fc偶联探针交联的嗜中性粒细胞蛋白质从清液中免疫沉淀。简单地说，50 μL珠粒先用200 μL PBS洗涤，然后重新悬浮于1 mL细胞裂解物中，在4℃下温育60分钟，经磁性俘获，随后用200 μl RIPA缓冲液洗涤2X，然后用200 μL PBS洗涤3X。在从最后的磁性俘获物中除去PBS后，使用200 μL含有8 M脲、100 mM Tris (pH 8.0)和15 mM TCEP (Thermo Scientific，77720，Rockford，IL，USA)的缓冲液，将蛋白质从磁珠中洗脱，在室温下温育30分钟，俘获珠粒，将上清液转移到Microcon Ultracel YM-30过滤器(Millipore，42410，Billerica，MA，USA)中。在14,000 x g、20℃下，将样品离心30-60分钟，直到滤膜顶部不留下液体。保留的蛋白质然后在室温避光下用100 μL 50mM IAA (碘乙酰胺)/8 M脲烷基化30分钟。过滤器用100 μL 50mM NH4HCO3洗涤2X，然后转移到新的收集管中。加入含1 μg胰蛋白酶(Promega，V5111，Madison，WI)的60 μL 50 mM NH4HCO3，接着在37℃下温育过夜。通过以14,000 xg离心30分钟，接着用50 μL 50 mM NH4HCO3洗涤过滤器，来收集胰蛋白酶消化物。使用LTQ-Orbitrap-XL质谱仪(Thermo Scientific，Waltham，MA，USA)，通过LC/MS/MS对10 μL消化物进行分析。使用SEQUEST-Sorcerer引擎(4.0.4 build) (SageN，Milpitas，CA，USA)，针对IPI人数据库(v3.81)搜索数据，然后用Scaffold 3 (Proteome Software，Portland，OR，USA)后处理以过滤蛋白质ID，其假发现率为1%。在减去阴性对照后，发现PGLYRP1是与hTREM-1四聚体特异性缔合的高置信度蛋白质。嗜中性粒细胞的免疫沉淀反应显示，148种经鉴定的蛋白质中，72种蛋白质通过仅对照构建体(CD83)免疫沉淀，对于TREM-1和CD83，73种蛋白质是相同的，而仅有3种是TREM-1特异性的(图3)。随后使用来自不同供体的嗜中性粒细胞重复实验，PGLYRP1再次被鉴定为与hTREM-1特异性相互作用。
实施例5：自大肠杆菌表达的人PGLYRP1的再折叠和纯化
人PGLYRP1在大肠杆菌BL21 (DE3)细胞中作为包涵体表达。细菌通过离心收获，重新悬浮于50mM Tris-HCl pH8.0、500 mM NaCl、5 mM EDTA、0.5% Triton X-100中，并通过超声处理破坏。不溶性沉淀用50 mM Tris (pH 8.0)、1% TritonX-100、2 M脲洗涤3次，用50 mM Tris pH 8.0洗涤1次，然后溶于50 mM Tris-HCl、6M盐酸胍(pH7.4)、1 mM DTT (最终的蛋白质浓度20mg/ml)。对于体外折叠，将溶解的人PGLYRP1包涵体稀释入50 mM Tris (pH 8.0)、2mM EDTA、5 mM半胱胺、0.5 mM胱胺、0.4 M精氨酸(最终的蛋白质浓度1mg/ml)。在4℃下过夜后，折叠的混合物通过离心/过滤澄清，然后12倍稀释于10mM MES pH 3.5以降低电导率和pH (最终的pH约5.8，电导率约6mS/cm)。然后将稀释的折叠混合物施加到Hitrap SP HP 5ml柱(17-1151-01 GE Healthcare，Uppsala，Sweden)上，接着用50 mM MES pH 5.8的5柱体积洗涤。结合的人PGLYRP1然后用50 mM MES pH 5.8、1 M NaCl以20柱体积的0~60%线性梯度洗脱。合并含有再折叠的人PGLYRP1的流分，通过Amicon ultra 15离心单位((UFC800324 3，000 kDa MWCO，Millipore，Hellerup，Denmark)浓缩至小于4ml。然后使用Hiload 26/60 Superdex 75 318ml柱((17-1070-01 GE Healthcare，Uppsala，Sweden)再纯化(polish)，并且将蛋白质进行缓冲液交换至磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。大多数再折叠的人PGLYRP1蛋白质呈单体形式。在浓缩后，通过用NANODROP UV分光计测量280 nm吸光度，测定最终的蛋白质浓度。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)评价蛋白质纯度。
实施例6：TREM-1反应性报道分子测定法的创建
通过用NFAT-LacZ报道构建体以及hTREM-1和DAP12转染BWZ.36细胞系，来产生TREM-1报道细胞系(如实施例所述1)。健康供体的嗜中性粒细胞通过葡聚糖沉降纯化。在50ml管中，以3份Ficoll和4份血液的比率，在FicollPaque (17-0840-03，GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)梯度上使血液分层，然后在22℃下以400xg离心30分钟，无需制动。通过抽吸轻轻取出中间的PBMC条带。吸出在密实的RBC上分层的嗜中性粒细胞，并转移到50ml聚丙烯管中。将嗜中性粒细胞和污染性RBC用1x PBS稀释至40 ml，随后加入10 ml含4%葡聚糖500 (Sigma，31392，St Louis，MO，USA)的PBS溶液。在轻轻倒置混合后，将管在22℃下静置20-30分钟。然后将富含粒细胞的上清液转移到新的管中，在250 x g、22℃下离心5分钟；吸出上清液，弃去。用渗透性溶解除去污染性RBC。简单地说，将细胞沉淀重新悬浮于7.5 ml 0.2 % NaCl中；轻轻混合55-60秒钟，加入17.5 ml 1.2 % NaCl溶液。用PBS使体积达到50 ml，以250 x g离心5分钟，将沉淀重新悬浮于7.5 ml 0.2 % NaCl中重复溶解第二次。将最终的粒细胞沉淀重新悬浮于RPMI/10% FBS中。这些嗜中性粒细胞用PGN (InVivogen，tlrl-pgnsa，SanDiego，CA，USA)刺激过夜以产生能够刺激TREM-1的激活的嗜中性粒细胞。然后以1:3报道细胞:嗜中性粒细胞的比率，将BWZ/hTREM-1报道细胞加到PGN激活的嗜中性粒细胞培养物中。可使用由PGLYRP1 (SEQ ID NO: 23)和PGN组成的TREM-1配体复合物而不是激活的嗜中性粒细胞刺激TREM-1。测定在聚-D-赖氨酸包被的黑色细胞培养板(编号356640，来自BD Biosciences，San Jose，CA，USA)中运行。在培养24小时后，使用BetaGlo试剂(E4720，来自Promega，Madison，WI，USA)读出TREM-1活化，并使用来自Perkin Elmer的TopCount发光计数器测量发光。作为阳性对照，TREM-1可被能够激动TREM-1的板结合的TREM-1抗体(R&D MAB1278，Minneapolis，MN，USA)激活。在冰箱O/N中或在37℃、5 % CO2下2小时，将板用同种型对照或TREM-1抗体MAB1278 (3 ug/ml，在PBS中，100 ul/孔)包被后，加入BWZ/hTREM-1报道细胞。在6-24小时温育后，可使用BetaGlo试剂(E4720，来自Promega，Madison，WI，USA)读出TREM-1活化，并可使用来自Perkin Elmer的TopCount 发光计数器测量发光。这种BWZ.36/hTREM-1:DAP12:NFAT-LacZ细胞系(“BWZ/hTREM-1报道细胞”)显示对抗体介导的TREM-1交联有高反应性，与同种型对照相比，当用1-10 μg/ml板结合的市售抗TREM-1抗体刺激时，得到约40倍诱导的NFAT驱动的LacZ产生(图1)。当仅用toll-样受体混合物(tlrl-kit2hm，Invivogen，Sigma-Aldrich Denmark) (BWZ+TLR)刺激时，未观察到信号增加。此外，未激活的嗜中性粒细胞不能刺激TREM-1，而TLR激动剂混合物(tlrl-kit2hm，Invivogen，Sigma-Aldrich Denmark)激活的嗜中性粒细胞可刺激BWZ/hTREM-1报道细胞。
下表1显示在这样的BWZ/hTREM-1报道细胞测定中本文公开的TREM-1抗体能够阻断配体诱导的TREM-1活化。
表1
所测试的市售抗体：MAB1278 (目录号MAB1278，R&D Systems，Minneapolis，MN 55413，USA)、抗TREM-1 HPA (目录号HPA005563，Sigma，St Louis，MO，USA)、TREM26 (目录号314902，Biolegend，San Diego，CA 92121，USA)和TREM37 (目录号316102，Biolegend，San Diego，CA 92121，USA)无一能够阻断TREM-1信号。
实施例7：使用HX-MS的表位作图
材料
所用蛋白质批次为：
hTREM-1：人重组TREM-1，非糖基化，产生于大肠杆菌。(目录号PRO-457 PRO-457, ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., Rehovot, Israel)。
表2：所使用的mAb
在实验前将所有蛋白质缓冲液交换成PBS pH 7.4。
方法：HX-MS实验
仪器和数据记录
HX实验由LeapShell软件(Leap Technologies Inc.)操作的Leap自动仪(H/D-x PAL；Leap Technologies Inc.)自动进行，其执行氘交换反应的启动、反应时间控制、猝灭反应、注入UPLC系统和消化时间控制。Leap自动仪配置了两个温控组套(temperature controlled stack)，分别保持在20℃下(用于缓冲液贮存和HX反应)和保持在2℃下(用于蛋白质和猝灭溶液的贮存)。Leap自动仪此外包含容纳前置柱和分析柱以及胃蛋白酶柱的冷却的Trio VS单元(Leap Technologies Inc.)和在1℃下的LC管和转换阀。Trio VS单元的转换阀已由HPLC升级至Microbore UHPLC转换阀(Cheminert，VICI AG)。对于联机的胃蛋白酶消化，加载含有200 pmol hTREM-1的100 μL猝灭样品，并使用200 μL/分钟(0.1%甲酸:CH3CN 95:5)的等度流速(isocratic flow rate)，流经Poroszyme?固定化胃蛋白酶柱体(2.1 × 30 mm (Applied Biosystems))。截留所得肽，在VanGuard前置柱BEH C18 1.7 μm (2.1 × 5 mm (Waters Inc.))中脱盐。随后转换阀，以使前置柱与分析柱UPLC-BEH C18 1.7 μm (2.1 × 100 mm (Waters Inc.))连线，采用来自AQUITY UPLC系统(Waters Inc.)以200 μl/分钟递送的15-35% B的9分钟梯度，将肽分离。流动相由A：0.1%甲酸和B：含0.1%甲酸的CH3CN组成。ESI MS数据及单独的数据依赖性MS/MS采集(CID)和高能(MSE)实验采用Q-TOF Premier MS (Waters Inc.)以阳离子模式获得。亮氨酸-脑啡肽用作锁定质量(lock mass) (在m/z 556.2771下的[M+H]+离子)，并以连续模式收集数据(有关设置的更多描述，参见Andersen和Faber, Int. J. Mass Spec., 302, 139-148(2011))。
数据分析
采用标准CID MS/MS或MSE方法(Waters Inc.)，在单独的实验中鉴定出消化性肽。MSE数据应用BiopharmaLynx 1.2 (017版)进行处理。应用MassLynx软件和内部的MASCOT数据库，对CID数据依赖性MS/MS采集进行分析。
对HX-MS原始数据文档进行连续锁定质量校正。应用原型定制软件(HDX浏览器，Waters Inc.)和HX-Express ((Βeta版)；Weis等, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17, 1700 (2006))，进行数据分析，即氘化肽的质心测定(centroid determination)和交换(in-exchange)曲线绘图。还对所有数据进行目视评价，以确保仅对已解析的肽同位素掩盖(isotopic envelope)进行分析。
表位作图实验
在mAb存在或不存在时，通过将hTREM-1在相应的氘化缓冲液(即在D2O中制备的PBS，最终96% D2O，pH 7.4 (未校正值))中稀释6-8倍，来启动酰胺氢/氘交换(HX)。所有的HX反应均在20℃下进行，并在4 μM mAb不存在或存在时包含4 μM hTREM-1，因此得到2倍摩尔浓度过量的mAb结合部位。以范围为10秒钟-10000秒钟的适当时间间隔，通过50 μl冰冷的猝灭缓冲液(1.35M TCEP)猝灭HX反应的50 μl等分样品，得到最终的pH为2.5 (未校正值)。
结果和讨论
该实验对mAb 0023、0024、0025、0026和市售mAb MAB1278 (RnD Systems)和Clone26 (Biolegend)在hTREM-1上的表位作图。在8种不同的mAb不存在或存在时，监测43种肽(涵盖94%的hTREM-1的一级序列)的HX时程10-10000秒钟。
在早期时间点(例如<300秒钟)观察到的交换保护与表面暴露的酰胺质子有关，因此也与蛋白质界面有关。相比之下，时程后期观察到的作用与慢交换的酰胺氢有关，因此与蛋白质的结构核心有关。因此，表位作用出现在早期时间点，而结构稳定作用将表现为后期时间点的交换减少(Garcia, Pantazatos和Villareal, Assay and Drug Dev. Tech. 2, 81 (2004)；Mandell, Falick和Komives, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 14705 (1998))。
在给定mAb不存在或存在时在早期时间点观察到的交换模式可分成两个不同的组别：一组肽显示不受mAb结合影响的交换模式。相比之下，hTREM-1中的另一组肽显示在mAb结合时受保护免于交换。例如在100秒钟时与D2O交换，在mAb 0023的区域Y111-F126，大约超过(approx than)2个酰胺受保护免于交换。显示这种保护作用的区域被指定为表位区。
mAb 0023和0026的表位作图
mAb 0023和0026两者诱导hTREM-1交换特征的相同改变，在此将一并描述。在0023/0026结合时显示保护的区域包括涵盖残基T22-L96和Y111-D127的肽。然而，通过比较在结合mAb 0023/0026时各肽内交换保护的相对量以及肽T25-F48、R84-Q112和以P118开始的肽缺乏表位作用，可将表位缩小到残基A21-E26、A49-I85和C113-P119。尽管在序列中隔得远，但这些区域hTREM-1的3D结构中接近。
mAb 0024和Biolegend Clone 26的表位作图
mAb 0024和来自Biolegend的Clone26两者诱导hTREM-1交换特征的相同改变，在此将一并描述。在mAb 0024结合时显示保护的区域包括涵盖残基V101-Q112的肽。通过比较结合mAb 0024时各肽内交换保护的相对量及周围肽缺乏表位作用，可将表位缩小到残基Q104-Q112 (图7B)。
NNC mAb 0025的表位作图
在0025结合时显示保护的区域包括涵盖残基D38-M63、T70-L96和Y111-D127的肽(图7C)。然而，通过比较结合0254-0025时各肽内交换保护的相对量及在周围区域中肽缺乏表位作用，可将表位缩小至残基V39-Q56、T70-I85和C113-P119。虽然在序列中隔得远，但这些区域在hTREM-1的3D结构中接近(图8)。
MAB1278的表位作图
MAB1278结合时显示保护的区域包括涵盖残基T70-L96和V101-Q112的肽(图7D)。然而，通过比较结合MAB1278时各肽内交换保护的相对量及在周围区域中肽缺乏表位作用，可将表位缩小至残基T70-I85和Q104-Q112。虽然在序列中隔得远，但这些区域在hTREM-1的3D结构中接近。
mAb 0023/0026和mAb 0025表位的结构位置见图7A。mAb 0023和0026的表位似乎主要停留在hTREM-1晶体结构二聚体的二聚体界面的β-片层上。这些mAb的拮抗作用可能是防止hTREM-1二聚化并因此防止信号转导的结果。
实施例8：测定TREM-1和mAb 0170之间的相互作用界面
对重组人和食蟹猴TREM-1两者(分别为hTREM-1和cTREM-1)的表位作图。用于该实施例的hTREM-1构建体包含残基M1-H140 (SEQ ID NO: 18)，cTREM-1构建体包含具有6个组氨酸残基添加至C端并使用来自野生型hTREM-1的氨基酸编号的(SEQ ID NO: 12)的残基M1-R180。在整个实施例中，cTREM-1的氨基酸按照hTREM-1的类似残基编号，如图11所示。如果残基编号为58或更小，用于该实施例的编号可转化成减去19的SEQ ID NO: 12的编号，如果残基编号为60或更大，则减去20。例如，该实施例的cTREM-1的残基编号E46相当于SEQ ID NO: 12中的残基(46 – 19 = 27) E27。该实施例中cTREM-1的L96的残基编号相当于SEQ ID NO: 12中的残基(96 – 20 = 76) L76。
将TREM-1的溶液(单独或在mAb 0170存在时)在97%氘化hepes缓冲液(20 mM hepes，150 mM氯化钠，pH 7.4)中稀释25倍。通过稀释入氕化(protiated)hepes缓冲液中来制备非氘化对照。氢交换实验在waters HDX nanoAcquity超高效液相色谱法(UPLC)系统(Waters Corporation，Milford，MA，USA)上进行，该系统包括用于自动化样品制备的HD-x PAL自动进样器(LEAP Technologies Inc.，Carrboro，NC，USA)。将LC管、前置柱和分析柱和转换阀置于冷却至0.3℃的室中。将胰蛋白酶消化柱保存在15℃下。氢交换反应在20℃下进行。采用Waters SYNAPT G2 HDMS质谱仪联机进行质量分析。
在含或不含120 pmol mAb 0170的情况下，将含有100 pmol人或食蟹猴TREM-1 (1.54-1.98 μl)的体积稀释入氘化hepes缓冲液至50 μl的最终体积。以适当的时间间隔，整个体积转移到调节至pH 2.4的50 μl 1.35 mM Tris(2-羧乙基)膦中，在其中猝灭，并保持在3℃下。立即注入99 μl猝灭溶液，流经Porozyme固定化胃蛋白酶柱(2.1 mm x 30 mm) (Applied Biosystems，Life Technologies Corporation，Carlsbad，CA，USA)，并使用5 % (vol/vol)甲醇和0.1 %甲酸流动相，以100 μl/分钟流速在Waters VanGuard BEH C18 1.7 μm (2.1 mm × 5 mm)柱上俘获。使用含有0.1 %甲酸的10 – 40 %乙腈梯度以40 μl/分钟流速，在Waters UPLC BEH C18 1.7 μm (1.0 mm x 100 mm)柱上分离肽。
以具有激活的离子迁移分离的阳离子模式操作质谱仪。电喷雾条件为3.2 kV毛细管，25 V样品锥孔，4 V抽取锥孔偏移(extraction cone offset)，850 ml/分钟流速的加热至350℃的去溶剂化氮气和50 ml/分钟锥孔气流。将源块加热至120℃。锁定质量校正数据使用1+离子的亮氨酸-脑啡肽(m/z 556.2771)作为参比化合物获取，并在数据分析期间应用。对于肽鉴定，使用6 V (低能)和50 V (高能)的捕获碰撞偏移(trap collision offset)，进行MSE型实验。仅使用6 V低能捕获碰撞偏移，对氘化样品进行分析。更多详情参见Andersen, M.D., Faber, J.H., Int. J. Mass Spectrom. (2011), 302, 139-148。
应用Waters ProteinLynx Global Server 2.5分析MSE数据，鉴定了hTREM-1的肽涵盖80%的蛋白质序列(表3)，并鉴定了cTREM-1的肽涵盖100%蛋白质序列(表4)。采用自动应用锁定质量校正并测定氘掺入各肽的程度的Waters DynamX 1.0，分析HX-MS数据文档。另外，手工检查所有数据以确保正确的峰值分配和氘掺入的计算。
结果
表3提供肽及其交换模式列表。
当mAb 0170结合hTREM-1时，在涵盖A21-L96的序列的肽中观察到受保护免被交换，因此测定了表位在该区域内。当考虑在mAb 0170结合时显示未被保护免于交换的肽时，可将表位缩小到区域D38-F48。在mAb 0170不存在或存在时，R84-L96的区域显示几乎没有到没有交换，不能断定该区域是否是mAb 0170结合表位的一部分。肽K47-A68在mAb 0170结合时不显示受保护免于交换，但是当mAb 0170结合时肽T44-C69被保护。肽的前2个残基快速反交换，这些残基的交换信息丢失。断定残基E46、K47和F48的至少一个对mAb 0170的结合是重要的。
表3：mAb 0170在人TREM-1上的HXMS表位作图的结果
cTREM-1上的mAb 0170表位
表4提供肽及其交换模式列表。
当mAb 0170与cTREM-1结合时，观察到涵盖E38-A68的序列的肽受保护免于交换，因此测定表位在该区域内。当考虑在mAb 0170结合时显示无免于交换的保护的肽时，可将表位缩小到区域E38-L45。该表位与hTREM-1上的mAb 0170表位极为一致，但截短3个残基。hTREM-1中的肽C44-T69在mAb 0170结合时被保护，但是覆盖cTREM-1中的相应序列的肽A44-L67和A44-A68不受保护。因此，虽然hTREM-1中残基E46、K47和F48的至少一个有助于结合表位，但相应的残基E46、K47和Y48不参与mAb 0170与cTREM-1的结合。
表4：食蟹猴TREM-1上mAb 0170的HXMS表位作图
实施例9：通过表面等离子共振(SPR)对抗TREM-1抗体与人和食蟹猴TREM-1相互作用动力学的研究
结合研究在通过表面等离子共振实时测量分子相互作用的ProteOn分析仪(BioRad)上进行。实验在25℃下运行，将样品保持15℃下的样品室中。由ProteOn报告的信号(RU，响应单位)与6个平行流动池中的各个传感器芯片表面上的质量正相关。按照生产商的说明书，将来自Biacore人或小鼠Fc俘获试剂盒的抗人Fc单克隆或抗鼠Fc多克隆抗体以水平方向固定在GLM传感器芯片的流动池上。在不同的实验中，俘获抗体的最终固定水平为大约2600-6000 RU。如下进行纯化的单克隆小鼠或重组表达的抗hTREM-1抗体的俘获：将抗体在运行缓冲液(10 mM Hepes ，0.15 M NaCl，5 mM EDTA，0.05%表面活性剂P20，pH 7.4)中稀释到5-10 nM，并以30 μl/分钟以垂直方向注入达60s，用固定的仅抗Fc抗体产生邻近所有流动池的参比中间点(reference interspot)。这通常导致大约100-300 RU的试验抗体的最终俘获水平和30-90 RU的分析物的Rmax值。通过将分析物(抗原)以水平方向注入所有流动池来进行hTREM-1或cTREM-1蛋白的结合，以允许不同的俘获抗TREM-1抗体的结合相对于参比中间点的结合的比较分析。将hTREM-1或cTREM-1蛋白在运行缓冲液中连续1:3稀释成1.2-100 nM，以100 μl/分钟注入达250 s，并允许解离600s。在分析物的每个注入循环后，通过10mM甘氨酸(pH 1.7)和50 mM NaOH按100μl/分钟的2次18 s注入后，使GLM表面再生。这个再生步骤从固定的俘获抗体表面上除去抗TREM-1抗体和任何结合的TREM-1蛋白，并允许下一个相互作用样品对的后续结合。再生过程不会从芯片表面除去直接固定的抗Fc俘获抗体。
通过复合物形成和解离的动力学测量测定的平衡解离常数(KD)的测定，量化抗体与抗原间的结合亲和力。应用数据分析用ProteOn评价软件，通过将数据拟合至1:1 Langmuir模型，重新得到对应于一价复合物的缔合和解离的速率常数例如ka (缔合速率)和kd (解离速率)。KD通过方程式KD = kd /ka与ka和kd关联。
在数据分析前，通过双重参比(减去在俘获的抗TREM-1抗体上的参比表面信号以及空白缓冲液注入)，来处理结合曲线。这允许在样品注入期间校正仪器噪声、主体移位(bulk shift)和漂移。
表5：人TREM-1与不同抗TREM-1单克隆抗体的相互作用的结合常数ka (缔合速率)、kd (解离速率)和KD (平衡解离常数)的测量结果。
表6：食蟹猴TREM-1与不同抗TREM-1单克隆抗体的相互作用的结合常数ka (缔合速率)、kd (解离速率)和KD (平衡解离常数)的测量结果。
实施例10：阻断性TREM-1 mAb 14F69的人源化
从杂交瘤14F128A1和14F113A1B1C1的克隆获得2个先导抗体的可变区。两个抗体使用SMARTER-RACE技术(Clontech)克隆。人源化工作以迭代循环进行，其中使用杂交瘤纯化的抗体作为基准，先评价CDR移植抗体的亲和力，然后再工程改造以包括更多的回复突变，直到保持可接受的亲和力。在计算机上设计CDR移植抗体，并向销售商订购(www.genscript.com)。使用位点定向诱变(Stratagene)，进行抗体随后的再次工程改造。所有抗体在HEK293-6E细胞中表达以备用于亲和力测试。下面是有关合适人种系选择和回复突变试验的主要考虑的描述。该实施例中所使用的可变区的所有编号是指Kabat编号方案。
根据序列分析，按照Kabats定义的m14F128A1的CDR为：
其中m14F128A1和m14F113A1B1C1之间的差异以[m14F128A1/m14F113A1B1C1]给出。
M14F128A1的3D模型采用MOE的标准技术[可获自www.chemcomp.com]构建，有效CDR区的4.5 ?内的所有残基(VH：31-35B、50-58、95-102；VL：24-34、50-56、89-97)定义为掩蔽残基(mask residue)。掩蔽残基对保持CDR中的结合均可能是重要的。
掩蔽残基包括重链的位置1-2、4、27-37、47、49-59、69、71、73、78、92-103和轻链的位置1-5、7、23-36、46、48-56、58、62、67-71、88-98。
使用m14F128A1的种系搜索和手动检查，VH3_73和JH4被鉴定为重链的合适人种系组合，VKIV_B3和JK2被鉴定为轻链的合适人种系组合。
然后按照下列规则进行人源化：
- 掩蔽以外的残基被视为人的。
- 掩蔽以内和Kabat CDR以内的残基被视为鼠的。
- 掩蔽以内和具有小鼠/种系一致的Kabat CDR以外的残基被视为共有序列。
- 掩蔽以内和具有小鼠/种系差异的Kabat CDR以外的残基进行可能的回复突变。
将m14F128A1的有效CDR区移植入种系形成的m14F128A1的基础人源化构建体hz14F128A1。
与鼠CDR相比较的唯一差异位于CDR_H2 (用黑体字显示)。掩蔽残基中m14F128A1和hz14F128A1之间的任何不一致都将产生可能的回复突变，列表包括：
hz14F128A1_H：S30N，G49A，A78L，V93T
hz14F128A1_L：M4L，M58I，G68R
此外，使用m14F128A1和m14F113A1B1C1的紧密同源性来表明可能影响hz14F128A1的亲和力的残基。
hz14F128A1_H：N53S，I98Q
hz14F128A1_L：S27D_T，G29D，I30Y，M33L
为了研究所有可能的人源化mAb，产生并测试了上述突变体的所有组合。
来源于杂交瘤14F113的最终的人源化抗hTREM1抗体(mAb 0170)含有一个LC构架-回复突变(M4L)和一个HC CDR3突变(Q98I)。根据用名为14F128的高度同源的抗体进行的亲和力-协同作用研究，在HC CDR3中引入突变。下面描述了包括两个突变的基本原理。
抗体14F128和14F113的亲和力-协同作用研究
杂交瘤抗体14F128和14F113是高度同源的，并来源于同一体细胞重组事件。两种抗体在hTREM1结合中竞争，其中14F113具有最高亲和力。两种抗体的CDR移植形式在它们的CDR组成中总共以仅6个氨基酸(LC CDR中4个，HC CDR中2个)不同。当将14F113与14F128比较时，6个突变为LC T27dS、D29G、Y30I、L33M和HC S54N、Q98I。虽然CDR移植的14F128具有次于CDR移植的14F113的亲和力，但调查了当所有6个突变存在时，来自6个突变的一个或多个的有益亲和力作用是否被整体作用抑制。因此，将所有6个突变(HC S54N除外)分别引入CDR移植的14F113抗体中，根据亲和力对抗体排序。2个突变(LC L33M和HC Q98I)分别能够改进CDR移植的14F113的亲和力。HC Q98I位上的突变引起所得抗体(mAb 0170)特别好的亲和力。
构架回复突变亲和力分析
14F113抗体的小鼠形式具有在人源化期间可能作为回复突变而必然包括在内的7个突变。HC和LC中可能的回复突变分别为S30N、G49A、A78L和T93V M4L、V58I、G68R。将7个回复突变分别引入CDR移植的14F113中，然后根据亲和力排序。虽然数个突变能够改进亲和力，但仅选择LC突变M4L用于mAb 0170。针对表达效价(HEK293 6E)、亲和力和突变总数权衡包括突变的决定。
实施例11：通过表面等离子共振(SPR)对TREM-1抗体与hTREM-1的相互作用动力学的研究：mAb 0170和市售的TREM-1抗体的比较。
在通过表面等离子共振实时测量分子相互作用的ProteOn分析仪(BioRad)上进行结合研究。实验在25℃下运行，将样品保持15℃下的样品室中。由ProteOn报告的信号(RU，响应单位)与6个平行流动池中的各个传感器芯片表面上的质量正相关。所包括的市售抗体为Biolegend #314907、Biolegend #316102 (Biolegend，USA)、Hycult Biotech HM2252 (Hycult Biotech，Netherlands)、R&D #MAB1278 (R&D systems，United Kingdom)、SC98Z12 (Santa Cruz Biotechnology，USA)、Sigma #WH0054210m4、Sigma #SAB1405121 (Sigma-Aldrich Danmark A/S)。
按照生产商的说明书，将来自Biacore人或小鼠Fc俘获试剂盒的抗人Fc单克隆或抗鼠Fc多克隆抗体以水平方向固定在GLM传感器芯片的流动池上。在不同的实验中，俘获抗体的最终固定水平为大约2600-6000 RU。如下进行纯化的单克隆小鼠或重组表达的人源化抗hTREM-1抗体的俘获：将抗体在运行缓冲液(10 mM Hepes 0.15 M NaCl，5 mM EDTA，0.05%表面活性剂P20，pH 7.4)中稀释到5-10 nM，并以30 μl/分钟以垂直方向注入达60s，用仅固定的抗Fc抗体产生邻近所有流动池的参比中间点。这通常导致大约100-300 RU的试验抗体的最终俘获水平和30-90 RU的分析物的Rmax值。通过将分析物以水平方向注入所有流动池来进行hTREM-1或cTREM-1蛋白的结合，以允许不同的俘获抗TREM-1抗体的结合相对于参比中间点的结合的比较分析。将hTREM-1或cTREM-1蛋白在运行缓冲液中连续1:3稀释成1.2-100 nM，以100 μl/分钟注入达210 s，并允许解离600s。在分析物的每个注入循环后，通过10mM甘氨酸(pH 1.7)和50 mM NaOH按100 μl/分钟的2次注入，使GLM表面再生。这个再生步骤从固定的俘获抗体表面上除去抗TREM-1抗体和任何结合的TREM-1蛋白，并允许下一个相互作用样品对的后续结合。再生过程不会从芯片表面除去直接固定的抗Fc俘获抗体。
通过复合物形成和解离的动力学测量测定的平衡解离常数(KD)的测定，量化抗体与抗原间的结合亲和力。应用数据分析用的ProteOn评价软件3.1.0.6，通过将数据拟合至1:1 Langmuir模型，再次获得对应于一价复合物的缔合和解离的速率常数例如ka (缔合速率)和kd (解离速率)。KD通过方程式KD = kd /ka与ka和kd关联。
在数据分析前，通过双重参比(减去在俘获的抗TREM-1抗体上的参比表面信号以及空白缓冲液注入)，来处理结合曲线。这允许在样品注入期间校正仪器噪声、主体移位和漂移。
表7：人和食蟹猴TREM-1与不同抗TREM-1单克隆抗体相互作用的KD (平衡解离常数)的测量结果。
实施例12：通过表面等离子共振对抗人TREM-1单克隆抗体的竞争结合研究。
用单克隆小鼠或重组表达的人源化抗hTREM-1抗体进行SPR结合竞争研究以区分不同的结合部位(表位)。所包括的市售抗体为Biolegend #314907 (Biolegend，USA)和SC98Z12 (Santa Cruz Biotechnology，USA)。竞争抗原上的相同或重叠结合部位(表位)的抗hTREM-1单克隆抗体不能够与所述抗原同时结合，因此指定到同一“框”中。不竞争抗原上的相同或重叠结合部位的抗TREM-1单克隆抗体能够同时结合，因此指定到不同的“框”。实验用可溶性人TREM-1胞外域作为抗原进行。
所有研究在25℃下进行，将样品保持15℃下的样品室中。使用0.4 M EDAC [1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐]和0.1 M磺基-NHS [N-羟基磺基琥珀酰亚胺]的1:1混合物，将各个抗TREM-1单克隆抗体和无关的对照单克隆抗体固定在GLC传感器芯片的各个流动池中。将各抗体在10 mM乙酸钠(pH 5.0)中稀释至25或10 (SC98Z12 (80394)) μg/ml的浓度，并以30 μl/分钟固定在各个流动池中达240s。将抗体固定在流动池L1-L6中(包括对照)。在抗体固定后，流动池中的活性部位用1 M乙醇胺封闭。用活化和失活以水平方向进行固定，产生无固定化蛋白质的中间点参比点。在一个实验中，试验抗体最终的固定水平的范围为大约1100-1300 RU，一种抗体(SC98Z12)除外，其中仅390 RU被固定。将重组人TREM-1在运行缓冲液(10 mM Hepes ，0.15 M NaCl，5 mM EDTA，0.05%表面活性剂P20，pH 7.4)中稀释至100 nM。以30 μl/分钟将抗原按水平方向注入固定化抗体上300 s，允许控制与中间点参比和固定化对照抗体两者可能的非特异性结合，导致150-600 RU俘获的TREM-1，具有低固定水平的一种抗体(SC98Z12)除外，其中仅俘获4 RU。
将各抗体(已被固定的相同抗体)以水平方向注入平行的流动池上，以供与被第一抗体俘获的hTREM-1的结合相对于与中间点参比和固定化对照抗体的结合的比较分析。将各竞争性抗体稀释至100 nM，并以100 μl/分钟注入达250 s。在分析物的每个注入循环后，通过1M甲酸(pH 3.5)、3M MgCl2和50 mM NaOH以100 μl/分钟的2次18 s注入，使GLC芯片再生。这个再生步骤从固定化抗体表面除去TREM-1抗原和任何结合的第二抗体，并允许下一个试验样品的后续结合。再生过程不从芯片表面除去直接固定的抗TREM-1试验抗体(第一抗体)。数据分析用ProteOn ManagerTM 3.1.0.6软件进行。评价俘获水平以确保再生步骤在整个注入顺序中提供一致的结合表面。未观察到人TREM-1不与中间点对照表面或固定化对照抗体的显著非特异性结合。通过减去中间点对照表面信号来处理结合曲线。这允许在样品注入期间校正仪器噪声和主体移位。
竞争结果报告为阳性或阴性结合(表8)。阳性(+)结合表明竞争性抗体能够同时与第一抗体结合hTREM-1 (即它们不竞争)，因此第一抗体和竞争性抗体指定到不同的表位框。阴性结合表明竞争性抗体不能够同时与第一抗体结合hTREM-1 (即它们竞争)，因此第一抗体和竞争性抗体被指定到相同的表位框。这些实验中的反应值是重要的，并允许明确测定抗TREM-1单克隆抗体的表位框。
表8：在SPR竞争测定法中测试的抗体结合(+)或竞争(-)的能力。SC98Z12不产生足够高的TREM-1俘获以作为第一抗体评价(*)。
MAb 0170和mAb 0048 (自杂交瘤14F11纯化，其与14F128相同)显示竞争结合人TREM-1。Biolegend #314907和SC98Z12不与这些的任一个竞争结合人TREM-1，但彼此竞争。这些研究结果得出结论，前两个(mAb 0048和mAb 0170)属于同一框(框1)，而Biolegend #314907和SC98Z12属于另一个框(框2)。
实施例13：与人和食蟹猴TREM-1的突变形式结合的Fab 0011和Fab 0170之间相互作用的动力学分析
通过SPR进行相互作用研究以确定人TREM-1上0011和0170抗人TREM-1抗体的表位的差异。通过比较在已知表位中引入丙氨酸突变的人TREM-1变体以及食蟹猴TREM-1的部分“人源化”变体(后者因为仅mAb 0170与食蟹猴TREM-1交叉反应)的结合动力学，来鉴定对相应表位是独特的氨基酸残基。
用于该研究的hTREM-1胞外域丙氨酸突变体构建体和部分人源化食蟹猴突变体构建体概括于表9。所用的全部构建体SEQ ID NO:19 (食蟹猴TREM-1变体)或SEQ ID NO: 20 (人TREM-1变体)的变体，并包括在SPR结合动力学测定中用于俘获的C端-cmyc2-His6标签。除非另有说明，否则本实施例中提到的序列按照图11编号。
表9
在通过表面等离子共振实时测量分子相互作用的ProteOn分析仪上，进行结合研究。实验在25℃下运行，将样品保持15℃下的样品室中。由ProteOn报告的信号(RU，响应单位)与6个平行流动池中的各个传感器芯片表面上的质量正相关。使用0.4 M EDAC [1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐]和0.1 M磺基-NHS [N-羟基磺基琥珀酰亚胺]的1:1混合物，将抗His单克隆抗体固定在GLM传感器芯片的6个平行流动池中。将抗体在10 mM乙酸钠(pH 5.0)中稀释至25 μg/ml的浓度，并以30 μl/分钟固定在各个流动池中达240s。在抗体固定后，流动池中的活性部位用1 M乙醇胺封闭。以水平方向进行固定的所有步骤。在一个实验中，俘获抗体最终的固定水平为大约8000 RU。将来自表达人或食蟹猴TREM-1 ECD的野生型或不同突变的变体的HEK 293细胞的细胞培养基在运行缓冲液(10 mM HEPES，150 mM NaCl，3 mM EDTA，0.05%表面活性剂P20，pH 7.4)中稀释40-60倍。将TREM-1蛋白以垂直方向按30 μl/分钟注入固定化抗His俘获抗体上达60 s。这会产生50-250 RU俘获的TREM-1，并产生在水平方向上仅有固定化俘获抗体而无俘获的TREM-1的中间点参比。将各Fab以水平方向注入平行流动池上，以允许进行与被抗His抗体俘获的TREM-1变体结合的动力学分析。在注入前，将各Fab在运行缓冲液中稀释至0、5.5 (在一个实验中)、16.7和50 nM，并以100 μl/分钟注入达250 s (解离时间)。监测这些注入后的解离时间10分钟。在TREM-1和Fab的每个相互作用循环后，通过10 mM甘氨酸和50 mM NaOH以100 μl/分钟的2次18 s注入，使GLM芯片再生。这个再生步骤从抗His抗体表面除去TREM-1变体和任何结合的Fab，并允许下一个相互作用对的后续结合。再生过程不从芯片表面除去直接固定化的抗His俘获抗体。
为了获得动力学数据，例如ka (缔合速率)、kd (解离速率)和KD (平衡解离常数)，应用ProteOn ManagerTM 3.1.0.6软件进行数据分析。对一式两份或一式三份运行的样品的俘获和结合水平进行评价以确保再生步骤在整个注入顺序中提供一致的结合表面。未观察到具有仅固定化俘获抗体的中间点参比的显著非特异性结合。通过减去中间点对照表面信号以及注入运行缓冲液，来处理结合曲线。这允许在样品注入期间校正仪器噪声和主体移位。将0170 Fab和0011 Fab对不同TREM-1 ECD变体的亲和力与对野生型人或食蟹猴TREM-1 ECD的亲和力进行比较。
还对在注入Fab结束后10 s的结合水平(归一化至俘获的TREM-1变体的水平)进行评价以鉴定结合消除或具有极低结合的突变形式。亲和力降低联合显著较低的归一化结合水平可表明因引入突变所致折叠被破坏。然而应注意动力学的改变也将影响该值。因此，针对结论目视检查每个结合曲线(数据未显示)。
具有丙氨酸单一突变的人TREM-1的结果(表10)显示2个位置(E46和D92)是独特的，因为它们降低与0170 Fab的结合大于2倍。
表10：相对于对人TREM-1 wt，0170 Fab和0011 Fab对具有丙氨酸突变的人TREM-1的亲和力。在缔合结束后10 s，0170 Fab和0011 Fab的结合水平，表示为理论最大结合水平的程度。
与mAb -0011不同，mAb -0170能够结合食蟹猴TREM-1。与人TREM-1 (0247)相比，食蟹猴TREM-1在选定区域的人源化不会导致0177亲和力的重新获得，表明了其它残基或残基的组合对于对人和食蟹猴TREM-1的亲和力中的差异是重要的。
0243显示不与0170 Fab或0011 Fab结合。对于该构建体，不能排除突变已影响整体结构，因此不能断定Q52是否参与所研究的Fab与人TREM-1的结合。
表11：0170 Fab和0011 Fab与wt食蟹猴TREM-1 ECD、部分人源化食蟹猴TREM-1 ECD变体和wt人TREM-1 ECD的亲和力。在缔合结束后10 s 0170 Fab和0011 Fab的结合水平，表示为理论最大结合水平的程度。
实施例14：在BWZ/hTREM-1报道细胞测定中mAb 0170有效地阻断TREM-1活化
采用描述于实施例6的BWZ/hTREM-1报道细胞测定法计算mAb 0170在阻断TREM-1中的效价。BWZ/hTREM-1报道细胞用TREM-1配体复合物刺激，并加入不同浓度的mAb 0170。图9显示TREM-1信号的剂量依赖性阻断，导致在高于0.2 ug/ml的浓度下完全阻断信号。应用Graphpad Prism软件，方程式：log(抑制剂)相对于反应--可变斜率，求出IC50值为2.4 nM。
实施例15：在BWZ/hTREM-1报道细胞测定中市售TREM-1抗体不阻断TREM-1活化。
如前所述，BWZ/hTREM-1报道细胞测定中包括多个剂量的抗体。SAB1405121 (克隆3F5，来自Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)、WH0054210M4 (克隆2E2，来自Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)、sc-80394 (克隆98Z12，来自Santa Cruz，California，USA)、HM2252 (克隆6B1，来自Hycult biotech，5405 PB UDEN，Netherlands)、316102 (克隆TREM-37，来自Biolegend，San Diego，CA 92121，USA)和314907 (克隆TREM-26，来自Biolegend，San Diego，CA 92121，USA)不能够明显阻断TREM-1活性，而本文公开的mAb 0170在0.3 ug/ml下可阻断大于99%的TREM-1活性。甚至在3 ug/ml下，同种型对照具有>95%剩余反应性。
表12
实施例16：mAb 0170阻断食蟹猴TREM-1
为了测试针对来自其它物种的TREM-1的功能性，将小鼠和食蟹猴TREM-1分别与人和小鼠DAP12一起转染，得到与用于人的一样的报道细胞测定。这基本上按人系统中所述进行(实施例1、2和6)，只是用全长鼠(m)TREM-1 (SEQ ID NO: 22)或全长食蟹猴(c)TREM-1 (SEQ ID NO: 21)替换人TREM-1。在GeneArt合成编码cTREM-1 (SEQ ID NO: 22)的cDNA，并以XhoI – XbaI方向克隆至pHLEF38 (得到CMC ICOS许可)。使用10 ug的各种质粒，将TEα NFAT Luc细胞用pHLEF38.cynoTrem1和pNEF38.NFlag hDAP12共转染，并使用BTX电穿孔仪(260 V，1050 uF，720 ohm；时间常数为23 msec)，在约500 ul总体积(400 ul生长培养基和100ul DNA)中，对8e6个细胞进行电穿孔。将细胞接种在10 cm板的10ml 50 %条件培养基中48小时，并以平底96孔板(5个板)的8e3个细胞/孔直接接种到200 ul/孔含800ug/ml G418和0.5mM L-组氨醇的30%条件培养基中进行选择。在2周的温育后，使用Genetix Clone Select Imager，鉴定出40个单一集落。
能够与食蟹猴TREM-1交叉反应的唯一的市售TREM-1抗体是314907 (克隆TREM-26，来自Biolegend，San Diego，CA 92121，USA) (参见实施例11)。在实施例15中测试的市售抗体无一能够阻断食蟹猴TREM-1的功能，甚至可与食蟹猴TREM-1结合的抗体也不能。
表13
同样，产生了具有小鼠TREM-1的报道细胞系。抗体无一能够与人TREM-1或与食蟹猴结合，且人TREM-1可与小鼠TREM-1交叉结合。因此，基本上按产生人TREM-1抗体的描述，但用小鼠TREM-1作为抗原，来产生抗小鼠TREM-1的抗体。在鼠报道基因测定中，针对小鼠TREM-1结合和阻断功能对这些抗体进行筛选。这类抗体之一(mAb 0174)能够结合并阻断小鼠TREM-1功能。
实施例17：从被PGLYRP-1刺激的M2巨噬细胞释放TNFα被TREM-1抗体阻断
本领域技术人员应认识到，建立来自多个供体的原代细胞的冷冻库系列从而提供重复实验便利的价值。如下从外周血单核细胞产生体外来源的巨噬细胞。按照生产商说明书，使用来自Stem Cell Technologies (Vancouver，BC，Canada)的Rosette Sep试剂盒(目录号15068)，从获自Research Blood Components (Brighton，MA，USA)的外周血”leukopak”，分离负性富集(negatively enriched)的单核细胞。将分离的单核细胞悬浮于50e6个细胞/ml的10% DMSO/FBS等分液中，逐渐冷却至-80℃。为了产生巨噬细胞，将单核细胞的一个或多个冷冻小瓶在37℃水浴中快速融化，用含10% FBS (Fisher Scientific目录号03-600-511]的生长培养基[RPMI 1640 (Gibco，Carlsbad CA，USA)目录号72400-047)稀释至10ml，以250g离心5分钟。将细胞悬浮于补充50 ng/ml人MCSF (Gibco 目录号PHC9501)的生长培养基中至2e6个细胞/ml，置于组织培养处理的带盖型(petri style)组织培养板上，并放入经编程以保持5% CO2、2% O2的“低氧”环境的潮湿培养箱中。在培养的第3天，给细胞添加等体积的补充50 ng/ml人MCSF的生长培养基。培养6天后，单核细胞分化成M0巨噬细胞。通过更换培养基为补充50 ng/ml人IFNg (Gibco目录号PHC4031)用于M1巨噬细胞或40 ng/ml人IL-4 (Gibco目录号PHC0045)用于M2巨噬细胞的生长培养基，并放回培养箱再过22小时，M0细胞进一步分化。在第7天，巨噬细胞适当分化以待用于生物测定。简单地说，通过依次用1X PBS和5mM EDTA/PBS洗涤，从带盖培养板中回收巨噬细胞。然后将板放回37℃达30分钟，使用10ml注射器和22G针，把细胞从板上“用力冲洗”下来。然后将细胞稀释至生长培养基中，以250g离心5分钟，之后将细胞沉淀悬浮至1e6/ml的终浓度。
将如上制备的巨噬细胞用于生物测定中，其中通过ELISA测定条件培养基中因响应细胞被TREM-1配体刺激而产生的细胞因子(例如TNF-α)。还利用这种生物测定以测量通过TREM-1特异性抗体对这种TREM-1配体刺激的阻断。TREM配体或阴性对照以4X浓度制备，并将50微升/孔的生长培养基中加到96孔微量测定皿中。TREM-1配体的终浓度由7.5 ng/ml重组人PGLYRP1 (参见实施例5)和3 μg/ml PGN-BS (Invivogen，tlrl-pgnbs，SanDiego CA，USA)组成。使细胞在上述潮湿的低氧条件下培养22小时，其后收集条件培养基，按照生产商说明书(R&D Systems，目录DY210，MN，USA)，通过ELISA测量TNF-α水平。图10显示TREM-1抗体降低从这些受刺激的M2巨噬细胞释放TNFα。
下表12显示所述实验的IC50值，表明了本文公开了抗体在阻断TREM-1依赖性细胞因子释放中非常有效。
表14
实施例18：来自食蟹猴巨噬细胞的TNFα释放可被mAb 0170阻断
外周血来源的巨噬细胞在先天免疫调节和活化的研究中用作极好的体外模型。已知TREM-1在控制这个过程中起关键作用。非人灵长类动物物种食蟹猴(Macaca fascicularis) (通常称为食蟹猴(Cynomolgus monkey))的使用对理解调节TREM1信号转导的体内作用是关键性的。在该实施例中，针对抗TREM-1抗体在食蟹猴M2巨噬细胞培养物中阻断细胞因子产生的能力对其进行了测试。
如下产生巨噬细胞。使用肝素钠真空管(目录号3664870，Bectin Dickinson Franklin Lakes NJ，USA)，通过静脉穿刺，从健康雄性成年动物(SNBL，Everett WA，USA)中收获全血。将全血用PBS稀释30%，然后将30 ml小心地铺在50ml圆锥管中用PBS预先稀释至96%的15ml Ficoll-Paque (目录号17-1440-03 GE Healthcare，Uppsala Sweden)上。在室温，400g以低加速度和无制动的离心30分钟后，从Ficoll/血浆相间收获外周血单核细胞(PBMC)，用PBS稀释3X，并室温、200g离心7分钟。吸出含有污染血小板的上清液并弃去，将细胞沉淀重新悬浮于30ml的PBS + 0.2% FBS (胎牛血清)中。再重复这个细胞洗涤过程2个循环，之后将PBMC细胞沉淀重新悬浮于RPMI培养基(目录号61870-036，Life Technologies，Grand Island NY，USA)加10% FBS中至2E6个细胞/ml，以20ml/皿分配到15 cm带盖培养皿(目录号430599 Corning，Tewksbury MA，USA)中。通过在37C、5% CO2、100%湿度下温育过夜，使单核细胞附着在塑料上，之后通过轻轻旋转和摇动板20秒钟接着吸取，来除去非贴壁细胞。将20ml补充50ng/ml hMCSF (目录号PHC9501，Life Technologies，Grand Island NY，USA)的新鲜生长培养基加入各板中，放入37℃、5% CO2、2% O2、100%湿度的低氧培养条件下7天。在培养的第3天，给细胞添加等体积的补充50 ng/ml人MCSF的生长培养基。培养6天后，单核细胞分化成M0巨噬细胞。过更换培养基为补充50 ng/ml人IFNg (Gibco目录号PHC4031)用于M1巨噬细胞或40 ng/ml人IL-4 (目录号PHC0045，Life Technologies，Grand Island NY，USA)用于M2巨噬细胞的生长培养基，并放回培养箱再过22小时，使M0细胞进一步分化。在第7天，巨噬细胞适当分化以待用于生物测定。简单地说，通过依次用1X PBS和5mM EDTA/PBS洗涤，从带盖培养板中回收巨噬细胞。然后将板放回37℃达30分钟，使用10ml注射器和22G针，把细胞从板上“用力冲洗”下来。然后将细胞稀释至生长培养基中，以250g离心5分钟，之后将细胞沉淀悬浮至1e6/ml的终浓度。
将如上制备的巨噬细胞用于生物测定中，其中通过ELISA测定在条件培养基中因响应细胞被TREM-1配体刺激而产生的细胞因子(例如TNF-α)。还利用这种生物测定以测量通过TREM-1特异性抗体对这种TREM-1配体刺激的阻断。TREM-1配体或阴性对照以4X浓度制备，并将在生长培养基中50微升/孔加入96孔微量测定皿中。TREM-1配体的终浓度由7.5 ng/ml重组人PGLYRP1 (如实施例所述5产生)和3 μg/ml PGN-BS (目录号tlrl-pgnbs，Invivogen SanDiego CA，USA)组成。以50微升/孔的生长培养基加入抗体，接着以50微升/孔的巨噬细胞加入细胞。使细胞在上述潮湿的低氧条件下培养22小时，其后收集条件培养基，按照生产商说明书(目录号DY1070 R&D Systems，Minneapolis MN，USA)，通过ELISA测量TNF-α水平。下表显示在对照抗体或抗TREM-1抗体存在下用TREM-1配体(PGLYRP1+PGN)刺激的M2巨噬细胞培养物的TNFα值。
该实施例说明在来源于食蟹猴的巨噬细胞中，抗TREM-1 Ab-0170可有效地阻断TREM依赖性细胞因子产生。这种Ab的功效支持其在食蟹猴中在体内毒理学和疾病治疗模型中的用途。
实施例19：自受刺激的外周血单核细胞的TNFα释放可被TREM-1抗体阻断
将来自血沉棕黄层和冷冻于RPMI 1640 (目录号61870，Gibco，New York，USA)、20% FBS (目录号16140-071，Gibco，New York，USA)、10% DMSO (目录号D2650，Sigma，Steinheim，Germany)中的PBMC融化，用RPMI、10% FBS、1%青霉素/链霉素(目录号15070-06，Gibco，New York，USA)洗涤2次，并重新悬浮于相同培养基至4x10E6/ml。细胞然后以400.000个细胞/孔分配。将10 μg/ml PGN-SA (目录号tlrl-pgnsa，Invivogen，San Diego，USA)和0.2 μg/ml PGLYRP1加入孔中以刺激细胞。随后，将相关同种型和TREM-1抗体在RPMI中稀释，并分别以1.34 nM和0.167 nM加入。在37℃、5% CO2下温育20小时后，按照生产商的方案，通过diaplex (目录号880.090.001，Genprobe，Besancon，France)测量TNFα释放。如下表13所示，本文公开的TREM-1抗体(mAb 0044、0070和0059)全都能够降低TNFα自PBMC细胞的释放。
表15
使用阻断性TREM-1抗体在PBMC中TNFα释放约70%的抑制表明在受刺激的细胞培养物中对细胞因子水平的显著影响。
实施例20：抗TREM-1 mAb可抑制含氧量正常的巨噬细胞中PGN+PGLYRP1诱导的TNFa产生
使用PGN-BS +人PGLYRP1作为TREM-1受体刺激剂刺激巨噬细胞可被抗TREM-1抗体阻断。
正如实施例15中一样，单核细胞分化成M2巨噬细胞。细胞分化和刺激的所有步骤在正常大气氧水平(常氧)下在37℃、5% CO2培养箱中进行。将分化的M2巨噬细胞重新悬浮于RPMI/10%FBS中，以5x10E5个细胞/ml一式三份(除非另有说明)接种在试验孔中。细胞然后用以下刺激物刺激24小时：无添加、PGLYRP1、PGN-BS (InVivogen，tlrl-pgnbs) (一式三份两套)、PGN-BS+PGLYRP1 (一式三份三套)或在抗TREM-1或同种型对照抗体存在下的PGN-BS+PGLYRP1。然后收获上清液，使用BioPlex (Bio-Rad，171-B5026M)分析TNFa。针对TREM-1的抗体(0.1 μg/ml) mAb-0122和-0170能够降低TNF-α释放。
表16
该实施例说明抗TREM-1 mAb-0122和-0170可抑制自生长在含氧量正常条件下的巨噬细胞的TNFa产生。
实施例21：TREM-1抗体特异性抑制类风湿性关节炎滑液诱导的反应。
在实施例6所述BWZ报道分子测定中，针对TREM-1配体活性分析患有类风湿性关节炎的患者的RA滑液样品。简单地说，滑液经融化，涡旋并系列稀释，在添加TREM-1抗体或阴性同种型对照的情况下，以一式两份+/-10μg/ml PGNECndi (Invivogen，SanDiego，CA，USA)测定。类风湿性关节炎患者的滑液能够以TREM-1依赖性方式(其通过添加MAB1278 (R&D Systems，Minneapolis，MN 55413，USA：目录号MAB1278)而被进一步增强)引发BWZ/hTREM-1报道细胞测定，而本文公开的阻断性TREM-1抗体能够减少这种活化。
在通过以下两栏表示的两个测定法中测试抗体，每个抗体的浓度范围为0.1-10 ug/ml。与同种型对照相比，MAB1278明显增强信号，而mAb 0122和0170减弱信号。
表17
实施例22：在用PGLYRP-1刺激时细胞因子自类风湿性关节炎患者的滑膜组织细胞中的释放可被mAb 0170阻断。
在全膝关节置换期间从RA患者获得滑膜组织样品。通过经4mg/ml胶原酶(目录号11088793001，Roche，Mannheim，Germany)和0.1mg/ml DNA酶(目录号11284932001，Roche，Mannheim，Germany)在37℃下消化1小时，分离出单一的滑膜组织细胞悬液。
在不同浓度的mAb 0170或同种型hIgG4对照存在或不存在下，在低氧条件下，将培养基RPMI (目录号R0883，St Louis，MO，USA) +10% FCS (目录号S0115，BioChrom AG，Grand Island，NY 14072，USA)中1x10^5/孔的滑膜组织细胞用4ug/ml PGLYRP1和1ug/ml PGN-ECNDi (目录号tlrl-kipgn，Invivogen，San Diego，CA 92121，USA)刺激。在24小时温育后，收获细胞上清液，通过ELISA (TNFa (目录号DY210，R&D，Minneapolis，MN55413 USA)、IL-1b (88-7010-88，eBioscience，San Diego，CA 92121，USA)、GM-CSF (目录号88-7339-88，eBioscience))或Flowcytomix (TNFa、IL-1b、MIP-1b、MCP-1、IL-6和IL-8 (目录号BMS，eBioscience)，测量细胞因子。细胞因子在用TREM-1配体刺激时从滑膜组织细胞分泌，且被TREM-1抗体mAb 0170特异性阻断。
下面是所述实验的一个实例，其中使用4 ng/ml或10 ng/ml mAb，当用TREM-1抗体mAb 0170处理时，导致细胞因子释放降低。
表18
表19
该实施例显示类风湿性关节炎患者滑膜组织的细胞将通过分泌多种细胞因子(其可被mAb 0170抑制)响应TREM-1配体PGLYRP1的刺激。
实施例23：类风湿性关节炎患者的滑膜组织细胞中II型PGLYRP1诱导的TNFα释放可被TREM-1抗体mAb 0170阻断
在全膝关节置换期间从RA患者获得滑膜组织样品。通过经4mg/ml胶原酶(目录号11088793001，Roche，Mannheim，Germany)和0.1mg/ml DNA酶(目录号11284932001，Roche，Mannheim，Germany)在37℃下消化1小时，分离出单一的滑膜组织细胞悬液。在1ug/ml mAb 0170或IgG4同种型对照存在或不存在下，在低氧条件下，将滑膜组织细胞(1x10^5/孔，在培养基RPMI (目录号22400105，Gibco，NY 14072，USA) +10% FCS (目录号S0115，BioChrom AG，Berlin，Germany)中)与不同剂量的用II型PGLYRP1瞬时转染的HEK细胞共温育。在24小时温育后，收获细胞上清液，并通过TNFa ELISA (目录号DY210，R&D，Minneapolis，MN55413 USA)测量细胞因子。
表20
该实施例表明与对照细胞(转染的模拟品)相比，TREM-1配体(II型细胞)在类风湿性关节炎患者的滑膜组织细胞中以剂量依赖性方式诱导TNF-α释放。这种TNFα反应被mAb 0170阻断，但不被同种型IgG4阻断。对照细胞不受影响。
实施例24：板结合的MAB1278诱导巨噬细胞的IL-6和TNFα反应，显示激动性特征，而mAb 0122和0170不诱导。
板结合的激动性抗TREM-1抗体对巨噬细胞的刺激诱导IL-6和TNFa的产生。使用RosetteSep (StemCell Technologies，15068)从健康供体血沉棕黄层纯化单核细胞，并通过在40 ng/ml人MCSF存在下在RPMI/10%FBS中培养6天分化成巨噬细胞。然后通过更换培养基为补充50 ng/ml人IL-4的生长培养基，并放回培养箱再过24小时，将巨噬细胞再分化成M2巨噬细胞。在第7天，通过依次用1X PBS和5mM EDTA/PBS洗涤，从培养板中回收巨噬细胞。然后将板放回至37℃ 30分钟后，将巨噬细胞从板上洗出。将巨噬细胞在RPMI/10%FBS中洗涤后，重新悬浮并接种。通过将试验孔与在PBS中稀释的特定抗体温育过夜，接着在PBS中洗涤3次，使试验孔用所述抗体预先包被。重新悬浮的巨噬细胞以5x10E5个细胞/ml一式三份接种于试验孔，随后温育24小时。(细胞分化和刺激的所有步骤在正常大气氧水平(常氧)下在37℃、5% CO2培养箱中进行)。然后收获上清液，使用BioPlex (Bio-Rad，171-B5006M和171-B5026M)分析IL-6和TNFa。
抗体mAb-0122和-0170显示极低的激动作用，而MAB1278抗体(RnD Systems，MAB1278)显示有效诱导IL-6和TNFa。
表21
该实施例说明mAb-0122和-0170在巨噬细胞中仅显示极低的激动活性，并且表明这些mAb的真实阻断特征。
实施例25：在小鼠关节炎模型中阻断TREM-1减轻疾病。
在DTH-关节炎模型中获得表22概述的实验，该模型是单爪关节炎模型。通过免疫并且随后用甲基化牛血清白蛋白(mBSA)攻击，在右后爪诱导经典的迟发型过敏反应(DTH)，来诱导雌性C57BL/6小鼠的单爪关节炎，其中的改动是在免疫和攻击步骤之间IV给予II型胶原单克隆抗体(抗CII)的混合物。左后爪接受PBS攻击，用作动物内对照。如采用实施例6中所述的鼠形式的报道分子测定法测定，用特异性结合和阻断鼠TREM-1的TREM单克隆抗体3次/周给小鼠(10只小鼠/组)治疗。在免疫日给予第一剂。用对照抗体或PBS作为对照治疗小鼠(9-10只小鼠/组)。从关节炎诱导日测量爪肿胀并进行11天。结果表示为平均曲线下面积(AUC) ± SEM。采用两侧非配对t-检验、95%置信区间，检测统计显著性。
表22：小鼠关节炎模型中TREM-1治疗对爪肿胀(AUC-mm)的作用。
实施例26：激活的嗜中性粒细胞释放IL-8，其可被TREM-1 mAb阻断
嗜中性粒细胞表达TREM-1，嗜中性粒细胞也表达TREM-1配体。为了测试TREM-1是否参与嗜中性粒细胞中的自分泌刺激环路，分离的嗜中性粒细胞用PGN-SA (InVivogen，tlrl-pgnsa)刺激，并测量释放到培养基中的IL-8。TREM-1抗体mAb-0059、-0067、-0122和-0170能够降低PGN-SA诱导的IL-8释放。嗜中性粒细胞自人健康供体全血中分离，以1.5x10E6个细胞/ml重新悬浮于RPMI/10% FBS中，并一式三份接种到用血纤蛋白原预先包被的试验孔中(用50μl PBS中的1mg/ml血纤蛋白原(Sigma，F3879)在37℃下预先包被2小时，随后用PBS洗涤3次)。在下列条件下测试细胞：不添加刺激物；仅10μg/ml PGN-SA；或在0.25μg/ml的mAb-0059、-0067、-0122、-0170或同种型对照抗体存在下的10μg/ml PGN-SA。将样品在37℃、5% CO2培养箱培养24小时。然后收获上清液，使用Bio-plex Pro Human Cytokine IL-8套盒(BioRad，171-B5008M)，分析IL-8。
表23
该实施例说明来自用细菌来源的PGN刺激诱导的嗜中性粒细胞的IL-8释放可被TREM-1抗体降低。因此表明TREM-1参与嗜中性粒细胞中的自分泌活化环路，且TREM-1抗体可有效地用于减量调节嗜中性粒细胞反应。
实施例27：激活的嗜中性粒细胞可刺激单核细胞，其可被抗TREM-1 mAb阻断
激活的嗜中性粒细胞表达TREM-1配体。为了测试激活的嗜中性粒细胞是否可以TREM-1依赖性方式刺激其它免疫细胞，使用激活的嗜中性粒细胞刺激分离的单核细胞，并测量释放到培养基中的TNFa。TREM-1抗体mAb-0059和-0170能够降低来自单核细胞的嗜中性粒细胞诱导的TNFa释放。
嗜中性粒细胞自人健康供体全血中分离，重新悬浮于RPMI/10% FBS中，并以1.5x10E5个细胞/孔接种在聚-D-赖氨酸包被的组织培养96孔板(Corning，3841)中。然后在37℃、5% CO2培养箱中，将嗜中性粒细胞用1ng/ml PMA (Sigma，P1585) + 20μg/ml PGN-SA (InVivogen，tlrl-pgnsa)刺激24小时。细胞然后用培养基轻轻洗涤3次后，加入到新分离的单核细胞。使用EasySep试剂盒(StemCell Technologies，19059)，从健康供体血沉棕黄层中分离单核细胞，并以5x10E4个细胞/孔接种到已含有洗涤过的活化嗜中性粒细胞的孔中。按1μg/ml加入下列抗体：mAb-0059、mAb-0170或hIgG4同种型对照。然后再培养细胞24小时后，收获上清液。将上清液在RPMI/10%FNS中1:10稀释后，通过ELISA (eBioscience，BMS223INST)测量TNFa。
表24
该实施例说明激活的嗜中性粒细胞可以TREM-1依赖性方式刺激单核细胞产生TNFa，并且这可被mAb-0059和mAb-0170抗TREM-1抗体阻断。抗TREM-1抗体因此可有效地用于减量调节单核细胞反应。
虽然本文说明和描述了本发明的某些特征，但许多修改、替换、改变和等同内容现在对于本领域普通技术人员是显而易见的。因此，要了解随附权利要求书旨在包括所有这类修改和改变，如同落入本发明的真实精神内。
机译： 结合并阻断在髓样细胞1（TREM-1）上表达的触发受体的抗体
机译： 结合并阻断髓样细胞1（TREM-1）中表达的触发受体的抗体
机译： 结合并阻断在髓样细胞1（TREM-1）上表达的触发受体的抗体
