抗大肠杆菌感染的治疗性单克隆抗体、产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其用途

摘要

本发明公开了一种抗大肠杆菌感染的治疗性单克隆抗体、产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其用途，本发明还公开了与该单克隆抗体特异性结合的MraY蛋白的表位多肽。本发明中所述单克隆抗体是由命名为M-H11的杂交瘤细胞产生，并对SEQ ID No.1所示核苷酸序列编码的多肽具有特异性。本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种新型的抗大肠杆菌单克隆抗体，以及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并对其表位以及体外抑菌特性与体内治疗效果进行了鉴定，对应用治疗性单克隆抗体防治大肠杆菌感染具有重大意义，同时也为革兰氏阴性菌感染的治疗以及菌影疫苗的深入研究奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗大肠杆菌感染的治疗性单克隆抗体、产生该单克隆抗体的杂 交瘤细胞株，还涉及与单克隆抗体特异性结合的大肠杆菌MraY蛋白的一个表位多 肽。本发明属于生物技术领域。

背景技术

革兰阴性菌磷酸-N-乙酰胞壁酸酯-胸腺喷丁转位酶(MraY，即转位酶Ⅰ)由 mraY基因编码，是细菌细胞壁生物合成的关键酶之一，催化第一步脂质中间代谢 物的形成，是UDP-GlcNAc/MurNAc酶家族的一员：polyisoprenyl-P GlcNAc/MurNAc  1-P转位酶家族，称其为GPT酶家族。MraY是某些抗菌药物如衣霉素、胞质霉素 A和脂赛霉素B的攻击靶标，胞质霉素会通过抑制MraY活性导致绿脓假单胞菌等 革兰阴性菌的裂解。这显示出MraY作为新型抗菌制剂研发靶位的重要潜力。

治疗性抗体作为一类有独特优势的靶向性治疗药物，现今已经成为全球药物研 发的热点之一。至2012年底，美国FDA批准上市的治疗性抗体有32个，另有350 多种抗体产品正处于不同的临床试验阶段中，其中30多种进入三期临床试验。治 疗感染性疾病的全人单克隆抗体中，有直接针对细菌抗原的，有针对细菌内毒素(如 由默克公司开发的针对艰难梭菌肠毒素的MK-3415A)，针对炭疽杆菌的抗PA的小 鼠抗体14B7、ABthrax和raxibacumab。此外还包括由赛诺菲/Kalobios共同开发的 针对绿脓杆菌的KB001，由Kenta Biotech公司开发的panobacumab，由诺华公司开 发的针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的Aurograb，由诺华公司开发针对念珠菌热休 克蛋白90的efungumab。但以MraY为靶点的治疗性单抗药物目前未见报道。

相对于小分子药物，单抗产品最大的优点就是“精准”，能够针对特异性的靶 点进行治疗；而传统化药物一般是广谱治疗，会同时作用于正常和病变组织，单抗 产品的“精准”在治疗过程中减低副反应的同时增强了作用效果。同时单抗是一 种“生物导弹”，可以单独使用或携带药物、毒素或放射性物质来攻击靶细胞。本 发明的一种抗大肠杆菌感染的治疗性单克隆抗体能特异性结合大肠杆菌的MraY蛋 白，可用于治疗大肠杆菌感染。

另外，MraY蛋白是噬菌体溶菌作用的靶点，包括phiX174噬菌体在内的多种 噬菌体在感染增殖过程中通过合成溶菌蛋白抑制MraY蛋白的活性来裂解细菌从而 释放子代病毒。人为控制克隆化的E基因在革兰氏阴性菌中表达，会产生菌影，其 作为一种新型的疫苗及佐剂形式已经受到国内外研究者的广泛关注。但关于溶菌机 制研究进展缓慢，争论不断。本发明提出的一种抗大肠杆菌感染的治疗性单克隆抗 体能应用于MraY蛋白在细菌裂解过程中的表达定位研究，从而为从根本上阐明菌 影的形成机制奠定基础。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种抗大肠杆菌MraY蛋白的治疗性单克隆抗体。

本发明的一种抗大肠杆菌MraY蛋白的治疗性单克隆抗体，其特征在于所述单 克隆抗体由保藏编号为CGMCC No.9241的杂交瘤细胞株分泌产生。

经鉴定所述的单克隆抗体为IgG2b型，轻链属于κ型。所述的单克隆抗体能够 特异性结合大肠杆菌MraY的B细胞抗原表位多肽，所述的表位多肽的氨基酸序列 为PESHFSKRGTPT(SEQ ID NO.1所示)。

实验证明，所述的单克隆抗体能够在体外抑制大肠杆菌的生长，在体内抑制大 肠杆菌的增殖并治疗由大肠杆菌引起的感染。

在此基础上，本发明提出了所述的单克隆抗体在制备检测大肠杆菌感染的试剂 中的应用。所述的检测，包括对大肠杆菌MraY表达水平的检测，也可包括对大肠 杆菌MraY的定位检测。将所述单克隆抗体应用于大肠杆菌MraY的定位研究，为 寻找与确证大肠杆菌MraY提供了有力手段，也为揭示噬菌体E蛋白的溶菌机制奠 定了基础；及

所述的单克隆抗体在制备抑制大肠杆菌的增殖的试剂中的应用。所述的抑制大 肠杆菌的增殖包括在体内抑制大肠杆菌的增殖和在体外抑制大肠杆菌的增殖；以及

所述的单克隆抗体在制备治疗大肠杆菌感染的试剂中的应用。

本发明的目的之二是提供一种产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明的一种杂交瘤细胞株，为小鼠的脾细胞与SP2/0细胞经过细胞融合产生 的杂交瘤细胞株，命名为M-H11，分类命名为杂交瘤细胞株，保藏在中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院 微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.9241，保藏日期为2014年5月28 日。

本发明的目的之三是提供一种与抗大肠杆菌MraY的单克隆抗体特异性结合的 MraY蛋白的一个表位多肽。

本发明的一种大肠杆菌MraY的B细胞抗原表位多肽，其特征在于所述的表位 多肽与以上任一项所述的单克隆抗体特异性结合，所述的表位多肽(Mpep)的氨基 酸序列为PESHFSKRGTPT(SEQ ID NO.1所示)。

本发明还提供了编码所述的B细胞抗原表位多肽的核苷酸序列。

在本发明的具体实施例中，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步的，本发明还提供了所述的表位多肽在制备检测抗大肠杆菌MraY的抗 体的试剂中的应用。所述多肽Mpep能竞争抑制单抗M-H11与M蛋白分子结合， 也能用于M蛋白功能的研究。以及所述的核苷酸序列在制备检测抗大肠杆菌MraY 的抗体的试剂中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明通过杂交瘤细胞技术筛选得到了一株能够稳定分泌所述单克隆抗体的 杂交瘤细胞株，其制备方法包括：用MraY两个亲水区片段与GST的融合蛋白 (GST-M-ab)免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，用GST-M-ab融合蛋 白和GST蛋白分别进行正向与负向筛选，获得能够稳定分泌所述单克隆抗体的杂交 瘤细胞，从杂交瘤细胞上清液中或从注射杂交瘤细胞的动物腹水中，获得所述单克 隆抗体。其中GST-M-ab融合蛋白中，MraY蛋白亲水区a段的氨基酸序列及核苷酸 序列如SEQ ID NO.3所示，GST-M-ab融合蛋白中，MraY蛋白亲水区b段的氨基酸 序列及核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

所述融合蛋白由以下方法获得：将含有MraY两个亲水区融合片段(a片段和b 片段)相关核苷酸序列的pGEX-6p-M-ab质粒载体转化大肠杆菌，IPTG诱导下获得 包涵体，对包涵体进行纯化，得到所述的GST-M-ab融合蛋白，本发明所指的 IPTG(Isopropy1-β-D-thiogalactopyranoside，异丙基-β-D硫代半乳糖苷)可以诱导蛋 白表达，能对乳糖操纵子产生极强的诱导效应，是强诱导物。

具体的，所述单克隆抗体由如下方法制备得到：

(1)免疫原的准备：将pGEX-6p-M-ab重组载体转化BL21(DE3)大肠杆菌，在 IPTG诱导下，分子量约32ku的GST-M-ab以包涵体形式存在。在本发明的一个优 选实验方案中，以简便的方法对上述包涵体进行了纯化，并以纯化过的蛋白作为抗 原免疫小鼠。

(2)动物免疫：用上述纯化过的GST-M-ab融合蛋白免疫BALB/c小鼠，以期 产生针对MraY蛋白的特异性单克隆抗体。每只小鼠以100μg的量进行背部皮下注 射，每两周一次共三次，第四次加强免疫一次，3天后待融合，获得免疫小鼠。

(3)杂交瘤细胞系的建立：取免疫小鼠的脾脏细胞作为能够产生抗体的浆细 胞，与同系动物的骨髓瘤细胞(SP2/0)以聚乙二醇(PEG3350)介导进行融合。融合 后细胞经HAT培养基选择性培养，分别以GST-M-ab和GST为包被抗原，采用间 接酶联免疫吸附试验(ELISA)进行正向与负向筛选阳性克隆。用有限稀释法对阳性 孔的杂交瘤细胞进行克隆化培养直至克隆化细胞抗体阳性率为100％。将杂交瘤细 胞经体外连续传代和反复冻存、复苏，直到细胞系能稳定分泌单克隆抗体。

(4)单克隆抗体的制备与纯化：将建系的杂交瘤细胞注射到经石蜡油预处理 的小鼠腹腔，诱生腹水。诱生的腹水用亲和层析法获得纯化的单克隆抗体。

本发明还涉及所述的单克隆抗体所针对大肠杆菌MraY的特异性肽段的筛选。 利用随机十二肽库的噬菌体展示技术，利用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)对单克 隆抗体的表位进行3轮淘选，滴度测定，阳性噬菌体克隆测序和竞争抑制试验，证 明Mpep：PESHFSKRGTPT(SEQ ID NO.1所示)是针对所述的单克隆抗体的特异 性肽段。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种新型的抗大肠杆菌单克隆抗 体，以及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并对其抑菌特性与治疗效果进行了鉴 定，对应用单克隆抗体治疗大肠杆菌感染具有重大意义，同时也为革兰氏阴性菌感 染的治疗以及菌影疫苗的深入研究奠定基础。

附图说明

图1为GST-M-ab融合蛋白纯化后的SDS-PAGE图；

1为上样缓冲液的空白对照；2为纯化GST-M-ab融合蛋白；M为marker；

图2为抗大肠杆菌MraY单抗M-H11纯化后SDS-PAGE；

1为纯化的M-H11单抗；M为marker；

图3为M-H11单克隆抗体亚型鉴定；

图4为M-H11与大肠杆菌的免疫荧光图；

图5为免疫印迹杂交检测M-H11单克隆抗体特异性的结果；

1为GST-M-ab；2为GST；M为marker；

图6为噬菌体阳性克隆测序分析；

图7为合成肽Mpep与单抗结合的ELISA检测；

图8为合成肽Mpep的竞争抑制试验；

图9为M-H11体外抑制大肠杆菌BL21(DE3)plysS的生长曲线与抑制率；

图10为M-H11体内治疗大肠杆菌感染的试验结果。

具体实施方式

下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施 例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

实施例1：MraY亲水区融合蛋白原核表达载体的构建

以大肠杆菌DH5α基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增出96bp的a片段 (SEQ ID NO.3所示)及99bp的b片段(SEQ ID NO.4所示)，通过重叠PCR方法 将两个片段进行融合，经限制性内切酶(Bam H I和Sal I)切后，与pGEX-6P-1(购 自Amersham公司)连接，转化到大肠杆菌BL21(DE3)(购自Merck公司)中， 并经酶切和PCR鉴定后获得重组质粒pGEX-6p-M-ab。

实施例2融合蛋白的表达与纯化

(1)重组蛋白的诱导

挑取含有质粒的单克隆菌落，分别接种于5ml含有氨苄青霉素的LB培养基， 37℃220rpm振荡过夜。次日，以1:100稀释到含有相应抗生素的500ml LB培养基 中，37℃培养至OD₆₀₀约为0.6，加入IPTG使其浓度为1mM，37℃诱导4小时，离 心收集沉淀。

(2)尿素变形提取包涵体

1)按4ml/100ml菌液(该菌液体积为IPTG诱导时的菌液体积)比例用12mL 重悬液(20mM Tris，150mM NaCl)将沉淀悬起；

2)超声30分钟，每超声5秒，间隔15秒，振幅30％，冰上操作；

3)4℃12000×g离心20分钟，收集沉淀用12mL洗涤液(20mM Tris，150mM  NaCl，2M尿素，0.5％NP₄₀)洗涤沉淀；

4)重复步骤3)，收集沉淀用12ml 8M尿素溶解并超声至溶液清亮；

5)4℃12000×g离心20分钟，收集上清蛋白样品，-80℃冻存。

(3)GST-M-ab融合蛋白的纯化

1)配制SDS-PAGE浓缩胶和分离胶，不插样品梳上样，按常规方法电泳；

2)电泳结束后将胶放4mol/L NaAc溶液中在脱色摇床上摇1小时，目的蛋白 可呈现一条白色的条带；

3)将目的蛋白切割下来放在蒸馏水中在脱色摇床上摇20分钟脱去NaAc；

4)然后将切下来的胶放在密封的透析袋内(透析袋内也装满电泳液)；

5)再将透析袋放在水平电泳槽内，在120V的电压下作用30分钟可使目的蛋 白游离出来；

6)将透析袋直接放入盛有PBS溶液的烧杯中，4℃透析过夜；

7)用PEG20000将透析袋包埋，浓缩至合适体积，吸出蛋白液。

SDS-PAGE鉴定蛋白纯度(图1所示)，并用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。

实施例3抗血清的制备

将纯化的GST-M-ab融合蛋白与等体积的弗氏完全佐剂(购自Sigma公司)混 合并乳化后，皮下多点免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠(购自中国农业科学院哈尔 滨兽医研究所实验动物中心)，注射剂量为100μg/只；共免疫三次，后两次用等体 积的弗氏不完全佐剂(购自Sigma公司)，免疫剂量也为100μg/只。第三次免疫后7 天，尾部静脉采血，分离血清作为阳性血清。以间接ELISA法测定效价，当达到 10^-4后准备融合。融合前三天用不加佐剂的蛋白腹腔注射进行加强免疫，剂量也为 100μg/只。

实施例4单克隆抗体的制备

(1)饲养细胞铺板

在融合前一天，取一只无免疫的BALB/c小鼠，脱颈处死，并将其完全浸泡于 75％的酒精中约5分钟。用剪刀小心剪开腹部皮肤，但不要剪开腹膜。酒精棉球对 腹膜进行消毒，20ml的注射器吸取5ml HAT筛选培养基，小心推入小鼠腹腔，取 饲养细胞，然后注入到培养皿中。再加入约36ml完全培养基混匀，用排枪加入四 块96孔培养板中，100μl/孔。观察生长，防止污染。

(2)免疫后的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合

无菌条件下取出加强免疫的BALB/c小鼠脾脏，在基础培养液中洗掉结缔组织。 再将脾脏移入另一盛有基础培养基中进行二次清洗，然后过100目钢丝网，将其捣 碎，将悬液转入离心管中，1000×g离心10分钟，用基础培养液悬起脾细胞，进行 计数。收集将生长状态良好并处于对数生长期的SP2/0细胞(购自中国农业科学院 哈尔滨兽医研究所技术服务中心)，进行计数。按比例为1:10的脾细胞和骨髓瘤细 胞进行融合，1000×g离心7分钟，弃尽上清。轻轻震动离心管，使细胞轻微的悬浮 起来，便于融合剂渗入细胞之间。将离心管放入37℃水中，缓慢加入1ml PEG3350， 并边滴边摇晃离心管。静置1分钟，然后按1ml/分钟、3mL/分钟，6ml/分钟速度分 步滴加培养基，最后再慢慢滴加到45ml，起到彻底终止作用。1000×g离心10分钟， 吸尽上清，用37℃预热准备好的含有20％胎牛血清的HAT选择培养基，轻轻悬起 沉淀细胞，并定容到40ml，然后转移到灭菌平皿中，按每孔100μl的量加入96孔 细胞培养板中，放入细胞培养箱进行培养。

HT培养基的配制方法：将100倍浓缩的HT液体(1ml)放入含有20％胎牛血 清的DMEM 99ml液体培养基中。

HAT培养基的配制方法：将100倍浓缩的HAT液体(1ml)放入含有20％胎牛 血清的DMEM 99ml液体培养基中。

(3)杂交瘤细胞的筛选

用显微镜观察融合后细胞的生长情况，及时用固体NaOH颗粒清除污染的细胞。 每3天更换培养基一次，所用培养基根据换液时间而有所不同，在融合后的第3、6 天用HAT培养基进行半换液，第9天改用HT培养基进行半换液，第12天用HT 培养基进行全换液。当在15天时融合的细胞形成小集落，大约达到板底面积的1/4 时，可取上清100μl，利用间接ELISA方法，对细胞分泌抗体的水平进行检测。用 移液器小心吹打阳性孔，使细胞混匀悬浮。然后取100μl放入2ml的DMEM的基 础培养液中，充分混匀，进行计数。取约100个细胞的混合液，放入10ml HT培养 液中，并用100μl的排枪吸到铺有饲养层细胞的96孔板中。经常观察细胞生长状态， 培养液变黄进行换液。分别以GST-M-ab和GST为包被抗原(包被浓度5μg/ml， 每孔50μl)，进行间接ELISA，测OD₄₅₀值，通过正向与负向筛选阳性单一杂交瘤 细胞群。再用相同方法进行阳性杂交瘤细胞的克隆，直至所得到细胞株能稳定分泌 单克隆抗体。最终获得一株杂交瘤细胞株，命名为M-H11，保藏在中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.9241，保藏日 期为2014年5月28日。

实施例5单克隆抗体的腹水的制备及纯化

取8-10周龄的BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5ml/只，一周后接种生长状态 良好的单克隆杂交瘤细胞M-H11，大约0.5×10⁶个细胞，待一周左右小鼠腹部膨大， 抽取腹水，3000×g离心10分钟，取上清，分装入1.5ml离心管，-20℃备用。用饱 和硫酸铵沉淀法将腹水进行初步提纯，之后用Protein A亲和层析法将其进一步纯 化，单克隆抗体纯化后的SDS-PAGE见图2。该图显示了单克隆抗体的轻链和重链 聚合体，证明单抗的纯度较高。

实施例6M-H11单克隆抗体腹水效价及亚型鉴定

用间接ELISA方法，检测M-H11单克隆抗体腹水中抗体的效价为10万以上， 见表1。采用Southern Biotech抗体亚类试剂盒对获得的单抗M-H11进行抗体亚类 进行鉴定，结果：单抗M-H11重链为IgG2b，轻链是κ链，见图3。

表1M-H11单克隆抗体腹水中抗体效价检测结果

实施例7单克隆抗体的反应特异性

取大肠杆菌DH5α新鲜菌液固定于载玻片，以纯化单抗M-H11为一抗，进行 免疫荧光试验。结果如图4显示，M-H11单抗结合于大肠杆菌细胞外壳，说明此抗 体为与大肠杆菌反应的特异性抗体。

将纯化MraY-AB蛋白样品进行SDS-PAGE，转印NC膜，进行Western-Blot检 测，用GST蛋白做阴性对照，纯化的单抗M-H11为一抗。如图5显示，在32KD 处出现特异性条带，而GST对照无条带，表明该单抗是针对MraY蛋白的特异性抗 体，特异性识别融合蛋白的MraY-AB区段。

实施例8M-H11单克隆抗体识别抗原表位的鉴定

采用New England Biolabs噬菌体展示随机十二肽库试剂盒鉴定M-H11单抗特 异性结合大肠杆菌MraY的表位多肽。通过三轮淘洗，进行滴度测定，ELISA测定 高反应信号的噬菌体，选取15个阳性噬菌体克隆进行测序分析，结果15个噬菌体 克隆均测出并推导出所展示的氨基酸序列，见图6。通过氨基酸序列的整合比对最 终确定一条一致序列Mpep：PESHFSKRGTPT(SEQ ID NO.1所示)，推测多肽 PESHFSKRGTPT是线性B细胞抗原表位，由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列所编 码。

实施例9合成肽与单抗M-H11结合的ELISA检测

将合成肽Mpep按10μg/mL包被96孔的ELISA板，每孔50μL，4℃过夜。次 日除去包被液，用10×BSA、10×CBS和水的混合液进行封闭，200μl/孔，4℃封闭2 小时，PBST洗3次，3分钟/次。每孔加50μL抗体(按2、4、6、8、10、12、14、 16μg/ml等8个梯度稀释，稀释液为PBST)，37℃孵育1小时，PBST洗3次，3分 钟/次。加HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗，用PBST进行1:10000倍稀释。37℃孵 育1小时，PBST洗3次，3分钟/次。加入TMB底物显色液，50μL/孔，37℃避光 显色10分钟。再加入终止液2M H₂SO₄，用酶标仪检测样品在450nm的吸光度 (OD₄₅₀)。同时设立阳性对照和空白对照。结果显示Mpep可与单抗M-H11发生特异 性结合，见图7。

实施例10合成肽对单抗M-H11与GST-M-ab融合蛋白结合的竞争抑制试验

GST-M-ab融合蛋白以5μg/ml进行包被，100μl/孔，4℃过夜，用10×BSA、10×CBS 和水的混合液进行封闭，200μl/孔，4℃封闭2小时。1×PBST洗3次，3分钟/次。 加入不同浓度(5、10、15、25、50、75、100μg/mL)合成肽Mpep与终浓度为0.2μg/ml 单抗M-H11的混合液(预先在4℃作用2小时)，37℃孵育1小时，弃掉混合液， PBST洗3次，3分钟/次。加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG，37℃孵育1小时，PBST 洗3次，3分钟/次。设Control为无关短肽对照。加入TMB底物显色液，50μL/孔， 37℃避光显色10分钟。再加入终止液2M H₂SO₄，用酶标仪检测样品在450nm的吸 光度(OD₄₅₀)。结果显示：随着肽浓度的增加抑制率也增加，见图8。

实施例11单抗M-H11对大肠杆菌的体外抑菌试验

取冻存的大肠杆菌BL21(DE3)plysS划线接种于含Cm(34μg/ml)的固体LB 培养基上，恒温箱37℃过夜培养，挑单菌落，接种于Cm(34μg/ml)的液体LB培 养基中，恒温摇床37℃、220rpm培养8-12h。取上述菌液1:100转接于Cm(34μg/ml) 的液体LB培养基中，恒温摇床37℃、220rpm培养至OD590值大约等于0.6。用无 菌96孔细胞培养板，每孔加入100μl菌液。然后分别加纯化的M-H11单抗0、1μg、 5μg、7μg，对照组分别加无菌PBS和抗phiX174噬菌体E蛋白单抗，反应体系均用 无菌PBS补齐为200μl。每组三孔重复。用酶标仪读值后，恒温摇床37℃、220rpm 培养。每隔20min，用酶标仪对96孔板读值OD590绘制细菌生长曲线，如图9。 将上述作用后的菌液分别10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁸稀释后，涂布于含Cm(34μg/ml) 的固体LB培养基上，恒温箱37℃过夜培养。菌落计数，计算抑制率。抑制率计算 公式：(1-单抗组菌数/对照组菌数)×100％。结果显示，添加了M-H11单抗的细菌 均在100min开始出现生长抑制，而PBS对照组和添加了抗phiX174噬菌体E蛋白 单抗的对照组细菌没有生长抑制现象，说明M-H11单抗对大肠杆菌BL21(DE3) pLysS菌株有抑制生长的作用。7μg的M-H11单抗孵育组，细菌生长抑制率为100％， 5μg的M-H11单抗孵育组，细菌生长抑制率为93.5％，1μg的M-H11单抗孵育组， 细菌生长抑制率为88.4％，说明M-H11单抗对细菌生长的抑制呈现浓度依赖性。

实施例12单抗M-H11体内治疗大肠杆菌感染

首先，确定大肠杆菌BL21(DE3)pLysS的感染时间：挑单菌落，接种于含 Cm(34μg/ml)的液体LB培养基中，恒温摇床37℃、220rpm培养8-12h。取上述 菌液1:100转接于含氯霉素(34μg/ml)的液体LB培养基中，恒温摇床37℃、220rpm 培养至OD₅₉₀值0.6左右。取6周龄左右小鼠12只，尾静脉注射100μl菌液+100μl 无菌PBS，分别在3h、5h、7h、9h时取三只小鼠解剖。取肝、肺、脾、肾组织各 约0.1g，加1ml无菌PBS，用无菌铜网研磨，取100μl，涂布于含氯霉素(34μg/ml) 的固体LB培养基上，恒温箱37℃过夜培养，进行菌落计数。结果显示3-5h时小鼠 肝脾荷菌数最多，确定3.5h为剖检时间。

其次，进行单抗体内抑制实验：挑单菌落，接种于含Cm(34μg/ml)的液体LB 培养基中，恒温摇床37℃、220rpm培养8-12h。取上述菌液1:100转接于含Cm (34μg/ml)的液体LB培养基中，恒温摇床37℃、220rpm培养至OD₅₉₀值0.6左右。 实验组每只小鼠尾静脉注射100μl菌液+100μl M-H11，对照组每只小鼠尾静脉注射 100μl菌液+100μl无菌PBS。3.5h解剖小鼠，取肝、脾组织各约0.1g，加1ml无菌 PBS，用无菌铜网研磨，研磨菌液10³倍稀释后涂板，恒温箱37℃过夜培养，进行 菌落计数。结果见图10，从图10中可以看出，相较于对照组。实验组小鼠肝脏以 及脾脏组织中的大肠杆菌数量显著下降，表明单抗M-H11具有在体内治疗大肠杆菌 感染的作用。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性 的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进 行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。