脂质化的抗原及其于增强免疫学反应的应用

摘要

本发明的Ag473，为一种脑膜炎双球菌Neisseria Mengitidis的脂蛋白，是用以制造高量的重组脂蛋白，以作为一种佐剂使用。尤其，Ag473的前40个残基（D1功能域）与登革热病毒外膜蛋白的非脂质化的一致功能域III，E3（rlipo-D1E3）融合。将rlipo-D1E3投予小鼠，可促使TLR2介导脾细胞增生，且TLR2介导由骨髓衍生的树突细胞特异性制备细胞激素，并经由TLR2活化NF-κB传讯途径。N-端脂质化片段的特征在于，其中专一性N-酰基-S-二酰基甘油基-CSQEAK片段已被确定。以其投药可增加由骨髓衍生的树突细胞与经由TLR2的NF-κB传讯途径，且与特定肿瘤抗原（E7）组合时，可增加肿瘤生长抑制作用。

说明书

技术领域

本发明是关于脂肽或脂蛋白，特别是关于含有Ag473脂质化序列的脂 肽或脂蛋白，以及其相关的组成物及相关的制造与使用方法。

背景技术

疫苗接种被认为是用来预防病原体感染的最有效且最具效率的方式。 然而，至今仍有许多感染性疾病尚无可利用的疫苗，或还未能达到足够的 免疫作用。此外，许多疫苗因为其效能太低、会产生严重副作用、稳定性 低或是价格昂贵而不适用。因此，亟需研发出更有效的疫苗或相关试剂。

疫苗含有用以诱发保护性免疫反应的衍生自病原体的抗原性物质，例 如蛋白质。一般而言，经修饰的蛋白质（例如经脂质化的蛋白质）较未经 修饰的蛋白质更具致免性。某些疫苗产品中的蛋白质系藉由使用重组技术 在大肠杆菌中表现而制备得。但是，大肠杆菌通常被认为不适合用来制造 经修饰的蛋白质，包括经脂质化的蛋白质。更特别地，大肠杆菌细胞将天 然具有脂质化的蛋白质脂质化的执行力差，也不会制造出呈现经脂质化形 式的非天然具有脂质化的蛋白质。

发明内容

本发明（至少一部份）是基于意外发现(1)一种Ag473的脂质化序列可 促使具有该脂质化序列的融合蛋白进行脂质化作用；及(2)经脂质化的融合 蛋白或其片段不仅本身具有高致免性，且能够增强其他抗原的致免性。

前述的Ag473为一种脑膜炎双球菌Neisseria Mengitidis的脂质蛋白质， 是由四个功能域（SP及功能域1-3）所组成。以下列示此蛋白质具有四个 已确定功能域的胺基酸序列（SEQ ID NO:1）：

Met Lys Lys Leu Leu Ile Ala Ala Met Met Ala Ala Ala Leu Ala Ala Cys

        40                45                50

55                60                65                 70

    75            80            85            90

        95            100            105

 110            115            120

SP：SEQ ID NO:1中的胺基酸残基1-17（下划线表示，SEQ ID NO:2）

功能域1：SEQ ID NO:1中的胺基酸残基18-40（高亮标示，SEQ ID NO: 3）

功能域2：SEQ ID NO:1中的胺基酸残基41-71（粗体标示，SEQ ID NO: 4）

功能域3：SEQ ID NO:1中的胺基酸残基72-121（斜体标示，SEQ ID NO: 5）

D1：SEQ ID NO:1中的胺基酸残基1-40（SEQ ID NO:6）

D2：SEQ ID NO:1中的胺基酸残基1-71（SEQ ID NO:9）

D3：SEQ ID NO:1中的胺基酸残基1-121（SEQ ID NO:10）

于一方面，本发明特征在于提供一种具有式(I)结构的脂肽、脂多肽或 脂蛋白：

式(I)

R₁、R₂与R₃其中一者为C_14-20烯基，且其他二者各别独立地为C_14-20烷基或C_14-20烯基；X为长度1-100（例如，2-50、3-20或5-15）个胺基酸 残基的胺基酸序列。例如，R₂可为C_14-20烯基。R₁与R₃各别可为C_14-20烷基。 于一项具体态样，R₂为-(CH₂)₇-CH=CH-(CH₂)₅CH₃。而R₁与R₃各别为 -(CH₂)₁₄CH₃。于另一项具体态样，该脂肽或脂蛋白具有下列结构式：

尤其，该脂肽为：

X的N-端可与如式(I)所示与X相邻的羰基基团连接。X的长度可具有 3-20个胺基酸残基。例如，X具有序列SQEAK或SQEAKQEVK（SEQ ID NO: 7或8）。例如，该脂蛋白/脂肽可为Lipo-CSQEAK或Lipo-CSQEAKQEVK （SEQ ID NO:11或12）。

于一项具体态样，R₁、R₂与R₃其中一者为C_14-20烯基，且其他二者各 别独立地为C_16-20烷基或C_16-20烯基。例如，R₂或R₃其中一者为C_14-20烯基， 而R₁为C_16-20烷基。

术语“烷基”意指一种饱和、直链或支链烃部份。除非另行指定，其 包括1-30个碳原子。烷基的实例包括（但不限定于）–(CH₂)₁₃CH₃、 -(CH₂)₁₅CH₃、-(CH₂)₁₇CH₃及-(CH₂)₁₉CH₃。

术语“烯基”意指一种含有一、二、三或甚至三个以上双键的直链或 支链烃部份。除非另行指定，其包括2-30个碳原子。烯基的实例包括（但 不限定于）-(CH2)7-CH=CH-(CH2)5CH3。

本文所述的烷基与烯基包括经取代与未经取代部份。可能的取代基包 括（但不限定于）C_3-20环烷基、C_3-20环烯基、C_3-20杂环烷基、C_3-20杂环烯 基、C_1-10烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、胺基、C_1-10烷基胺 基、C_1-20二烷基胺基、芳基胺基、二芳基胺基、C_1-10烷基磺胺基、芳基磺 胺基、C_1-10烷基亚胺基、芳基亚胺基、C_1-10烷基磺酰亚胺基、芳磺酰亚胺 基、羟基、卤基、硫基、C_1-10烷硫基、芳硫基、C_1-10烷磺酰基、芳磺酰基、 酰基胺基、胺基酰基、胺基硫酰基、酰胺基、胍基、脲基、氰基、硝基、 亚硝基、氮基、酰基、硫酰基、酰基氧基、羧基及羧酸酯。

本发明还提供(1)一种包含或基本上由前述脂肽或脂蛋白组成的佐剂组 成物，及(2)一种含有抗原与该脂肽或脂蛋白的免疫生成性组成物。本发明 还关于一种在个体内诱发免疫学反应的方法，其包含将抗原与该脂肽或脂 蛋白投药予有其需要的个体。

“个体”意指人类及非人类动物。非人类动物的实例包括所有脊椎动 物，例如哺乳动物如非人类灵长类（特别是高等灵长类）、狗、啮齿类（例 如小鼠或大鼠）、天竺鼠、猫及非哺乳动物如鸟类。于一项较佳具体态样， 该个体为人类。于另一项较佳具体态样，该个体为实验动物或适合做为疾 病模式的动物。

本发明包含一种制备前述脂肽或脂蛋白的方法。该方法包括提供一宿 主大肠杆菌细胞，其含有编码具有脂质化序列的第一片段的蛋白质的核酸， 该脂质化序列包括SEQ ID NO:3或1、6、7、8、9或10的序列；将大肠杆 菌宿主细胞于培养基中，于可使该蛋白质表现呈脂质化形式的条件下进行 培养；以及将该蛋白质的脂质化形式从该细胞或该培养基中分离出。或者， 可将该核酸于活体外进行转录及转译，例如使用T7启动子调节序列与T7 聚合酶，于得自（例如）大肠杆菌的细胞溶解产物中进行。一种例举性脂 质化融合蛋白（从N-端至C-端）可包括Ag473的SP与D1功能域(D1)， 及登革热病毒外膜蛋白功能域III(E3)。此重组脂质蛋白系命名为 rlipo-D1E3。该方法可进一步包括将该蛋白质以蛋白酶处理，而产生脂肽（例 如下列实施例中所述的lipo-Nter）的步骤。该核酸对于该细胞可为异源性的。

经分离的蛋白质、多肽或肽类意指实质上已不含在天然状态下与其缔 合的分子，例如其纯度至少达75%（也即，任何介于75%至100%的数值） 的重量百分比。可藉由任何适当的标准方法，例如藉由管柱层析术、聚丙 烯酰胺凝胶电泳术或HPLC分析法来测量纯度。经分离的肽、多肽或蛋白 质可分离自天然来源、经由重组DNA技术制造，或是藉由化学方法制得。

术语“蛋白质”与“多肽”用于本文是可交替地用于描述任意胺基酸 长链，而不论其链长或是否具有转译后修饰（例如糖基化或磷酸化）。因此， 术语“本发明的多肽”包括：本发明全长、天然的蛋白质；经重组或合成 方法制得的相当于本发明全长天然蛋白质的多肽；或该天然蛋白质的特殊 功能域或部份。该术语也包含具有所添加的胺基-末端甲硫胺酸（可用于在 原核细胞中表现）的成熟多肽。肽意指其长度足够以合成方式从连续胺基 酸制得的短链。通常，肽的长度为50个胺基酸残基或更短（例如长50、40、 30、20、10或5个残基）。

异源性多肽、核酸或基因系指其来源自外来物种者，或是（若物种相 同）实质上从其原始形式经过修饰的。两种经融合的功能域或序列，若它 们在其天然蛋白质或核酸状态下不相邻，则对它们而言互相为异源性的。

于下述实施方式中进一步详述本发明的一或多项具体实施态样。本发 明的其他特征或优点将藉由下列图式与实施例的详述，以及亦自所附申请 专利范围彰显出来。

附图说明

图1a与1b显示衍生自rlipo-D1E3的lipo-Nter(Lipo-CSQEAK,SEQ ID  NO:11)使用质谱进行鉴定(a)及分离(b)的结果。

图2a-f显示合成型脂肽与经纯化的rlipo-D1E3 N-端片段的鉴定结果。

图3a-3c显示经以rlipo-D1E3刺激后于取自TLR2-/-、TLR4-缺陷型及 野生型小鼠的脾脏细胞中的DNA合成。

图4a-4c显示rlipo-D1E3对于衍生自野生型、TLR2-缺陷型及TLR4-缺 陷型小鼠的树突细胞的影响。数据以得自三次独立实验的平均值±SD表示。 □，野生型；TLR4-缺陷型小鼠；■，TLR2-缺陷型小鼠。

图5a与5b显示经由TLR2诱发NF-kB传讯作用。数据代表得自三重 复样本的平均值±SD。

图6a与6b显示于鼠类骨髓-衍生的树突细胞(BM-DCs)中对p38、 ERK1/2、JNK1/2的活化作用。

图7为一组图显示于鼠类BM-DCs中细胞激素或趋化激素的基因表现 情形。所示数据为两次独立实验的代表值。

图8为一组图显示lipo-Nter能够刺激骨髓-衍生的树突细胞分泌TNF- α与IL-12p40。

图9显示lipo-Nter与重组突变型E7(rE7m)组合能够增强抗-E7抗体。

图10显示lipo-Nter与rE7m组合能够增加肿瘤生长抑制能力。

图11显示lipo-Nter与RAH(来自E7的胜肽)组合能够增加肿瘤生长抑 制能力，但是RAH与合成型脂肽Pam3则不能抑制肿瘤生长。

具体实施方式

本发明是关于新颖的脂蛋白或脂肽类，其可用做为用以增强疫苗效能 的佐剂。位于这些脂蛋白或脂肽类N-端的脂质部份负责提供佐剂活性。该 脂质部份可为二酰基或三酰基化脂质。

脂蛋白可利用一种脂质化序列制造得。术语“脂质化序列”意指一种 非天然胺基酸序列，其(a)包括与Ag473的SP具有同一性至少达80%（85%、 90%、95%或99%）的第一片段，及与Ag473的功能域1具有同一性至少 达80%（85%、90%、95%或99%）的第二片段，该第一片段位于该脂质化 序列的N-端；且(b)有助于在大肠杆菌中将在其N-端带有该脂质化序列的 多肽或蛋白质（亦即，融合蛋白质）脂质化。于该脂质化序列中，第一片 段直接或经由连接肽而连接至第二片段。较佳地，此序列具有最大长度为 40-100（例如，40-80）个胺基酸。于一项实例，本文中所描述的脂质化序 列包括SP与功能域1。

如用于本文，两种胺基酸序列的“同源性百分比”是使用经描述于Karlin 与Altschul，Proc,Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268,1990的算法（其修改 描述于Karlin与Altschul，Proc,Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877,1993）而 测定得。此种算法被纳入Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-410,1990所 述的NBLAST及XBLAST程序中。BLAST蛋白质搜寻以XBLAST程序来 执行，分数=50，字长=3，而获得相对于参考多肽的序列同源性。为达比 较目的而得到具有空隙的比对，遂使用如Altschul等人，于Nucleic Acids Res. 25:3389-3402,1997所述的具空隙BLAST(Gapped BLAST)。当利用BLAST 与具空隙BLAST程序时，使用这些各别程序（例如XBLAST与NBLAST） 的不履行参数。参见，网站www.ncbi.nlm.nih.gov。

“肽”意指聚合物中的胺基酸残基排列。肽可由标准20种天然胺基酸 组成，此外也可包含稀有胺基酸与合成的胺基酸类似物。“重组肽”意指藉 由重组DNA技术制得的肽；也即从经由编码所希望肽的外源DNA构体转 形的细胞制得。“合成肽”意指藉由化学合成制得的肽。

前述融合蛋白可以合成多肽或重组多肽的形式获得。对于重组多肽的 制备，可将编码该多肽的核酸与另一编码融合伙伴，例如谷胱甘肽-S-转移 酶(GST)、6x-His抗原表位标签或M13基因3蛋白的核酸连接。可将经分离 的融合蛋白进一步（例如）藉由酵素分解作用处理，以将融合伙伴移除而 获得本发明的重组脂蛋白或脂肽。

在本发明的一项具体态样，将前述所提及的脂质化序列连接至登革热 病毒cED III而形成一种融合蛋白质（rlipo-D1E3），当其藉由熟知重组技术 在大肠杆菌中进行表现时，呈脂质化形式。以下描述一种实例。将编码脂 质化序列的DNA片段与编码登革热病毒cED III的DNA片段，插入一种表 现载体（其较佳地带有强启动子，例如T7、T5、T3或SP6）中，而构筑得 表现质体。该强启动子可为可诱导性，例如可被异丙基β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导。接着将该表现质体导入大肠杆菌宿主菌株中，并将显示为阳性 的转形株培养于适于蛋白质表现的条件下。较佳地，该大肠杆菌宿主菌株 对于因过度表现外源性蛋白质所诱导的毒性作用具有抗性。此类大肠杆菌 菌株可经由美国专利案号6,361,966中所描述的方法鉴定/产生。此等大肠杆 菌菌株的实例包括（但不限定于）C43(DE3)(ECCC B96070445)、C41(DE3) (ECCC B96070444)、C0214(DE3)、DK8(DE3)S(NCIMB 40885)及C2014(DE3) (NCIMB 40884)。

较佳地，将经此所表现得的融合蛋白质从大肠杆菌宿主细胞分离出， 并且经由该项技艺已知方法，例如以抗-脂蛋白抗体进行的免疫转渍法，或 质谱分析法确认其脂质化状态。

融合蛋白质可进一步进行蛋白酶处理，而产生较小的脂蛋白或肽类。 此等脂蛋白或肽类可用于，用以在个体（例如人类个体）产生对抗各种抗 原的免疫生成组合物（例如，疫苗）中做为佐剂。此类组成物可（例如） 以下述方法，或藉由该项技艺中已知的任何其他相等方法制备得。

分枝杆菌脂蛋白会影响先天与适应性免疫作用。彼等已显示可诱导抗 微生物活性，并经由类-Toll受体引发宿主防御机制。而且，有数种分枝杆 菌脂蛋白已证明是引起对抗分枝杆菌的体液与细胞免疫反应的重要诱导 剂。除了引起免疫系统的活化作用以外，脂蛋白已经鉴定为结核分枝杆菌(M. tuberculosis)、猪鼻霉浆菌(Mycoplasma hyorhinis)及白密螺旋体(Treponema  pallidum)的主要抗原。

布氏疏螺旋体Borrelia burgdorferi的外表面蛋白(OspA)是一种Braun脂 蛋白(BLP)。OspA为藉由脂质化N-端半胱胺酸而结合固定于膜上的31kDa 单体蛋白质。已显示，以全长OspA进行免疫能保护小鼠、狗及恒河猴对抗 布氏疏螺旋体。然而，未脂质化OspA蛋白的保护作用并不完全，且不能引 发对布氏疏螺旋体的保护性免疫（Bockenstedt等人1993,J Immunol 151: 900-906；Johnson等人1995,疫苗Vaccine 13:1086-1094）。于1998年，重组 脂蛋白OspA已获得美国FDA核准为第一种疾病疫苗(LYMErix,SmithKline Beecham)。虽然OspA是一种有效的疫苗，但使用全长OspA做为疫苗有引 起自体免疫反应危险的疑虑（Gross等人1998,科学Science 281:703-706）， 而且该疫苗已被停用。

除了OspA以外，已证明BLPs在将人类内皮细胞刺激成发炎表型方面， 与脂多糖(LPS)具有相同活性。然而不像LPS，由BLP诱导的耐受性可保护 小鼠对抗、活菌及多种微生物引发的致死性。反之，LPS耐受性只能提供 对抗LPS致死效应的保护作用。

Braun已于1973年提出细菌蛋白具有N-酰基-S-二酰基甘油基-半胱胺 酰基修饰。之后，已在所有细菌中鉴定出Braun脂蛋白(BLP)（Madan Babu 与Sankaran 2002,生物信息学Bioinformatics），且其可为结构蛋白、酵素、 受体或是在膜-水界面执行必要功能的载运蛋白。然而，有许多脂蛋白已在 各种细菌中被鉴定出其失去N-端脂肪酸，而制造出二-酰基化脂质。二或三 -酰基化脂蛋白已显示能经由TLR2-介导的传讯途径活化免疫反应。TLR2 可根据N-端脂肪酸链的长度及C-端胺基酸的电荷，与TLR1或TLR6形成 双体，表示细菌脂蛋白N-端部份的不同脂质构造会诱导不同层级的下游基 因表现，并促使调节免疫反应。

大肠杆菌表现系统（包括各种变异株）已被广泛用于制造同源及/或异 源性蛋白质。然而，在具有趋异脂蛋白讯号肽的大肠杆菌中过度表现脂蛋 白，往往会导致修饰不完全或是脂质部份完全缺失。差的脂质修饰作用可 藉由将标靶基因与不同讯号肽融合来加以改善。此等方法可使脂蛋白的表 现量增加到可被免疫转渍法侦测到的程度，或可达到总体细胞蛋白质的 3%。对于制造重组脂质化免疫原（脂质-免疫原）而言，能以高量过度表现 脂蛋白仍然是一项挑战与障碍。

为解决上述挑战与障碍，本案发明人曾研发一种高产量的脂蛋白表现 系统，并鉴定出一种必要的引导序列（参见美国申请案20090176273）。此 表现系统被用来表现一种含有登革热病毒外膜蛋白功能域3的异源性脂蛋 白。

已制得此重组lipo-D1E3(rlipo-D1E3)蛋白，并针对其生物功能进行分 析。所预期含有不饱和脂肪酸的N-端脂质结构，与得自已知细菌脂蛋白的 不相同。脂质部份推定的结构含有一位于N-端位置的十六酰基部份、一酰 基部份及一位于二酰基甘油残基上的不饱和脂肪酸。rlipo-D1E3可活化由骨 髓衍生的树突细胞，而增加细胞激素(IL-1α、IL-23与IL-27)及趋化激素(MIP α与MCP)RNA转录产物。不同的基因表现情形可反应出不同的免疫调节 效应。

如本文所述，rlipo-D1E3(lipo-Nter)的N-端部份是藉由以胰蛋白酶分解， 并使用液相层析术进行纯化而获得。纯化得到的lipo-Nter经发现能够活化 由骨髓衍生的树突细胞，并经由TLR2活化NF-κB传讯作用。于lipo-Nter 存在下，以突变型（或去毒性）HPV E7蛋白免疫小鼠可增强体液（抗体力 价）及细胞免疫反应（抗-肿瘤效应）。还发现，lipo-Nter可增加CTL抗原 表位肽（衍生自HPV E7蛋白）的抗-肿瘤功效，其抗-肿瘤功效较合成型三 棕榈酰基脂肽强。此等数据显示经纯化的lipo-Nter可用做为增强抗原-特异 性体液及细胞免疫作用的佐剂。换言之，经纯化的N-端片段可用做为增进 抗体力价及细胞毒性T淋巴细胞杀害作用的佐剂。

意外发现，rlipo-D1E3的脂质部份含有佐剂活性。甚至更意外地， rlipo-D1E3的经纯化N-端可与有潜能的疫苗候选剂组合，而增强T或B细 胞免疫反应。因此，本发明特征在于提供一种含有重组脂蛋白或其N-端脂 质部份的佐剂。

关于制造本发明的脂蛋白/多肽，可将宿主细胞于培养基中，于使能表 现得由本发明的核酸所编码的融合蛋白/多肽的条件下进行培养，并将该融 合蛋白/多肽从培养细胞或细胞培养基中纯化出。或者，将本发明的核酸于 活体外进行转录及转译，例如使用T7启动子调节序列与T7聚合酶，于得 自（例如）大肠杆菌的细胞溶解产物中进行。该脂质化融合蛋白（从N-端 至C-端）可包括Ag473的D1功能域，及登革热病毒外膜蛋白功能域III。 可藉由使用胰蛋白酶分解该rlipo-D1E3，然后使用逆相液态层析术(LC)进行 纯化而获得N-端脂质部份。经发现LC方法能够分离得，使用在线质量分 析时差异14原子质量单位(Atomic mass unit;amu)的脂肽。

此前述的脂质化蛋白/肽可与医药上可接受的载体，例如磷酸盐缓冲食 盐水、碳酸氢盐溶液混合而制得佐剂组成物。用于本文，“佐剂”意指添加 于致免性组成物或疫苗中以增加该致免性组成物或疫苗的免疫生成性的物 质。术语“疫苗”意指任何欲投药予个体，以在该个体内产生或以人工方 式增加对特定疾病的免疫反应。疫苗的实例包括下述记载的内容。

本发明的佐剂可用于增强对于疫苗调配物中某一抗原的免疫反应。本 发明的佐剂可与衍生自任何细菌或任何病毒的抗原合用，条件为该抗原不 会被破坏或变性。佐剂也可用于其含有如美国专利5,616,328及5,084,269 所述的抗原的疫苗组成物。其可用于与任何会引起体液与/或细胞介导的免 疫反应的物质结合，例如可与活病毒、细菌或寄生虫抗原；经去活化的病 毒、由肿瘤衍生的、原生生物的、由生物体衍生的、真菌的或细菌的抗原、 类毒素、毒素；自身抗原；多醣类；蛋白质；醣蛋白；肽类；细胞疫苗； DNA疫苗；重组蛋白质等；用于与(例如)BCG、霍乱、鼠疫、伤寒、A型 肝炎、B型肝炎、C型肝炎、A型流感、B型流感、副流感、小儿麻痹、狂 犬病、麻疹、耳下腺炎、德国麻疹、黄热病、破伤风、白喉、嗜血型流感b、 结核病、与肺炎球菌疫苗、腺病毒、HIV、鸡痘病毒、细胞巨大病毒、登革 热病毒、猫白血病、禽类瘟疫、HSV-1与HSV-2、猪霍乱、日本脑炎、呼 吸道融合病毒、轮状病毒、乳突状瘤病毒、黄热病毒及阿滋海默氏症连结。 特别地，诸如不会引起强烈免疫反应的重组蛋白质、醣蛋白与肽类可用于 与本发明的佐剂结合。

于某些具体态样，抗原可为癌症抗原或肿瘤抗原。术语癌症抗原及肿 瘤抗原可相互交换，且意指由癌细胞差异性表现的抗原。因此，癌症抗原 可利用于差异性靶定对抗癌细胞的免疫反应。癌症抗原可因此有效刺激肿 瘤-专一性免疫反应。某些癌症抗原可能系由正常细胞编码（虽然实际上并 不表现出来）。此等抗原中有些可经确定为在正常细胞中是正常缄默型（亦 即不被表现），有些只在某些分化阶段被表现，而有些则暂时性表现（例如 胚胎与胎儿抗原）。其他癌症抗原可由诸如致癌基因（例如经活化的ras致 癌基因）、抑制因子基因（例如突变型p53）等突变型细胞基因编码，或为 由于内部缺失或染色体易位造成的融合蛋白质。又有些其他癌症抗原可由 病毒基因，例如这些由RNA及DNA肿瘤病毒携带的基因编码。

肿瘤抗原的实例包括MAGE、MART-1/Melan-A、gp100、二肽酰基肽 酶IV(DPPUV)、腺苷脱胺酶-结合蛋白(ADAbp)、亲环素(cyclophilin)b、结 直肠相关抗原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其抗原决定肽 CAP-1与CAP-2、etv6、aml1、前列腺专一性抗原(PSA)及其抗原决定肽 PSA-1、PSA-2与PSA-3、前列腺专一性膜抗原(PSMA)、T-细胞受体/CD3- 仄他链、肿瘤抗原的MAGE-家族(例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、 MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、 MAGE-A10、MAGE-A11、MAGEA12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3 (MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3, MAGE-C4、MAGE-C5)、肿瘤抗原的GAGE-家族(例如GAGE-1、GAGE-2、 GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、 BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪胺酸酶、p53、 MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、α-胎蛋白、E-钙黏附素(cadherin)、 α-连环素(catenin)、β-连环素、γ-连环素、p120ctn、PRAME、NY-ESO-1、 cdc27、腺瘤性息肉(Adenomatous polyposis coli)蛋白(APC)、胞衬蛋白、连 接蛋白(Connexin)37、Ig-个体遗传型、p15、gp75、GM2与GD2神经节 苷、病毒产物例如人类乳头状瘤病毒蛋白、肿瘤抗原的Smad家族、Imp-1、 P1A、EBV-编码的核抗原(EBNA)-1、脑肝醣磷酸酶、SSX-1、SSX-2 (HOM-MEL-40)、SSX-3、SSX-4、SSX-5、SCP-1与CT-7及c-erbB-2。

癌症或肿瘤及专一性肿瘤相关抗原包括(但不限定于)急性淋巴生成性 白血病(etv6、aml1、亲环素b)、B细胞淋巴瘤(Ig-个体遗传型)、神经胶瘤(E- 钙黏附素、α-连环素、β-连环素、γ-连环素、p120ctn)、膀胱癌(p21ras)、胆 囊癌(p21ras)、乳癌(MUC家族、HER2/neu、c-erbB-2)、子宫颈癌(p53、p21ras)、 结肠癌(p21ras、HER2/neu、cerbB-2、MUC家族)、结直肠癌(结直肠相关抗 原CRC)-CO17-1A/GA733、APC)、绒毛膜癌(CEA)、上皮细胞癌(亲环素b)、 胃癌(HER2/neu、c-erbB-2、ga733醣蛋白)、肝细胞癌(α-胎蛋白)、哈金氏淋 巴癌(Imp-1、EBNA-1)、肺癌(CEA、MAGE-3、NY-ESO-1)、淋巴细胞衍 生的白血病(亲环素b)、黑色素瘤(p5蛋白、gp75、癌胚胎抗原、GM2与 GD2神经节苷、Melan-A/MART-1、cdc27、MAGE-3、p 21ras、gp100)、骨 髓瘤(M UC家族、p21ras)、非小细胞肺癌(HER2/neu、cerbB-2)、鼻咽癌(Imp-1、 EBNA-1)、卵巢癌(M UC家族、HER2/neu、c-erbB-2)、前列腺癌(前列腺专 一性抗原(PSA)及其抗原决定肽PSA-1、PSA-2与PSA-3、PSMA、HER2/neu、 c-erbB-2、ga733醣蛋白)、肾癌(HER2/neu、c-erbB-2)、颈与食道的鳞状细 胞癌(病毒产物例如人类乳突状瘤病毒蛋白)、睾丸癌(NY-ESO-1)及T细胞白 血病(HTLV-1抗原表位)。

本发明的佐剂可用于欲免疫动物的疫苗调配物中。因此，本发明的范 围包含一种含有抗原剂与佐剂的免疫生成性或疫苗组成物。该佐剂含有前 述的脂蛋白/肽，且一旦经投药至个体后，可增强该个体对于该抗原剂的免 疫反应。术语“免疫生成性”意指可在宿主动物中产生对抗一或多种抗原 的能力。此免疫反应形成由对抗特定感染性生物体的疫苗引起的保护性免 疫作用的基础。“免疫反应”意指一种于动物体内引发的反应，其可指细胞 性免疫作用(CMI)；体液免疫作用或该二者。“抗原剂”、“抗原”或“免疫 原”意指于宿主动物体内诱发特异性免疫反应的物质。抗原可含有完整生 物体(已杀死、经减弱或活的)；生物体的一次单位或部分；含有一免疫生成 特性插入物的重组载体；能够在展示于宿主动物时诱导免疫反应的DNA片 段；蛋白质、多肽、半抗原或其任意组合。另供选择地，该免疫原或抗原 可包含毒素或抗毒素。术语“动物”包括所有脊椎动物(包含人类)。尤其， 术语“脊椎动物”包括（但不限定于）人类、犬类（例如狗）、猫类（例如 猫）、马类（例如马）、牛类（例如牛）、猪类（例如猪）以及鸟类。术语“鸟 类”意指任何在分类学上归属于鸟纲的各种或次种，例如（但不限定于） 鸡类（繁殖鸡、嫩鸡与蛋鸡）、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉、鹦鹉、雀类、鹰 及走禽类包括鸵鸟、食火鸟与食火鸡。

于一项具体态样，疫苗调配物含有本发明的佐剂与一抗原。疫苗调配 物中所含各组成的最适比例可由技术师决定，且为习于该项技艺者已熟知 者。

疫苗调配物可自身，或可呈医药或治疗组成物的形式投药予个体。包 含本发明佐剂与抗原的医药组成物可藉由熟知的混合、溶解、粒化、包覆 糖衣、磨光、乳化、胶封、固陷或冻干等方法制得。医药组成物可以熟知 方法，使用一或多种有助于将本发明的抗原加工成，可于制药上使用的制 剂的生理学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或辅助剂。依所选择的投药 途径而决定适合的调配物。

为本发明申请案的目的，“生理学上可接受的载体”包含其对于人类或 动物用途是可接受，而不会产生相对上有害的副作用（相对于受治疗的病 况）的载体，以及同样是可接受的稀释剂、赋形剂或辅助剂。载体必须为 “可接受的”还意指，其可与组合物中的活性成份兼容，且较佳地，能够 使活性成份安定，而不会对受治疗个体产生有害影响。载体以投药模式与 途径，以及标准制药操作为基础而进行选择。适宜的医药载体与稀释剂， 及供它们使用的必需品，是经描述于雷明顿氏制药科学（Remington's  Pharmaceutical Sciences）中。于一项实例，是将融合蛋白质与佐剂混合而形 成可用于免疫调节的组成物。此组成物可制备呈可注射液，呈液态溶液或 乳液。参见，美国专利案4,601,903；4,599,231；4,599,230及4,596,792。

全身性调配物包括这些经设计用于经由注射（例如，皮下、真皮内、 肌肉内或腹膜内注射）投药者。用于注射，可将疫苗制剂可调配于水溶液， 较佳地于生理学上可兼容的缓冲液，例如汉克氏(Hanks's)溶液、林格氏 (Ringer's)溶液、磷酸盐缓冲食盐水或任何其他生理食盐水缓冲液中。溶液 可含有调配剂例如悬浮剂、安定剂及/或分散剂。或者，蛋白质可呈用以于 使用前与适合载剂（例如灭菌无热原水）建构的粉末形式。

决定疫苗调配物用于投药的有效量，属习于该项技艺者的能力范围内， 特别是按照本说明书所载的详细揭露。有效剂量最初可由活体外分析进行 评估。例如，可于动物模式中调配剂量，以达到使用该项技艺已熟知的技 术来诱发免疫反应。该项技艺中具有通常知识者可基于本文所述结果，容 易地决定最适用于所有物种的投药方式。可个别判断使用剂量与间隔时间。 例如，当使用做为疫苗时，本发明的疫苗调配物可以1至3次剂量投药达 1-36周。较佳地，投药1或2次剂量，间隔约3周至约4个月，之后可定 期施予追加疫苗注射。交替投药方式可适用于个别动物。疫苗调配物的适 宜剂量为当如前述方式投药时，能够在受免疫动物体内引发足以保护该动 物不受感染达至少4至12个月的免疫反应的量。一般而言，一剂型中所存 在的抗原量介于约1pg至约100mg每公斤宿主，代表性地是从约10pg至 约1mg，且较佳地是从约100pg至约1μg。适宜的剂量范围将随着注射途 径及患者大小而改变，但是代表性地是介于约0.1mL至约5mL。

该佐剂组成物中还可包括其他佐剂。佐剂的实例包括（但不限定于） 霍乱毒素、大肠杆菌热不安定性内毒素、脂质体、免疫刺激复合体(ISCOM)、 免疫刺激性序列寡脱氧核苷酸及氢氧化铝。组成物还可包括有助于活体内 递送的聚合物。参见Audran R.等人，疫苗21：1250-5,2003；及Denis-Mize 等人Cell Immunol.225:12-20,2003。

前述任一医药组成物可非经肠地道，例如藉由皮下注射或肌肉内注射 进行投药。或者，可希望其他投药形式包括栓剂与口服调配物。对于栓剂， 可包括黏着剂与载体，例如聚烷二醇类或三酸甘油酯类。口服调配物可包 括正常使用的赋形剂，例如制药级糖精、纤维素、碳酸镁等类。这些组成 物采取溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放调配物或粉末的形式。

前述融合蛋白可用于免疫生成性组成物（例如疫苗），以供在个体中产 生对抗某一抗原的抗体与免疫反应。疫苗可以与该剂量调配物兼容的方式， 及以治疗上有效、具保护性且可产生免疫作用的量进行投药。所投药的量 取决于欲受治疗的个体，例如包括该个体的免疫系统合成抗体，及（若需 要）产生细胞介导的免疫反应的能力。活性成份所需投药的确切量视专业 医师的判断而定。然而，适宜的剂量范围可由习于该项技艺者容易地，且 可依照本发明多肽的微生物决定。适用于最初投药及追加剂量的疗程也为 可变，但可包括最初投药与接着的后续投药。疫苗的剂量也可视投药途径 而定，且根据宿主的大小而变化。

组合物的剂量（例如）取决于特定多肽/蛋白质、是否有共投药额外的 佐剂、共投药佐剂的类型、投药型式与频率，诚如习于该项技艺者可决定 的。若需要可由习于该项技艺者决定是否重复投药。可自该个体采集血清 或T-细胞，以供测试由对抗所兴趣抗原的组成物引发的免疫反应。对抗某 一蛋白质或感染的抗体或细胞毒性T细胞的分析方法为该项技艺已熟知者。 若需要可给予额外追加剂量。藉由改变多肽/蛋白质含量、组成物剂量及投 药频数，可将免疫程序最适化以引发最大免疫反应。于大规模投药之前， 可希望测试其有效性。于有效性测试中，可藉由口服或非经肠道途径将本 发明组成物投药予非人类个体（例如，小鼠、大鼠、兔子、马、猪、牛或 猴子）。经过最初投药或视需要的追加投药后，可将测试个体与对照组个体 （接受伪装投药）以所兴趣抗原进行挑战，来测试该组成物的效能。

以下的特别实施例仅为例举说明，并非意欲以任何方式限制本发明揭 示的其余部份。无需进一步详细描述，据相信习于该项技艺人士可基于本 文中的描述，利用本发明至其最完全程度。所有于本文中引用的公开文献， 皆以其完整性以引用方式纳入。而且，下述所提出的机转不应以任何方式 限制本发明的范围。

实施例1

于本实施例，使用TLR2剔除(TLR2-/-)小鼠与TLR4-缺陷小鼠，研究具 有本质佐剂特性的原型登革热疫苗脂质-免疫原(rlipo-D1E3)的效应物机转 与传讯途径。我们的结果显示，rlipo-D1E3经由TLR2（而非经由TLR4） 活化抗原展示细胞，且由rlipo-D1E3介导的传讯途径启动也与其他两种 TLR2促动剂（Pam3及MALP-2衍生物双酰氧基丙半胱胺酸(BPPcysPEG)） 的类似（Basinski等人(2007)Int Arch Allergy Immunol 142,91-8）。令人感 兴趣地，我们发现经刺激的抗原展示细胞会较Pam3及BPPcysPEG诱发更 高的细胞激素与趋化激素的基因表现。这些数据指出，促动剂的不同脂质 部份可能诱发不同的细胞激素或趋化激素表现以调节免疫反应。

材料与方法

试剂

所有化学品皆购自（圣路易市,MO）或（Darmstadt,德国）化学公司。 限制酶与接合酶购自新英格兰生物实验室(New England Biolabs,Inc.) （Beverly,MA）。用于选殖的引子得自Mission生物科技公司（台北,台湾）。 胰蛋白酶购自Promega公司(Madison,WI)，而用于质谱分析的基材也购自 Promega公司(Madison,WI)。合成肽S-[2,3-双十六酰氧基-[2R]-丙基-[R]- 半胱胺酰基-酰胺基聚乙二醇(BPPcysPEGdef1375;BPPcysPEG)是由M. Klein博士（AmVac,瑞士）慷慨赠与，而Pam3CSK4（N-十六酰基-S-[2,3- 双十六酰氧基丙基]半胱胺酰基-SKKKK）(Pam3)购自InvivoGen(San Diego, CA)。NF-κB-依赖性启动子萤火虫荧光素酶系由S.-F.黄博士（国家卫生研 究院(NHRI)，台湾）慷慨赠与。pRL-TK（固有性地表现Renilla荧光素酶的 质体）购自Promega公司(Madison,WI)，而质体phTLR2flag购自Addgene (Cambridge,MA)。

细胞株与小鼠

HEK293细胞（一种人类胚胎肾细胞株）培养于补充以10%FBS、1%PS 的DMEM培养基。TLR4-缺陷小鼠(C3H/HeJ)与TLR2剔除小鼠购自Jackson 实验室，并豢养于NHRI的动物中心。C57BL/6与C3H/HeN购自台湾国家 动物中心。所有研究皆经过NHRI的学院动物照护与使用委员会准许。

重组脂质-免疫原及非脂质化免疫原的制造

以登革热病毒外膜蛋白(E3)的一致功能域III为基础，如陈等人(2009) Vaccine 27,1400-1409及Leng等人(2009)Microbes and Infection 11,288-295 所述的方法，制备得重组脂质化E3免疫原(rlipo-D1E3)及其非脂质化E3(rE3) 对应物。简言之，将E3基因（单独或已与编码SEQ ID NO:1中胺基酸残 基1-40的脂质化讯号DNA序列(SEQ ID NO:6)融合）选殖入载体pET-22b(+) 中，并将其于大肠杆菌C43(DE3)或BL21(DE3)中进行表现。藉由固定化金 属亲和性层析术(IMAC)将rlipo-D1E3及rE3纯化出，而于所得二制剂中的 脂多醣(LPS)残余量皆可忽略(<3EU/mg)。

质谱分析

对于Pam3样本的分析，取1μl与等体积的溶于乙腈(ACN)/0.1%三氟 乙酸(TFA)1:3(vol/vol)中的α-氰基-4-羟基肉桂酸标准溶液(Sigma,St.Louis, MO)混合。将一微升混合物置于标的平盘上以供进一步分析。将经纯化的 rE3与rlipo-D1E3对25mM碳酸氢铵(pH 8.5)进行透析。将经透析的样本与 胰蛋白酶（Promega Co.,Madison,WI）以50:1(wt/wt)的比例混合于25mM 碳酸氢铵(pH 8.5)中。令反应于室温下持续进行2分钟，然后藉由添加甲酸 （终浓度为1.2%）而终止反应。将经胰蛋白酶分解的肽装入已经过100% ACN洗涤并以0.1%TFA预先平衡的ziptip吸管尖中。将ziptip吸管尖经由 吸管吸取数次逐滴以0.1%TFA、70%ACN/0.1%TFA、100%ACN/0.1%TFA 及100%ACN冲洗。然后使用5ul 100%异丙醇将经胰蛋白酶分解的片段溶 析出，并于溶析后调整浓度至50%异丙醇。将一微升溶析出的片段与CHCA 基质混合，并使用MALDI-TOF-TOF质谱仪（Bruker AutoFlex III smartbeam  TOF/TOF200,Bruker Daltonics公司,Billerica,MA）

脾细胞增生分析

将取自C57BL6、TLR4-缺陷3H/HeJ或TLR2剔除(TLR2-/-)小鼠的脾细 胞以2x105/孔的浓度悬浮于96-孔平盘中，并于37°C,5%CO2下于增湿培 养箱中以脂肽或脂蛋白刺激48小时。于最后24小时培养期间，将1μCi 的[3H]-胸嘧啶加至各孔以测量DNA合成，再用FilterMate自动细胞收集器 （Packard,Meriden,CT）收取细胞。于TopCount微量平盘闪烁计读机 (Packard,Meriden,CT,USA).中测定并入的放射活度。该项分析纳入LPS (0.01μg/ml)做为阳性对照组。所有结果皆以平均cpm±标准偏差(SD)值表 示。

骨髓-衍生的树突细胞(BM-DCs)的制备

BM-DCs的收取方法如Lutz等人(1999)免疫学方法月刊Journal of  Immunological Methods 223,77-92所述。简言之，将6-8周龄雌性小鼠的股 骨与胫股取出，并将骨髓细胞藉由吸管剧烈吸放而分散。待以溶解缓冲液 去除红血球后，将分离的骨髓细胞以补充青霉素(100U/mL,Sigma,St Louis, MO)、链霉素(μg/ml,Sigma)、L-谷胺酸(2mM,Sigma)、巯基乙醇(μM, Sigma)及10%热去活化FBS的RPMI-10:RPMI-1640(GIBCO BRL，Grand  Island,NY)再悬浮使密度达2-5×10⁵细胞/ml。于第0、3及6天，将骨髓细 胞加至含有200U/mL(20ng/ml)溶于RPMI-10的重组粒细胞巨噬细胞集落 刺激因子(MoGM-CSF,Peprotech,Rocky Hill,NJ)的培养皿中。于第6天， 将所指定浓度的LPS、rE3、rlipo-D1E3或CpG加入。通常，不成熟的树突 细胞至多占总细胞族群的70%。使用流式细胞计量术于FACSCalibur(BD 生物科学,Franklin Lakes,NJ)针对经闸控的CD11c⁺细胞族群分析其细胞表 面标记的增量调节。

细胞激素ELISA分析

使用ELISA测定由BM-DC进行的细胞激素制造。将BM-DCs培养于 单独培养基，或补充有LPS(100nM)、rlipo-D1E3(100nM)、Pam3(100nM) 或CpG(10μg/mL)的培养基中。经过24-hr培育后，收取上清液并使用ELISA 分析(a)TNF-α、(b)IL-6及(c)IL-12(p40)。简述之，是将100μL抗-细胞激 素（10μg/ml的IL-6、IL-12p40、TNF-α）抗体（R&D system Inc.Minneapolis, MN）与0.1M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)覆盖于96-孔微量平盘上，随后于4℃ 下培育过夜。将经覆盖的平盘以0.05%Tween 20的PBS溶液清洗两次，然 后以存于PBS的5%脱脂牛奶于室温下进行封阻2小时。将得自经刺激的 BM-DC的稀释悬浮液加至有覆盖的孔中，于室温下静置2小时。接着添加 生物素-共轭的抗-细胞激素抗体（R&D system Inc.Minneapolis,MN）后， 将该分析以3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)进行显色，并藉由于每孔中添加 100μl 1M H₂SO₄终止反应。将平盘于450nm下使用ELISA计读机中 (Molecular Devices,CA)读取吸光值。将所得的值与未经刺激组所得的值相 减，而计算出细胞激素的制造量。

NF-kB荧光素酶报告蛋白分析

将HEK293细胞平布于24-孔平盘上（2x105细胞/孔），并以0.1μg 的pFLAG-TLR2、0.01μg的pNF-kB-luc及0.01μg的pRL-TK内在对照组 质体(Promega,Madison,WI)使用脂转染胺lipofectamine 2000(Invitrogen, Carlsbad,CA)进行共转感染。经24小时后，将转染细胞以各种合成型脂肽 或重组蛋白刺激24小时，将细胞溶解以使能利用双-荧光素酶报告蛋白分析 系统(Promega Co.,Madison,WI)测量荧光素酶活性。为达正常化的目的，将 萤火虫-荧光素酶活性与Renilla荧光素酶活性相关连。萤火虫与荧光素酶活 性皆使用Berthold Orion II发光计（Pforzheim,德国）进行监测。

西方转渍分析

将BM-DC于不含FBS的DMEM或RPMI培养基中生长16-18小时， 然后以100nM所指定的脂肽或脂蛋白于37°C下刺激10、20、40、60、90 或120分钟。然后将这些经处理的BM-DC于25mM HEPES、150mM NaCl、 1mM EDTA、1mM EGTA、10%甘油、1% Triton X-100、10mM焦磷酸钠、 20mM b-甘油磷酸酯、Na₃VO₄、10mM NaF、10mg/ml亮抑蛋白酶肽及1mM PMSF中进行溶解。使用BCA蛋白质分析套组(Pierce,Rockford,IL)测定溶 解产物的蛋白质浓度。以10% SDS-PAGE凝胶的每行加样五十微克溶解产 物进行电泳分析。将于凝胶中经解析的溶解产物转移至PVDF膜后，将该 膜以5%牛奶及0.05% Tween-20进行封阻。将膜与对抗p38、pp38、pERK1/2 或pJNK1/2的抗体于5%w/v BSA（溶于1xPBS与0.1%Tween-20）中进 行培育。抗-p38抗体是用做为各行蛋白质加样量的对照组。将膜使用 化学发光受质系统(Millipore,Billerica,MA)显色。以（pp38的密 度/p38的密度）计算相对磷酸化作用。

基因表现的实时定量PCR(qPCR)分析

使用小鼠DC富集套组(Invitrogen Dynal AS,Oslo,Norway) 根据制造商的指示，将BM-DCs纯化至纯度达60至90%。将经纯化的 BM-DCs使用单独培养基，或含有100nM的Pam3、BPPcysPEG或rlipo-D1E3 的培养基于37°C下进行刺激2或4小时。使用RNeasy小量套组(Qiagen, Valencia,CA)依照制造商的指示，从分离的细胞萃取出总体RNA。使用寡 -dT引子于20μl体积及SuperScript III RT(Invitrogen,Carlsbad,CA)中将 RNA(0.5–1μg)反转录成cDNA。使用小鼠通用探针库(UPL)组（Roche, Mannheim,德国）进行实时qPCR分析，以检测分离细胞族群中的基因表现 （刘等人(2007)J Leukoc Biol 82,354-360）。所使用的特定引子与UPL数 列示于下表。

表1.用于藉由实时PCR进行的RNA分析的UPL数与引子序列。所列 序列为用于由实时PCR侦测所指定基因产物而设计的序列。

反应混合物含有5ng cDNA、0.2μM引子与LightCycler 480 Probe Master(Roche)，且试剂于LightCycler 480系统(Roche)中进行反应。所有皆 使用于95°C进行10分钟的最初变性步骤，接着45次含于95°C进行10秒、 于60°C进行20秒及于72°C进行2秒的循环而完成。将标靶基因表现对 HPRT基因表现正常化。藉由将经过各种刺激处理后的表现量与单独使用培 养基处理所得的表现量进行比较，而计算出相对基因表现程度。对于比较 各种刺激间的基因表现，是将对照组（单独培养基）的基因表现程度设定 为1。

统计学分析

使用Student的t-试验测定各实验组间的统计学上差异显著性。若p值 ＜0.05，则被认为在统计学具有显著差异。

结果

rlipo-D1E3与Pam3的脂质部份不相同

藉由质谱分析鉴定出rlipo-D1E3的三个主要脂质修饰（陈等人(2009) Vaccine 27,1400-1409）。为能获得更多有关这些脂质修饰的信息，遂进一 步将rlipo-D1E3的胰蛋白酶分解片段纯化出，并以MS/MS亮度计进行分析。 计算Pam3及rlipo-D1E3纯化片段中脂质部份的质量，以分析彼等脂质部份 间的差异。Pam3的分子量为1509.6，且经MS/MS分析后可鉴定出y-离子 （参见图2a）。因此，Pam3的脂质-半胱胺酰基残基的质量为892.2原子质 量单位(amu)，确定Pam3的脂质部份为十六酰基-3-半胱胺酰基 (SNO6C54H102)。另一方面，从经纯化的rlipo-D1E3胰蛋白酶分解片段鉴 定出五个具有m/z值为1452.1、1466.1、1480.1、1494.1及1502.1的主要高 峰（参见图2b）。除了具有值为1502.1的高峰以外，经MS/MS分析后均测 定得y-离子（参见图2c-2f）。于m/z 1452.1、1466.1、1480.1及1494.1高 峰中的脂质-半胱胺酰基残基的质量分别为890、904、918及932amu。对 于m/z 1452.1高峰，脂质-半胱胺酰基残基的质量分别为890amu，较Pam3 的少2amu。此暗示，其脂质部份中存在有一双键。而且，rlipo-D1E3的其 余高峰增加14amu，表示虽然有数个脂质修饰，它们皆在其脂质部份中含 有一双键。这些数据明显证明，rlipo-D1E3的脂质部份可能具有各种与Pam3 不同的脂质修饰。

rlipo-D1E3经由TLR2刺激脾脏细胞增生

使用TLR2-/-与TLR4-缺陷小鼠来研究rlipo-D1E3的效应物机转。因为 脂肽已显示可刺激脾脏细胞增生，我们遂从野生型、TLR2-/-及TLR4-缺陷 小鼠分离出脾脏细胞，并将其以LPS（一种TLR4促动剂）、Pam3（一种 TLR2促动剂）、rlipo-D1E3及非脂质化E3(rE3)刺激。我们发现，LPS、Pam3 与rlipo-D1E3能刺激由野生型小鼠衍生的脾脏细胞增生，但是rE3无法诱 导增生作用（图3a）。得自TLR2-/-小鼠的脾脏细胞在以Pam3及rlipo-D1E3 刺激时并不增生（图3b）。反之，得自TLR4-缺陷小鼠的脾脏细胞仍然对 Pam3及rlipo-D1E3刺激产生反应（图3c）。这些结果指出，负责脾脏细胞 由rlipo-D1E3-诱发的增生作用的主要受体可能是TLR2。

rlipo-D1E3诱发从BM-DCs制造细胞激素是由TLR2介导

使用衍生自野生型、TLR2-/-及TLR4-缺陷小鼠的BM-DCs来研究抗原 展示细胞的活化作用。如图4所示，能刺激TNF-α(图4a)、IL-6(图4b)与 IL-12p40(图4c)从野生型及TLR4-缺陷小鼠的BM-DCs制造，但是不能从 TLR2-/-小鼠的BM-DCs制造出。经发现rlipo-D1E3的刺激图谱与由TLR2 促动剂Pam3测得的相似。相反地，LPS的刺激作用在TLR4-缺陷小鼠中丧 失，但仍可在TLR2-/-及野生型小鼠中维持。也使用未甲基化CpGs（一种 TLR9促动剂）做为比较例。CpG能刺激来自野生型、TLR2-/-及TLR4-缺 陷小鼠的BM-DC分泌细胞激素（图4）。这些数据明显确定，BM-DCs受 rlipo-D1E3的活化是由于TLR2活化功能所致，而非由于TLR4的活化作用。

rlipo-D1E3免疫原经由TLR2活化NF-κB传讯途径

已显示，Pam3是经由人类TLR2引发NF-κB传讯途径（Morr等人(2002) 欧洲免疫学月刊32,3337-3347）。于本研究中，我们检验rlipo-D1E3是否 能经由TLR2引发NF-κB级联。HEK293细胞已知其表现TLR2的能力差或 者不会表现。因此HEK293细胞能被用来在以TLR2受体与NF-κB报告基 因共转染时，进行TLR2-依赖型传讯分析。使用胸苷激酶(TK)-衍生的Renilla 荧光素酶基因将转感染效率正常化。如图5a所示，经TLR2-转染的HEK293 细胞受Pam3或rlipo-D1E3（分别使用1及10nM）的刺激作用，可引发NF-κB 传讯途径。反之，以LPS及重组E3（分别使用1及10nM）刺激则无此功 效（图5a）。因为曾暗示三酰基化脂肽Pam3及二酰基化脂肽BPPcysPEG （一种MALP-2衍生物）分别被不同的TLR2异元二聚体，即TLR2/TLR1 （Takeuchi等人(2002)J Immunol 169,10-4）与TLR2/TLR6（Basinski等人 (2007)Int Arch Allergy Immunol 142,91-8）辨识，我们于是进行剂量-反应研 究以厘清，TLR2-依赖性反应的传讯途径是否会依所使用的TLR2配体而有 所差异。结果证明，rlipo-D1E3与Pam3的剂量反应在1pM至100nM的范 围内类似。相反地，BPPcysPEG呈现较强的TLR2活化作用（图5b的*）。

rlipo-D1E3以与Pam3及BPPcysPEG相同的方式活化TLR下游传讯途 径，但是具有不同的动力学

为研究抗原展示细胞经Pam3、rlipo-D1E3或BPPcysPEG刺激后的细胞 内传讯途径，遂于不同时间间隔（0、10、20、40、60、90及120分钟）使 用磷酸基专一性抗体测量BM-DCs中p38、ERK1/2及JNK1/2的磷酸化作 用。BPPcysPEG会诱发较Pam3及rlipo-D1E3更高程度的p38、ERK1/2、 JNK1/2磷酸化。此结果与NF-κB活性分析的结果一致，显示BPPcysPEG 可以较低剂量活化NF-κB（图5及6a）。于BM-DCs中由Pam3所诱发最 高程度的p38、ERK1/2及JNK1/2磷酸化，是在40分钟与120分钟观察到 （图6a）。由BPPcysPEG所诱发最高程度的p38、ERK1/2及JNK1/2磷酸 化是在10分钟观察到，但是在60分钟后即下降至基线值。相反地，由 rlipo-D1E3诱发的磷酸化程度在120分钟时仍旧维持不变。抗原展示细胞 (BM-DCs)受rlipo-D1E3的刺激，可诱发与Pam3（一种TLR2/1促动剂）及 BPPcysPEG（一种TLR2/6促动剂）相同的MAPK磷酸化作用，但是由此 等促动剂诱导的动力学图形并不相同。由rlipo-D1E3诱发的磷酸化作用较 由Pam3诱发的早发生，且较由BPPcysPEG诱发的持续更久。

rlipo-D1E3于BM-DC中诱导的细胞激素与趋化激素基因表现

为探究是否引起与Pam3及BPPcysPEG不同的下游基因表现我们遂检 测经过Pam3、BPPcysPEG或rlipo-D1E3刺激后于BM-DCs中细胞激素与 趋化激素的基因表现情形。当正常化刺激后的基因表现时，将对照组（单 独培养基）的基因表现设定为1。诱导较高的IL-1α、IL-23、IL-27、MCP-1 与MIP-1α的表现程度。rlipo-D1E3及BPPcysPEG相较于Pam3可诱导较高 的IL-13表现程度。相反地，经过Pam3、BPPcysPEG或rlipo-D1E3刺激后 IL-10、TGFβ与CXCL1表现程度彼此相似（图7）。此结果暗示，虽然 rlipo-D1E3、Pam 3及BPPcysPEG皆经由相同受体(TLR2)及相似的传讯途径 活化BM-DCs。然而，它们可能诱导不同基因表现程度。

大多数天然细菌脂蛋白经由展现于抗原展示细胞上的TLR2/1或 TLR2/6异元双聚体受体活化先天性免疫反应。然而，源自绿脓杆菌 (Pseudomonas aeruginosa)的重组脂蛋白OprI当表现于大肠杆菌时，显示经 由TLR2/4接合刺激树突细胞。这些引发争议的结果促使我们分析重组登革 热病毒疫苗（rlipo-D1E3，其呈现固有的佐剂特性）的脂质结构及效应物机 转，特别是因为关于细菌衍生的脂蛋白中脂质部份结构的信息非常有限。 最近，已藉由串接质谱分析(MS/MS)鉴定出一种经由TLR2刺激细胞，衍生 自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的30-35kDa脂蛋白的脂质部份为 二酰基化蛋白质。脂蛋白中转译后的脂质修饰在细菌间有所差异。本发明 用于建造rlipo-D1E3免疫原的脂质化讯号序列系衍生自脑膜炎双球菌 (Neisseria meningiditis)，且该脂蛋白于大肠杆菌中被过度表现。该脂质免疫 原显示具有强的固有佐剂活性。我们因此对确立TLRs的专一性，以及负责 rlipo-D1E3的免疫调节活性的基本细胞内传讯机转感兴趣。我们已显示 rlipo-D1E3是经不饱和脂肪酸三酰化。在rlipo-D1E3经液相胰蛋白酶分解 后，使用MS/MS可观察到三个蛋白酶分解肽高峰。然而，将这些片段纯化 后观察到五种脂质修饰，且各修饰彼此的原子质量差异相当于14amu（图 2c、d、e及f）。这些数据暗示rlipo-D1E3的脂肪酸是以含有不同数目亚甲 基(CH₂)基团的脂质部份存在。由我们的结果预估，来自rlipo-D1E3之一脂 肪酸可能为不饱和（含一个双键）。此类型脂质修饰可造成不同用以活化先 天免疫的效应物机转。

为了解效应物刺激机转，我们已研究rlipo-D1E3的受体及胞内讯号传 递的专一性。结果发现，rlipo-D1E3对TLR2-缺陷小鼠不具任何影响，而对 得自野生型与TLR4-缺陷小鼠仍有刺激活性（图3及图4）。这些数据证明， rlipo-D1E3所使用的主要受体为TLR2，而非TLR4。这些结果与先前在重 组OprI进行的研究所得的不同，其系使用TLR2/4。此可能是因为这两种脂 蛋白的脂质组成不同，或是由于制造方法不同所致。因此，重组脂蛋白活 化TLR2可能具有与APC上其他TLR2促动剂不同的作用。虽然经发现 TLR2与TLR1或TLR6所成的异元双聚体不会造成差异性胞内讯号传递， 我们也有兴趣研究重组脂蛋白rlipo-D1E3是否显现不同的胞内讯号传递。 于NF-κB受体分析中，Pam3、rlipo-D1E3及BPPcysPEG会经由NF-kB途 径诱发讯号传递。然而，在0.1或1nM浓度下，BPPcysPEG诱发最高的 NF-κB传讯活性（图5b）。而且，本实验结果发现，将BM-DCs以rlipo-D1E3、 Pam3或BPPcysPEG刺激，会在BM-DCs中诱发对p38、ERK1/2及JNK1/2 相似的磷酸化作用（图6a），但是由所诱发的p38、ERK1/2及JNK1/2磷酸 化程度较强，且较Pam3或rlipo-D1E3所诱发的更早发生。有趣地，似乎具 有长时间p38磷酸化传讯作用（图6b）。我们尚无法知晓该长时间传讯作用 对于抗原展示细胞是否具有任何冲击。因此，本发明使用等量Pam3、 rlipo-D1E3及BPPcysPEG刺激BMDCs，结果发现rlipo-D1E3诱发较高量的 发炎性细胞激素与趋化激素转录产物（IL-1α、IL-23、IL-27、MCP-1、MIP-1α） （图7）。细胞激素与趋化激素于经rlipo-D1E3刺激后的增量调节表示，该 重组脂蛋白相较于其他两种TLR 2促动剂（Pam3或BPPcysPEG）可能具有 不同的效应物功能。再者，Farhat等人曾使用FSL-1（TLR1-依赖性）、 Pam2C-SK4（TLR1-及TLR6-依赖性）或PamOct2C0(VPGVG)-4VPGKG （TLR6-依赖性）刺激鼠类树突细胞，并分析MAPK磷酸化作用及基因表 现情形。它们结论，存在不同病原菌的脂蛋白可能活化不同TLR双聚体， 但是使用相同基因活化传讯级联（J Leukoc Biol 83,692-701）。我们怀疑 rlipo-D1E3的脂质部份或D1E3功能域的独特双键是否为促成诱导较高量细 胞激素与趋化激素基因表现的原因。最近，我们正尝试分离及纯化出 rlipo-D1E3的N-端脂质部份以供进一步研究。综合前述，细胞激素与趋化 激素的表现量增高意味着，的效应物机转与Pam3或BPPcysPEG的不同。 其N-端脂质部份可供未来疫苗研发，做为用以调节免疫反应的新颖佐剂。

实施例2

于本实施例，进行关于rlipo-D1E3分解及N-端脂质化片段(lipo-Nter) 纯化的分析。简述之，是将100mg经纯化的rlipo-D1E3以胰蛋白酶（比例 为50:1）于室温下进行分解4小时。然后，藉由将100%甲酸加至混合物中 使比例达100:3而终止反应。接着将7.2克C18硅胶（Fluka(Buchs,瑞士)， 逆相硅胶100C18）溶解于200ml 100%乙腈(CAN)中，并以80ml 0.1%三氟 乙酸(TFA)预平衡。之后，将100mg经分解的rlipo-D1E3加样至C18管柱。 将管柱以200ml的0.1%TFA冲洗，再进一步以400ml的70% ACN/0.1%TFA冲洗。使用120ml的100%ACN完成最后冲洗。然后使用 40ml异丙醇将脂质化N-端片段溶析出，并进行MALDI-TOF质谱分析。

结果列示于图1及2。如图所示，MALDI-TOF质谱结果指出，分子离 子质量(m/z)与预测N-酰基-S-二酰基甘油基-CSQEAK的相符。分子离子质 量1452、1466、1480及1494意味着位于R1（或R2）位置的脂肪酸具有相 同碳数(C16:0)，或相同(C16:1)、(C17:1)与(C18:1)的混合，以及B)不饱和脂 肪酸的中性丧失是来自相同的R1或R2位置。

如图2a所示，Pam3的分子质量为1509.6道耳顿，且其序列为脂质 -Cys-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys。已鉴定出y1-y5的y-离子，且它们确认该序列不 具有其他修饰。源自Pam3的N-酰基-S-二酰基甘油基-半胱胺酰基的质量为 892.2，其与所预期的组成:SNO6C54H102一致。如图2b所示，存在有五个 可于rlipo-D1E3的质谱中被确定的主要高峰。如图2c所示，已鉴定出y1-y5 的y-离子，且彼等确认该序列不具有其他修饰。高峰1452.2的N-酰基-S- 二酰基甘油基-半胱胺酰基的质量为890.0。如图2d所示，已鉴定出y1-y5 的y-离子，且它们确认该序列不具有其他修饰。高峰1466.2的N-酰基-S- 二酰基甘油基-半胱胺酰基的质量为904.0。如图2e所示，已鉴定出y1-y5 的y-离子，确认该序列不具有其他修饰。高峰1480.2的N-酰基-S-二酰基甘 油基-半胱胺酰基的质量为918.0。如图2f所示，已鉴定出y1-y5的y-离子， 确认该序列不具有其他修饰。高峰1494.2的N-酰基-S-二酰基甘油基-半胱 胺酰基的质量为932.0。

实施例3

本实施例是描述脂质化N-端片段(lipo-Nter)的分离。首先将前述经胰蛋 白酶分解的rlipo-D1E3加入50uL已预先以乙腈(100%)湿润的POROS树脂 （Applied Biosystems,CA）中，将其混合并静置培育至少2小时。将POROS 树脂混合物装载于其底部具有以22规格针刺穿所形成的小开口的0.6mL 微量离心管，再将其置于1.5mL微量离心管的顶端。将废液过滤并使用桌 上型离心机以快速离心收集。将POROS树脂以0.1%TFA水溶液冲洗（0.2 mL，3至5次），然后先以0.05mL 100%乙腈接着以0.05mL 100%异丙醇 进行溶析。具有与预测N-酰基-S-二酰基甘油基-CSQEAK相符的分子离子 质量(m/z)的lipo-Nter经发现存在于后续100%异丙醇溶析液中。

结果列示于图1B。如图所示，确实已根据质量于不同时间分离及溶析 出lipo-Nter，彼此差异相当于14amu。

实施例4

本实施例是检视lipo-Nter是否能刺激骨髓-衍生的树突细胞分泌TNF- α与IL-12p40。

如先前所述（Lutz等人,1999）收取BM-DCs。简述之，将6-8周龄雌 性小鼠的股骨与胫股取出，并将骨髓细胞藉由吸管剧烈吸放而分散。待以 溶解缓冲液去除红血球后，将分离的骨髓细胞以补充青霉素(100U/mL, Sigma,St Louis,MO)、链霉素(μg/ml,Sigma)、L-谷胺酸(2mM,Sigma)、 巯基乙醇(μM,Sigma)及10%热去活化FBS的RPMI-10:RPMI-1640 (GIBCO BRL,Grand Island,NY)再悬浮，至密度为2-5×10⁵细胞/ml。于第 0、3及6天，将骨髓细胞加至含有200U/mL(20ng/ml)溶于RPMI-10的重 组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(MoGM-CSF,Peprotech,Rocky Hill,NJ)的 培养皿中。于第6天，将LPS(0.01μg/ml)、lipo-Nter(100nM)加入。一般 而言，不成熟的树突细胞至多占总细胞族群的70%。

使用ELISA测定由BM-DC进行的细胞激素制造。简述之，是将100μL 抗-细胞激素（10μg/ml的IL-12p40、TNF-α）抗体（R&D system Inc. Minneapolis,MN）与0.1M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)覆盖于孔微量平盘上，随 后于4℃下培育过夜。将经覆盖的平盘以0.05%Tween 20的PBS溶液清洗 两次，然后以存于PBS的5%脱脂牛奶于室温下进行封阻2小时。将得自经 刺激的BM-DC的稀释悬浮液加至经覆盖的孔中，于室温下静置2小时。接 着添加生物素-共轭的抗-细胞激素抗体（R&D system Inc.Minneapolis,MN） 后，将该分析以3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)进行显色，并藉由于每孔中添 加100μl 1M H₂SO₄终止反应。将平盘于450nm下使用ELISA计读机中 (Molecular Devices,CA)读取吸光值。将所得的值与未经刺激组所得的值相 减，而计算出细胞激素的制造量。

如图8所示，结果指出lipo-Nter可刺激由骨髓衍生的树突细胞分泌 TNF-α与IL-12p40。

实施例5

本实施例是检视与重组突变型E7(rE7m)组合的lipo-Nter是否能增强抗 -E7抗体。

将五只小鼠（6-8周龄）以皮下注射20μg rE7m（有或无与lipo-Nter 一起）进行免疫。以两周为间隔给予小鼠两次免疫注射。在所指示的不同 时间点，从每只小鼠收集血液。制备血清并储放于-80°C下备用。藉由将样 本于覆盖以经纯化rE7m的96-孔平盘中进行滴定，而测定出血清样本中所 含抗-E7m IgG的浓度。以山辣根过氧化酶-共轭的山羊抗-小鼠IgG Fc侦测 已结合的IgG Fc。于添加TMB后，于450nm下以ELISA计读机中测量吸 光值。如图9所示，结果指出与重组突变型E7(rE7m)组合的lipo-Nter可增 强抗-E7抗体。

实施例6

于本实施例，检视与重组突变型E7(rE7m)组合的lipo-Nter是否能增加 肿瘤生长抑制活性。将六只小鼠（6-8周龄）于第0天接种2x10⁵TC-1细 胞（表现HPVE7细胞）。7天后，将小鼠以20μg rE7m（有或无与lipo-Nter 一起）进行免疫一次。每2-3天监测肿瘤大小，直到肿瘤体积大于3000mm³。 以公式（长x宽x宽/2）计算肿瘤体积。如图10所示，结果指出rE7m在 有lipo-Nter存在下能诱导抗肿瘤效应。换言之，rE7m与lipo-Nter组合意外 地具有较单独rE7m更强的抗肿瘤活性。

为了测定何种免疫反应可透过lipo-Nter增强，将野生型C57BL/6小鼠 以磷酸盐缓冲溶液（PBS）、30μM rE7m/PBS或30μM rE7m/3μM lipo-Nter/PBS，以二周为间隔进行二次免疫。以rE7m（100nM）刺激脾细 胞并且使用ELISA测量培养基上清液中的IL-2（第3天）、IFN-γ（第4天） 及IL-5（第5天）的表现量。结果显示，lipo-Nter可增强IL-2介导的免疫 反应。

实施例7

于本实施例，检视E7衍生的抗原表位肽RAH(RAHYNIVTF)与 lipo-Nter的组合是否能增加肿瘤生长抑制能力，而与合成型脂肽Pam3组合 则否。

将六只小鼠（6-8周龄）于第0天接种2x10⁵TC-1细胞（表现HPVE7 细胞）。7天后，将小鼠以20μg E7衍生的肽，于有三棕榈酰基化肽Pam3 或lipo-Nter存在下进行免疫一次。每2-3天监测肿瘤大小，直到肿瘤体积 大于3000mm³。以公式（长x宽x宽/2）计算肿瘤体积。结果指出lipo-Nter 可增加以合成肽为底的免疫疗法的抗肿瘤功效。

而且，发现E7衍生的肽RAH与lipo-Nter组合能抑制小鼠中的肿瘤生 长。相反地，RAH与合成型脂肽Pam3的组合无法抑制肿瘤生长。参见图 11。

实施例8

本实施例是检视lipo-Nter是否增强肽的树突细胞（DCs）对于CD8+T 细胞的反应。

以一周为间隔给予小鼠两次皮下注射RAH及PADRE（30μg）的混合 物，进行间接免疫荧光抗体试验（IFA），其中，CD8+T细胞系由免疫小鼠 的脾脏纯化出。经纯化的CD8+细胞可与或不与DCs共同培养，并以PBS、 1μM RAH/PBS、或1μM RAH/200nM lipo-Nter/PBS刺激72小时。藉由(3)H- 胸嘧啶渗入法测量T淋巴细胞的增生，结果显示，lipo-Nter意外促使RAH 诱导的CD8+T细胞增生增加了6倍。

经纯化的CD8+细胞于覆盖有抗-IFN-γ的PVDF平盘中与DCs共同培 养，并以1μM RAH及/或200nM N-ter或控制组胜肽刺激48小时。以 ELISPOT分析法测定IFN-γ分泌细胞的反应，结果显示，RAH与lipo-Nter 对于IFN-γ分泌细胞的增生具有协同效应，更特别地，RAH与lipo-Nter的 组合所促进的IFN-γ分泌细胞增生作用意外地比单独由肽诱导时多3倍。

其他具体态样

本说明书中所揭示的全部特征可以任何组合方式组合。本说明书中所 揭示的各别特征可由依相同、相等或类似目的的替代特征取代。因此，除 非另行清楚地指示，所揭示的各特征仅为一系列同等物或类似特征的实例。

前述说明已描述本发明的许多较佳实施例。习于该项技艺人士应了解， 在未偏离本发明的精神及范围下可进行各种改变与修饰，以使其适于各种 不同用途与状况。因此，于申请专利范围内也包含其他具体态样。