氟取代的(3R,4R,5S)-5-胍基-4-乙酰氨基-3-(戊烷-3-基氧基)环己烯-1-甲酸、它们的酯及它们的应用

摘要

本发明涉及新的神经氨酸苷酶活性抑制剂及其用于预防和治疗流感感染的用途，具体地，本发明涉及下述通式1的氟取代的4-乙酰氨基-5-胍基-3-(戊烷-3-基氧基)环己-1-烯甲酸、它们的酯、及它们的药学可接受的盐和/或水合物，本发明还提供药物组合物、其制备方法、以及用于预防和治疗病毒疾病的方法。在通式1中，R表示氢、任选取代的C

说明书

技术领域

本发明涉及新的化合物——氟取代的(3R,4R,5S)-5-胍基-4-乙酰 氨基-3-(戊烷-3-基氧基)环己烯-1-甲酸和它们的酯——作为神经氨 酸苷酶活性的抑制剂。

背景技术

许多包含神经氨酸苷酶的微生物对人和例如家禽、马、猪和海豹 等动物而言是致病性的。这些致病性微生物包含流感病毒。神经氨酸 苷酶与流感病毒的致病性有关。

在这种情况下，新的氟取代的(3R,4R,5S)-5-胍基-4-乙酰氨基 -3-(戊烷-3-基氧基)环己烯-1-甲酸和它们的酯作为用于预防和治疗 流感的药物的药用物质得到显著关注。已知的神经氨酸苷酶抑制剂是 (3R,4R,5S)-4-乙酰氨基-5-氨基-3-烷基氧基-环己烯-1-甲酸A1，这 其中，活性最好的是(3R,4R,5S)-4-乙酰氨基-5-氨基-3-(戊烷-3-基氧 基)环己烯-1-甲酸A2，如通过它与流感病毒的神经氨酸苷酶的复合体 的X射线衍射数据所显示的，其有效地结合于该酶的活性中心(奥塞米 韦羧化物)[C.U.Kim,W.Lew,M.A.Williams等人，J.Am.Chem. Soc.1997,119,681-690]。

奥塞米韦甲酸的乙基酯A3，又称为磷酸奥塞米韦或达菲([J.C. Rohloff、K.M.Kent、M.J.Postich等人，J.Org.Chem.1998,63, 4545]，是奥塞米韦羧化物A2的药用前体。

还已知的是，(3R,4R,5S)-5-胍基-4-三氟乙酰氨基-3-(戊烷-3- 基氧基)环己烯-1-甲酸A4表现出针对流感病毒H5N1的神经氨酸苷酶 的活性[Q.-S.Du、R.-B.Huang、Y.-T.Wei、Z.-W.Pa、L.-Q.Du、 K.-C.Chou，Fragment-Based Quantitative Structure-Activity  Relationship(FB-QSAR)for Fragment-Based Drug Design.J.Comput. Chem.2008,30(2),295-304]。

已知(2R,3R,4S)-3-乙酰氨基-4-胍基-2-((1R,2R)-1,2,3-三羟 基丙基)-3,4-二氢-2H-吡喃-6-甲酸(扎那米韦)对流感病毒A和В的 神经氨酸苷酶是有活性的，并且对流感病毒H1N1的神经氨酸苷酶也是 有活性的[J.M.Woods、R.C.Bethell、J.A.Coates等人， 4-Guanidino-2,4-dideoxy-2,3-dehydro-N-acetylneuraminic acid  is a highly effective inhibitor both of the  sialidase(neuraminidase)and of growth of a wide range of  influenza A and B viruses in vitro.Antimicrob Agents Chemother. 1993,37(7),1473-1479]。

寻找高度有效的抗流感药物，尤其是针对抗药性流感病毒表现出 增强的活性的药物，仍然是开发用于治疗流感的新的药理学治疗法的 主流之一。在这种情况下，新的抗流感成分、药物组合物和药物、以 及它们的制备和使用方法的设计有着现实的意义。

发明内容

在本发明的上下文中，各术语一般为如下定义：

“烯基”是指具有2-7个碳原子且包含至少一个碳-碳双键的脂族 的直链或支链烃链。支链是指直链烯基链包含一个或多个低级烷基如 甲基、乙基或丙基。烷基可以具有一个或多个取代基，例如，卤素、 烯基氧基、环烷基、氰基、羟基、烷氧基、羧基、炔基氧基、芳烷氧 基、芳基氧基、芳基氧基羰基、烷硫基、杂芳烷基氧基、杂环基、杂 环基烷基氧基、烷氧基羰基、芳烷氧基羰基、杂芳烷基氧基羰基或 R_k^aR_k+1^aN-、R_k^aR_k+1^aNC(＝О)-、R_k^aR_k+1^aNSO₂-，其中R_k^a和R_k+1^a彼此独立地表 示“氨基取代基”，其含义如本节中所定义的，例如氢、烷基、芳基、 芳烷基、杂芳烷基、杂环基或杂芳基，或者R_k^a和R_k+1^a与它们所连接的 氮原子一起形成包含R_k^a和R_k+1^a的4-7元的杂环基或杂环烯基。优选的 烷基为甲基、三氟甲基、环丙基甲基、环戊基甲基、乙基、正丙基、 异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、3-戊基、甲氧基乙基、羧基甲基、 甲氧基羰基甲基、苄氧基羰基甲基和吡啶基甲氧羰基甲基。优选的烯 基是乙烯基、丙烯基、正丁烯基、异丁烯基、3-甲基丁-2-烯基、正戊 烯基和环己基丁烯基。

“烷基”是指具有1-12个碳原子的脂族烃的直链或支链。支链是 指该烷基链具有至少一个或多个“低级烷基”取代基。烷基可以具有 一个或多个相同或不同结构的取代基(“烷基取代基”)，包含卤素、 烯基氧基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基、芳酰基、氰基、羟基、 烷氧基、羧基、炔基氧基、芳烷氧基、芳基氧基、芳基氧基羰基、烷 硫基、杂芳基硫基、芳烷硫基、芳基磺酰基、烷基磺酰基、杂芳烷基 氧基、环化的(annelated)杂芳基环烯基、环化的杂芳基环烷基、环化 的杂芳基杂环烯基、环化的杂芳基杂环基、环化的芳基环烯基、环化 的芳基环烷基、环化的芳基杂环烯基、环化的芳基杂环基、烷氧基羰 基、芳烷氧基羰基、杂芳烷基氧基羰基或R_k^aR_k+1^aN-、R_k^aR_k+1^aNC(＝О)-、 R_k^aR_k+1^aNC(＝S)-、R_k^aR_k+1^aNSO₂-，其中R_k^a和R_k+1^a彼此独立地表示“氨基取 代基”，其含义如本节中所定义的，例如氢、烷基、芳基、芳烷基、 杂芳烷基、杂环基或杂芳基，或者R_k^a和R_k+1^a与它们所连接的N原子一 起形成包含R_k^a和R_k+1^a的4-7元杂环基或杂环烯基。优选的烷基是甲基、 三氟甲基、环丙基甲基、环戊基甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁 基、叔丁基、正戊基、3-戊基、甲氧基乙基、羧基甲基、甲氧基羰基 甲基、乙氧基羰基甲基、苄氧基羰基甲基和吡啶基甲氧羰基甲基。优 选的“烷基取代基”是环烷基、芳基、杂芳基、杂环基、羟基、烷氧 基、烷氧基羰基、芳烷氧基、芳基氧基、烷硫基、杂芳基硫基、芳烷 硫基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷氧基羰基、芳烷氧基羰基、杂芳 烷基氧基羰基或R_k^aR_k+1^aN-、R_k^aR_k+1^aNC(＝О)-、环化的芳基杂环烯基和环 化的芳基杂环基。

“炔基”是指具有2-12个碳原子且包含至少一个碳-碳三键的脂 族烃的直链或支链。支链是指该直链炔基链包含至少一个或多个低级 烷基如甲基、乙基或丙基。烷基可以具有一个或多个取代基，例如卤 素、烯基氧基、环烷基、氰基、羟基、烷氧基、炔基氧基、芳烷氧基、 芳基氧基、芳基氧基羰基、烷硫基、杂芳烷基氧基、杂环基、杂环基 烷基氧基、烷氧基羰基、芳烷氧基羰基、杂芳烷基氧基羰基或R_k^aR_k+1^aN-、 R_k^aR_k+1^aNC(＝О)-、R_k^aR_k+1^aNSO₂-，其中R_k^a和R_k+1^a彼此独立地表示“氨基 取代基”，其含义如本节中所定义的，例如氢、烷基、芳基、芳烷基、 杂芳烷基、杂环基或杂芳基，或者R_k^a和R_k+1^a与它们所连接的N原子一 起形成包含R_k^a和R_k+1^a的4-7元杂环基或杂环烯基。优选的烷基是甲基、 三氟甲基、环丙基甲基、环戊基甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁 基、叔丁基、正戊基、3-戊基、甲氧基乙基、羧基甲基、甲氧基羰基 甲基、苄氧基羰基甲基和吡啶基甲氧羰基甲基。优选的炔基是乙炔基、 丙炔基、正丁炔基、异丁炔基、3-甲基丁-2-炔基、正戊炔基、丁-1,3- 二炔基和己-1,3,5-三炔基。

“水合物”是指化合物或它们的盐与水的化学计量的或非化学计 量的组合物。

“活性成分”(药用物质)是指表现出药理学活性的合成的或其它 (生物工艺学、植物、动物、微生物等)来源的生理学活性化合物，其 是用于生产和制备药物的药用组合物的活性成分。

“药物”是片剂、胶囊、注射剂、膏剂、和其它即用形式的化合 物(或在多种化合物的混合物的情况下称为药用组合物)，其被用于恢 复、改善或改变人和动物的生理学功能，以及用于治疗和预防疾病、 用于诊断、麻醉、避孕、美容和其它应用。

“神经氨酸苷酶”(唾液酸酶、酰基神经氨酸水解酶 (acylneuraminile hydrolase)和ЕC3.2.1.18)是动物和许多微生物 共有的一种酶。其表示将糖蛋白、糖脂和低聚糖中的神经氨酸的糖苷 键裂解的糖苷酶。许多具有神经氨酸苷酶的微生物对人和例如家禽、 马、猪和海豹等动物而言是致病性的。这些致病生物包含流感病毒。 神经氨酸苷酶与流感病毒的致病性有关。可能是因为它有助于新合成 的病毒粒子从受感染细胞中流出和有助于经由呼吸粘膜的病毒移动 (由于其水解酶的活性)。

“药物组合物”是指包含通式I的化合物和至少一种如下组分的 组合物，所述组分选自药学可接受的和药理学相容的填料、溶剂、稀 释剂、载体、佐剂、分配剂和赋形剂、递送剂，例如防腐剂、稳定剂、 填料、崩解剂、润湿剂、乳化剂、助悬剂、增稠剂、甜味剂、调味剂、 香味剂、抗菌剂、杀真菌剂、润滑剂、和延长递送控制剂，其选择和 适当的比例取决于给药和剂量的类型和方法。适合的助悬剂的实例是 乙氧基化的异硬脂醇、聚氧乙烯、山梨醇和山梨醇醚、微晶纤维素、 偏铝酸、膨润土、琼脂和黄芪胶以及它们的混合物。对微生物的防护 作用可以通过多种抗细菌剂和抗真菌剂来提供，例如，对羟基苯甲酸 酯类、氯丁醇、山梨酸及类似化合物。组合物还可以包含等渗剂，例 如，糖、氯化钠及类似化合物。组合物的延长作用可以通过减慢活性 成分的吸收的试剂来实现，例如单硬脂酸铝和明胶。适合的载体、溶 剂、稀释剂和递送剂的实例包含水、乙醇、多元醇和它们的混合物、 天然油(例如橄榄油)和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。填料的实例 是乳糖、牛奶糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸钙等。崩解剂和分配剂的 实例是淀粉、海藻酸、海藻酸盐和硅酸盐。适合的润滑剂的实例是硬 脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉和高分子量聚乙二醇。用于将单独 的或与其它活性化合物组合的活性成分经口给药、舌下给药、透皮给 药、肌内给药、静脉内给药、皮下给药、局部给药或直肠给药的药物 组合物可以以标准给药形式或者作为与常规药物载体的混合物给予人 和动物。适合的标准给药形式包含经口给药形式，例如片剂、胶囊、 丸剂、粉剂、颗粒剂、咀嚼胶和口服溶液或悬浮液；舌下和经面颊给 药形式；气雾剂；植入物；局部、透皮、皮下、肌内、静脉内、鼻内 或眼内的给药形式和直肠给药形式。

“药学可接受的盐”是指本发明中公开的酸或碱的相对无毒的有 机和无机盐。这些盐可以在化合物的合成、分离或纯化过程中原位制 备，或者可以专门地制备。具体地，碱的盐可以由经过纯化的所公开 化合物的碱与适合的有机或无机酸来制备。如此制备的盐的实例包含 盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、 草酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、 苯甲酸盐、乳酸盐、对甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、 琥珀酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙二酸盐、水杨酸盐、丙酸盐、乙 烷磺酸盐、苯磺酸盐、氨基磺酸盐等(这样的盐的性能的详细描述在下 述文献中给出：Berge S.M.等人，“Pharmaceutical Salts”J.Pharm. Sci.，1977,66:1-19)。所公开的酸的盐也可以通过经过纯化的酸与 适合的碱的特定的反应来制备。此外，也可以合成金属盐和胺盐。金 属盐是钠、钾、钙、钡、锌、镁、锂和铝的盐；优选钠盐和钾盐。可 用于制备金属盐的适合的无机碱是氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠和氢 化钠；氢氧化钾、碳酸钾和碳酸氢钾；氢氧化锂、氢氧化钙、氢氧化 镁、氢氧化锌。适合于制备所公开的酸盐的有机碱是胺和氨基酸，所 述氨基酸的碱强度应足以产生适合于医药目的应用(特别是它们具有 低的毒性)的稳定的盐。这种胺包含氨、甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、 二乙胺、三乙胺、苄胺、二苄胺、二环己胺、哌嗪、乙基哌啶、三(羟 甲基)氨基甲烷等。此外，可以使用某些四烷基铵氢氧化物来制备盐， 例如holine、四甲铵、四乙铵等。赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸可以用作 强碱性的氨基酸。

作者发现了前所未知的由通式1的氟取代的(3R,4R,5S)-4-乙酰 氨基-5-胍基-3-(戊烷-3-基氧基)环己烯-1-甲酸和它们的酯及它们的 药学可接受的盐和/或水合物所表示的新的神经氨酸苷酶抑制剂：

其中：

R表示氢、任选取代的C₁-C₅烷基、C₂-C₅烯基或C₂-C₅炔基；Rf表 示CH₂F或CHF₂。

作者出乎意料地发现，与奥塞米韦羧化物A2的效力相比，通式1 的新化合物针对某些其它流感株是更加有效得多(倍数为5-259)的神 经氨酸苷酶抑制剂(表1)。

表1.(3R,4R,5S)-5-胍基-4-氟乙酰氨基-3-(戊烷-3-基氧基)环 己烯-1-甲酸1.1和奥塞米韦羧化物A2对流感病毒的各谱株(panel  strains)的抗神经氨酸苷酶活性

作者发现，通式1的新化合物原来是比已知的扎那米韦更有效的 流感病毒的神经氨酸苷酶抑制剂(表2)。

表2.(3R,4R,5S)-5-胍基-4-氟乙酰氨基-3-(戊烷-3-基氧基)环 己烯-1-甲酸1.1和扎那米韦对流感病毒的各谱株(panel strains)的 抗神经氨酸苷酶活性。

最后，作者发现，与奥塞米韦羧化物和扎那米韦二者相比，新化 合物在MDCK细胞培养物中对流感病毒株Ia/California/07/09(H1N1) 和高致病性株Ia/duck/MN/1525/81(H5N1)更有效(表3)。特别地， (3R,4R,5S)-5-胍基-4-氟乙酰氨基-3-(戊烷-3-基氧基)环己烯-1-甲 酸1.1对Ia/California/07/09(H1N1)株的活性是奥塞米韦羧化物 (A2)的活性的13倍，且是扎那米韦的活性高的20倍，而其对高致病 性株Ia/duck/MN/1525/81(H5N1)的活性比奥塞米韦羧化物和扎那米 韦分别高24倍和16倍。

(3R,4R,5S)-5-胍基-4-(2-三氟乙酰氨基)-3-(戊烷-3-基氧基) 环己烯-1-甲酸A4表现出针对病毒A/California/04/09的神经氨酸苷 酶活性的IC₅₀＝80nM，针对病毒A/Vladivostok/16/09的神经氨酸苷 酶活性的IC₅₀>1000nM。前所未知的(3R,4R,5S)-5-胍基-4-氟乙酰氨基 -3-(戊烷-3-基氧基)环己烯-1-甲酸1.1针对病毒 A/California/04/09的神经氨酸苷酶活性比A4的活性大400倍，针 对病毒A/Vladivostok/16/09，新的酸1.1的IC₅₀＝4nM，即，它比已 知的4-(2-三氟乙酰氨基)类似物更有活性(倍数为250)。 (3R,4R,5S)-5-胍基-4-(2-二氟乙酰氨基)-3-(戊烷-3-基氧基)环己 烯-1-甲酸1.4也比其A4类似物更有活性：其对病毒 A/California/04/09的神经氨酸苷酶活性相当于IC₅₀＝0.3nM(即，它 比A2的活性大2.7倍，比A4的活性大267倍)；针对病毒 A/Vladivostok/16/09，新的酸1.4表现出IC₅₀＝7nM(可见，它比A2 更有活性(倍数为118)，也比A4更有活性(倍数为140))。

表3.与奥塞米韦羧化物(A2)和扎那米韦(Zan)相比， (3R,4R,5S)-5-胍基-4-氟乙酰氨基-3-(戊烷-3-基氧基)环己烯-1-甲 酸1.1在细胞培养物MDCK中对病毒株Ia/California/07/09(H1N1) 和高致病性株Ia/duck/MN/1525/81(H5N1)的比活性。

根据本发明，优选的化合物是其中R表示氢、甲基或乙基的通式 1的化合物。

根据本发明，更优选的通式1的化合物为(3R,4R,5S)-5-胍基-4- 氟乙酰氨基-3-(戊烷-3-基氧基)环己烯-1-甲酸1.1及其甲基酯1.2 和乙基酯1.3；(3R,4R,5S)-5-胍基-4-二氟乙酰氨基-3-(戊烷-3-基氧 基)环己烯-1-甲酸1.4及其甲基酯1.5和乙基酯1.6。

通式1的流感病毒神经氨酸苷酶抑制剂可以根据如下所示的反应 路线，以通式2的4-氨基-5-(叔丁氧羰基氨基)-3-(戊烷-3-基氧基) 环己烯-1-甲酸烷基酯为起始原料来制备：

由前所未知的通式1的(3R,4R,5S)-4-(2-氟乙酰氨基)-和 (3R,4R,5S)-4-(2,2-二氟乙酰氨基)-5-胍基-3-(戊烷-3-基氧基)环 己烯-1-甲酸和它们的酯及它们的药学可接受的盐表示的新的流感病 毒神经氨酸苷酶抑制剂还在流感病毒肺炎的动物模型中表现出高的抗 流感活性。

本文中公开的化合物的抗神经氨酸苷酶活性根据下述文献中描述 的方法来测定：[Who Collaborating Centre for Reference& Research on Influenza,Australia,Standard Operating Procedure  WHO-025.由Aeron Hurt，Senior Scientist综述，综述日期： 13/3/2009]。

根据本发明，通式1的新化合物为用于制备预防和治疗恒温动物 和人的流感的药物组合物和最终剂型的活性成分。

本发明的主题是包含治疗有效量的通式1的化合物或其药学可接 受的盐作为活性成分的药物组合物。

药物组合物可以包含药学可接受的赋形剂。药学可接受的赋形剂 是指在药剂学领域中使用的稀释剂、助剂和/或载体。根据本发明，具 有通式1的化合物或其药学可接受的盐和/或水合物的药物组合物可 包含其它活性成分，包含具有抗流感活性的那些活性成分，条件是这 样的其它活性成分不引起不希望的作用。

根据本发明，如果需要，药物组合物可以作为通过将所述组合物 与常规的药物载体混合而制备的各种形式用于临床实践。

根据本发明，用于药物组合物的载体是指在药剂学领域中用于制 备通常使用的剂型的那些载体，包括用于口服剂型的粘合剂、润滑剂、 崩解剂、溶剂、稀释剂、稳定剂、助悬剂、着色剂、调味剂；用于注 射剂型的防腐剂、增溶剂、稳定剂；用于局部给药剂型的基质材料、 稀释剂、润滑剂、防腐剂。

本发明的主题是通过将治疗有效量的至少一种通式1的活性成分 或其药学可接受的盐与惰性填料和/或溶剂混合来制备药物组合物的 方法。

本发明的主题还在于表现出抗流感活性的药物，所述药物为置于 药学可接受的包装中的片剂、胶囊或注射剂的形式并用于预防和治疗 人和恒温动物的流感，其包含治疗有效量的新的通式1的活性成分或 包括包含通式1的新活性成分的药物组合物。

本发明的主题还在于用于治疗流感的治疗试剂盒，包含作为组分 之一的新的药物或新的药物组合物，所述的新的药物或新的药物组合 物包含至少一种通式1的化合物或其药学可接受的盐和/或水合物作 为活性成分。

根据本发明，除了所述新的药物，所述用于治疗流感的治疗试剂 盒可以包含用于治疗流感的其它已知药物或增强患者免疫系统的药 物。

根据本发明，预防和治疗人和动物的流感的方法包括对患者给予 新的药物、新的药物组合物或新的治疗试剂盒。

本文中公开的药物可以经口给药或胃肠外给药(例如静脉内给 药、皮下给药、经腹膜内给药或局部给药)或借助于吸入器给药。通式 1的活性成分的临床剂量可以取决于以下因素来校正：活性成分在患 者机体中的治疗效能和生物可用度、它们的交换和从有机体中除去的 速率、患者的年龄和性别、以及患者症状的严重程度。因此，成人的 日摄入量通常为10-500mg，优选为50-300mg。在从药物组合物制备 作为剂量单元的药物时，要考虑上述有效剂量，这时，药物的每个剂 量单元包含10-500mg,优选50-300mg。根据医师或药剂师的指导， 药物可以在指定的时间周期内摄入若干次(优选为1-6次)。

本发明的主题还在于体内抑制神经氨酸苷酶(包括流感病毒的神 经氨酸苷酶)活性的方法，所述方法包括使神经氨酸苷酶接触通式1 的化合物的步骤。

实施例

以下通过具体实施例来描述本发明，所述实施例用于说明本发明 而非限制本发明的范围。

实施例1.(3R,4R,5S)-4-(2,2-二氟乙酰氨基)-5-胍基-3-(戊烷 -3-基氧基)环己烯-1-甲酸乙酯甲磺酸盐1.6·CH₃SO₃H的制备。将2,2- 二氟乙酸3b(0.624g,0.0065mol,1.2eq)滴加到(3R,4R,5S)-4- 氨基-5-(叔丁氧羰基氨基)-3-(戊烷-3-基氧基)环己烯-1-甲酸乙酯(2 g,0.0054mol,1eq.)、1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-醇(0.867g, 0.0065mol,1.2eq.)、N¹-((乙基亚氨基)亚甲基)-N²,N²-二甲基乙烷 -1,2-二胺盐酸盐(1.239g,0.0065mol,1.2eq.)和二异丙基乙胺 (2.212g,0.0178mol,3.3eq.)在THF(20ml)中的溶液中。将反应 混合物在室温下搅拌4小时。然后将溶剂真空蒸发，将残余物溶解于 乙酸乙酯中，用5％NaHCO₃溶液洗涤，用Na₂SO₄干燥、过滤并真空蒸 发。(3R,4R,5S)-5-(叔丁氧羰基氨基)-4-(2,2-二氟乙酰氨基)-3-(戊 烷-3-基氧基)环己烯-1-甲酸乙酯4b的收率是89％(2.15g)。 LCMS(M+H)：实测值449，计算值448.51。将制备的产物4b(2.15g, 0.0048mol)溶解于10％三氟乙酸的二氯甲烷溶液(20ml)中并在室温 下搅拌12小时。然后将溶剂真空蒸发，将残余物溶解于乙酸乙酯，用 5％NaHCO₃溶液洗涤，用Na₂SO₄干燥、过滤并真空蒸发。产物的收率为 96％(1.605g)。借助使用乙酸乙酯/THF作为洗脱剂的柱色谱法或通过 产物从己烷重结晶进行进一步的纯化。这样得到(3R,4R,5S)-5-氨基 -4-(2,2-二氟乙酰氨基)-3-(戊烷-3-基氧基)环己烯-1-甲酸乙酯5b， 将其溶解于二氯甲烷并加入等当量的甲磺酸。在10分钟内蒸发溶剂， 得到的产物用己烷洗涤并真空干燥。甲磺酸盐5b·CH₃SO₃H的收率为 90％。LCMS(M+H)：实测值349，计算值348.39。¹H NMR(DMSO-d₆),400 MHz:8.91(d,J＝13.2Hz,1H),7.83(br,3H),6.74(s,1H),6.22(t, J＝54Hz,1H),4.31(d,J＝8.4Hz,1H),4.16(q,J＝7.2Hz,2H), 3.45(m,1H),3.15(dd,J₁＝11.2Hz,J₂＝8.8Hz,1H),2.59(dd,J₁＝18 Hz,J₂＝6Hz,1H),2.38(m,1H),2.31(s,3H),1.66(m,1H),1.57(m, 1H),1.47(m,1H),1.39(m,1H),1.22(t,J＝7.6Hz,3H),0.891(t, J＝7.2Hz,3H),0.842(t,J＝7.2Hz,3H)。随后向在冰浴中冷却的 (3R,4R,5S)-5-氨基-4-(2,2-二氟乙酰氨基)-3-(戊烷-3-基氧基)环 己烯-1-甲酸乙酯5b(1.6g，0.004598mol，1eq.)的DMF(16ml)溶 液中添加三乙胺(2.57g，0.0253mol，5.5eq.)、N,N’-二-boc-硫脲 (0.00505mol，1.35g，1.1eq.)和氯化汞(I I)(0.0055mol，1.49g， 1.2eq.)。将得到的混合物在冰浴中冷却的情况下搅拌1.5小时。在 反应完成之后，将固体通过硅藻土过滤，将DMF真空蒸发，将残余物 溶解于乙酸乙酯，用5％NaHCO₃溶液洗涤，用Na₂SO₄干燥、过滤并真 空蒸发。得到1.82g(67％)的(3R,4R,5S)-5-((Z)-2,3-双(叔丁氧羰基) 胍基)-4-(2,2-二氟乙酰氨基)-3-(戊烷-3-基氧基)环己烯-1-甲酸乙 酯6b。LCMS(M+H)：实测值591，计算值590.67。将 (3R,4R,5S)-5-((Z)-2,3-双(叔丁氧羰基)胍基)-4-(2,2-二氟乙酰氨 基)-3-(戊烷-3-基氧基)环己烯-1-甲酸乙酯6b(1.82g，0.00308mol) 在10％三氟乙酸的二氯甲烷溶液(20ml)中在室温下搅拌12小时。然 后将溶剂真空蒸发，将残余物溶解于乙酸乙酯，用5％NaHCO₃溶液洗 涤，用Na₂SO₄干燥、过滤并真空蒸发。得到1.1g(92％)的 (3R,4R,5S)-4-(2,2-二氟乙酰氨基)-5-胍基-3-(戊烷-3-基氧基)环 己烯-1-甲酸乙酯1.6。向制备的产物的二氯甲烷溶液中加入等当量的 甲磺酸。在10分钟内蒸发溶剂，产物用己烷洗涤并真空干燥。得到 (3R,4R,5S)-4-(2,2-二氟乙酰氨基)-5-胍基-3-(戊烷-3-基氧基)环 己烯-1-甲酸乙酯的甲磺酸盐1.6·CH₃SO₃H,收率为95％。LCMS(M+H)： 实测值391，计算值390.43。¹H NMR(DMSO-d₆),400MHz:8.67(d, J＝8.4Hz,1H),7.63(d,J＝9.6Hz,1H),6.65(s,1H),6.27(t, J＝53.6Hz,1H),4.14(q,J＝7.2Hz,2H),4.12(m,7H),3.54(m,1H), 3.41(m,1H),2.6(m,1H),2.36(s,3H),1.66(m,1H),1.44(m,4H), 1.22(t,J＝7.2Hz,3H),0.856(t,J＝7.6Hz,3H),0.795(t,J＝7.6 Hz,3H)。

以类似的方式制备化合物1.7，即(3R,4R,5S)-5-胍基-4-(2,2-二 氟乙酰氨基)-3-(戊烷-3-基氧基)环己烯-1-甲酸烯丙基酯 (LCMS(M+H)：实测值354，计算值353.44,(针对A/California/04/09 病毒为IC₅₀<1nM)、和化合物1.8，即(3R,4R,5S)-5-胍基-4-(2,2-二 氟乙酰氨基)-3-(戊烷-3-基氧基)环己烯-1-甲酸丙-2-炔基酯 (LCMS(M+H)：实测值352，计算值351.42,(针对A/California/04/09 病毒为IC₅₀<1nM)，分别使用(3R,4R,5S)-4-氨基-5-(叔丁氧羰基氨 基)-3-(戊烷-3-基氧基)环己烯-1-甲酸烯丙基酯和(3R,4R,5S)-4-氨 基-5-(叔丁氧羰基氨基)-3-(戊烷-3-基氧基)环己烯-1-甲酸丙-2-炔 基酯作为起始原料(作为化合物2)。

使用相应的(3R,4R,5S)-4-氨基-5-(叔丁氧羰基氨基)-3-(戊烷 -3-基氧基)环己烯-1-甲酸酯作为起始原料(化合物2)，制备了以下化 合物：

(3R,4R,5S)-5-胍基-4-(2,2-二氟乙酰氨基)-3-(戊烷-3-基氧基) 环己烯-1-甲酸2-环己基酯1.9(LCMS(M+H)：实测值460，计算值 459.55，IC₅₀<1nM，针对A/California/04/09病毒；

(3R,4R,5S)-5-胍基-4-(2,2-二氟乙酰氨基)-3-(戊烷-3-基氧基) 环己烯-1-甲酸2-苯基乙基酯1.10(LCMS(M+H)：实测值454，计算值 453.51，IC₅₀<1nM，针对A/Cal ifornia/04/09病毒；

(3R,4R,5S)-5-胍基-4-(2,2-二氟乙酰氨基)-3-(戊烷-3-基氧基) 环己烯-1-甲酸2-吡啶-3-基乙基酯1.11(LCMS(M+H)：实测值455， 计算值454.49，IC₅₀<1nM，针对A/California/04/09病毒)；

(3R,4R,5S)-5-胍基-4-(2,2-二氟乙酰氨基)-3-(戊烷-3-基氧基) 环己烯-1-甲酸2-甲氧基乙基酯1.12(LCMS(M+H)：实测值422，计算 值421.46，IC₅₀<1nM，针对A/California/04/09病毒)。

实施例2.(3R,4R,5S)-4-(2-氟乙酰氨基)-5-胍基-3-(戊烷-3- 基氧基)环己烯-1-甲酸乙酯的甲磺酸盐1.3·CH₃SO₃H

根据实施例1中给出的操作使用单氟乙酸作为酰化剂制备。 LCMS(M+H)：实测值373，计算值372.44。

实施例3.(3R,4R,5S)-4-(2,2-二氟乙酰氨基)-5-胍基-3-(戊烷 -3-基氧基)环己烯-1-甲酸1.4.

将5％氢氧化锂溶液(2.5ml)加入到(3R,4R,5S)-5-((Z)-2,3-双 (叔丁氧羰基)胍基-4-(2,2-二氟乙酰氨基)-3-(戊烷-3-基氧基)环己 烯-1-甲酸乙酯6b(250mg)的二噁烷(5ml)溶液中并将反应混合物在 室温下搅拌45分钟。然后通过添加乙酸(300mcl)使氢氧化锂失效， 并真空蒸发溶剂。得到的固体用异丙醇提取，提取液用Na₂SO₄干燥并 真空蒸发。得到(3R,4R,5S)-5-((Z)-2,3-双(叔丁氧羰基)胍 基)-4-(2,2-二氟乙酰氨基)-3-(戊烷-3-基氧基)环己烯-1-甲酸 8b(200mg,84％)。LCMS(M+H)：实测值563，计算值562.62。将得 到的酸8b(200mg)溶解于10％三氟乙酸的二氯甲烷溶液(2ml)中并 在室温下搅拌12小时。然后将溶剂真空蒸发。通过HPLC方法分离 (3R,4R,5S)-4-(2,2-二氟乙酰氨基)-5-胍基-3-(戊烷-3-基氧基)环 己烯-1-甲酸1.4。LCMS(M+H)：实测值363，计算值362.28。¹H  NMR(DMSO-d₆),400MHz:8.68(d,J＝8.4Hz,1H),7.6(d,J＝10Hz, 1H),7.26(br,2H),6.91(br,2H),6.63(s,1H),6.27(t,J＝53.6 Hz,1H),4.18(d,J＝8Hz,2H),4.09(m,1H),3.54(q,J＝10Hz,1H), 3.39(m,2H),2.57(dd,J₁＝18Hz,J₂＝6Hz,1H),2.31(m,1H),1.44(m, 4H),0.85(t,J＝8Hz,3H),0.795(t,J＝7.6Hz,3H)。

实施例4.(3R,4R,5S)-4-(2-氟乙酰氨基)-5-胍基-3-(戊烷-3- 基氧基)环己烯-1-甲酸1.1

根据在实施例3中给出的操作制备。LCMS(M+H)：实测值345，计 算值345。¹H NMR(DMSO-d₆),400MHz:8.16(d,J＝10Hz,1H),7.56(d, J＝9.6Hz,1H),6.64(s,1H),4.80(d,J＝47.3Hz,2H),4.21(d, J＝8.4Hz,1H),3.89(q,J＝10.4Hz,1H),3.71(m,1H),2.67(m,1H), 2.25(m,1H),1.42(m,4H),0.85(t,J＝7.2Hz,3H),0.78(t,J＝7.2 Hz,3H)。

实施例5.(3R,4R,5S)-4-(2-氟乙酰氨基)-5-胍基-3-(戊烷-3- 基氧基)环己烯-1-甲酸甲酯的甲磺酸盐1.2·CH₃SO₃H

根据在实施例1中给出的操作制备，使用(3R,4R,5S)-4-氨基 -5-(叔丁氧羰基氨基)-3-(戊烷-3-基氧基)环己烯-1-甲酸甲酯作为起 始原料和单氟乙酸作为酰化剂。LCMS(M+H)：实测值359，计算值 358.42。

实施例6.(3R,4R,5S)-4-(2,2-二氟乙酰氨基)-5-胍基-3-(戊烷 -3-基氧基)环己烯-1-甲酸甲酯的甲磺酸盐1.5·CH₃SO₃H

根据在实施例1中给出的操作制备，使用(3R,4R,5S)-4-氨基 -5-(叔丁氧羰基氨基)-3-(戊烷-3-基氧基)环己烯-1-甲酸甲酯作为起 始原料和二氟乙酸作为酰化剂。LCMS(M+H)：实测值373，计算值 372.44。

实施例7.片剂形式的药物组合物的制备

将淀粉(1600mg)、乳糖颗粒(1600mg)、滑石粉(400mg)和 (3R,4R,5S)-4-(2-氟乙酰氨基)-5-胍基-3-(戊烷-3-基氧基)环己烯 -1-甲酸1.1(1000mg)小心地混合在一起并压成块料。将制备的块料 压碎成颗粒并过筛，收集14-16目尺寸的颗粒。将得到的颗粒制粒成 每个560mg重量的适当形式的片剂。

实施例8.胶囊形式的药物组合物的制备

将(3R,4R,5S)-4-(2-氟乙酰氨基)-5-胍基-3-(戊烷-3-基氧基) 环己烯-1-甲酸1.1与乳糖粉末以2:1比例小心地混合。将制备的粉末 混合物以每个300mg的量填充入适当大小的明胶胶囊中。

实施例9.用于肌内注射、腹膜内注射或皮下注射的注射剂型的 药物组合物的制备

将(3R,4R,5S)-4-(2-氟乙酰氨基)-5-胍基-3-(戊烷-3-基氧基) 环己烯-1-甲酸1.1(500mg)与氯丁醇(300mg)、丙二醇(2ml)和注射 用水(100ml)混合。将得到的溶液过滤并置于1ml安瓿中密封。

实施例10.通式1的化合物对流感病毒的神经氨酸苷酶的活性 的测定

在初步实验中，测定在奥塞米韦细胞培养物中制备的流感 A/California/07/09(H1N1)和A/Aichi/2/69(H3N2)的尿囊病毒株以 及抗药性流感病毒A/Vladivostok/16/09(H1N1)的工作稀释物。为 此，在圆底的96孔板中制备在反应缓冲液混合物(RBM,50mM MЕS,5 mM CaCl₂,pH 6.5)中的2倍稀释的60μl的每种病毒。从这个板将50 μl的2倍稀释的病毒转移到用于荧光测量的平底96孔板中 (FluoroNunc,黑色，目录编号237105)，然后向其中加入等量的底物 缓冲液(SB,12.5mM 2’-(4-甲基伞形酮-α-D-N-乙酰基神经氨酸, Sigma,40mM的乙酸盐缓冲液pH＝5.8)。使用每个孔不含病毒而含有 50μl RBM的孔作为对照。在将板在37℃轻轻振荡保温1小时之后， 向每个孔添加100μl的终止溶液(在11.0mL乙醇中含2.225mL的 0.824M NaOH)，随后使用Varioskan Flach(Thermo Scientific)仪器 在λ_ex＝360nM和λ_em＝448nM处测量荧光。进一步的实验选择对应于 影响曲线直线部分(病毒稀释物对荧光值)的中间部分的那些病毒稀释 物。为了测定抗神经氨酸苷酶活性，将本文中公开的化合物和它们的 式A2和A4的类似物的稀释液(各50μl，用RBM制备)加入到用于荧 光测量的平底96孔板(FluoroNunc，黑色，目录编号237105)的В到H 行的孔中(使用的浓度分别为0.03、0.3、3、30、300、3000、 30000nM，每行一个浓度)。A行的孔用作病毒对照，其中代替病毒而 加入等体积(50μl)的RBM。然后向相应的孔添加50μl的每种病毒的 选定工作稀释物(RBM)。作为对照，向这些孔加入代替病毒的等体积 的RBM。在搅拌和室温下保温45分钟后，向所有孔加入等体积的 RBM。在重复搅拌并将板在37℃保温1小时之后，向每个孔添加100 μl的终止溶液。使用Varioskan Flach(Thermo Scientific)仪器在 λ_ex＝360nM和λ_em＝448nM处测量荧光。所有测定以至少一式两份(板 的两个孔)进行。通过下式计算所测试的通式1的化合物的神经氨酸 苷酶活性抑制百分比∶抑制％＝100-(SUF实验，SUF对照/不含化合物 的SUF病毒对照，SUF对照)，其中SUF是荧光的标准单位)。将使 SUF值降低50％时的化合物浓度作为50％抑制浓度(IC₅₀)。

实施例11.通式1(1.1、1.3、1.4和1.6)的化合物对小鼠的流感 肺炎模型的抗流感活性研究。将预先称重的小鼠(雌性，非直系 (non-linear)，平均重量12-15g)在轻度乙醚麻醉下通过鼻内接种 感染流感病毒A/Aichi/2/69(H3N2)(10LD₅₀，50μl)。LD₅₀的测定是在 初步实验中使用相同小鼠进行尿囊病毒滴定进行的，然后将其用于正 式实验。采用以下的治疗方案：为动物注射两次∶感染之前的24小时 和1小时，在感染之后的24小时内，和在随后的5天期间每天一次。 对于经口给药，使用带有专用针头(灌洗)的一次性胰岛素注射器，研 究了以下剂量的作用：在100μl体积中的每种化合物，25mg/kg/天。 作为参考化合物，使用了剂量为5mg/kg/天到30mg/kg/天的Tamiflu。 “病毒对照”组以及用通式1或式A3的Tamiflu“化合物治疗”动物 组的每组动物都是10只动物。对“治疗的”动物和对照动物每天进行 观察，在感染之后的第一个5天期间每天称重，此外，在某天称重。 通过对致命性病毒感染的保护指数和使用试验化合物治疗的动物组与 对照组动物体重相比的体重损失来评价化合物在小鼠的流感肺炎模型 中的化学治疗活性。分别计算每只小鼠体重的降低或增加并表示为百 分比。感染之前的动物体重作为100％。对同一组的所有动物，测定体 重损失以及体重增加的平均百分比。

在初步实验中测定了在100μl体积中包含10LD₅₀的病毒剂量。 然后以这个剂量感染该组的所有动物。通过病毒感染之后感染动物的 存活动物数、平均中值寿命和体重变化来评价通式1的化合物对小鼠 流感肺炎模型的效力。

在观察的第7天发现，感染病毒且没有用试验化合物治疗的所有 小鼠(“病毒对照”组)都死掉了。

实验表明，在“病毒对照”组的最后一只动物死亡时，用通式1 的化合物和Tamiflu治疗的动物(“用化合物治疗的”动物)完全免于 死亡。

通式1的试验化合物和式A3的Tamiflu的抗流感作用包含使“经 过治疗的小鼠”组中的体重损失与“病毒对照”组相比速度减慢。动 物的体重损失是流感肺炎的临床指示之一。更严重的疾病过程总是伴 随着更大的动物体重损失。小鼠的称重在感染之后的1、2、3、4和5 天进行，然后每隔一天进行称重直到观察的第15天。结果发现，对于 “病毒对照”组的动物，在感染之后的第5天观察到最大的体重损失 (约10％)。与“病毒对照”组的动物相比，用通式1的化合物和Tamiflu 治疗的动物平均起来没有体重减轻。“治疗组”的所有动物都从第9 天开始显著地且稳定地增加体重。

由此表明了式1.1、1.3、1.4和1.6的化合物在治疗小鼠流感肺 炎中的高效力。

产业实用性

本发明可用于人用和兽用医药。