N-(1,3-二氧代异吲哚啉)芳酰胺类化合物及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及式(I)N-(1，3-二氧代异吲哚啉)芳酰胺类化合物及其制备方法，将式(II)氨基化合物与式(III)取代芳酰氯在缚酸剂作用下发生缩合反应，生成本发明式(I)N-(1，3-二氧代异吲哚啉)芳酰胺类化合物。本发明还公开了式(I)N-(1，3-二氧代异吲哚啉)芳酰胺类化合物在制备人体代谢类治疗药物及减肥类保健品中的应用，可作为线粒体解偶联剂、化学解偶联剂、葡萄糖消耗促进剂或细胞耗氧促进剂等，具广泛医药应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种N-(1，3-二氧代异吲哚啉)芳酰胺类化合物及其制备方 法和应用。

背景技术

线粒体在1850年被发现后，人们对于它的研究兴趣就一直没有消减过。线粒体为细胞的生 命活动提供场所，是细胞内氧化磷酸化和形成ATP的主要场所，被称为细胞″动力工厂″(power  plant)。另外，线粒体还有自身的DNA和遗传体系(Kim，H.R.；Won，E.J.；Choi，H.J.；et al， Mitochondrial DNA Minisatellites Showed Higher Informativeness and Sensitivity Than the Nuclear  DNA Markers for the Quantitative Determination of Chimerism After Allogeneic Stem Cell  Transplantation.Blood 2011，118(21)，1713-1713.)。但线粒体基因组的基因数量有限，是一种半 自主性的细胞器。

在线粒体中，经过电子传递系统产生的能量被用于ATP的合成，但某些化合物能够消除跨 线粒体内外膜的质子浓度梯度或电位梯度，使ATP不能合成，这种既不直接作用于电子传递体 也不直接作用于ATP合成酶复合体，只解除电子传递与ADP磷酸化偶联的作用称为解偶联作 用，其实质是只有氧化过程(电子照样传递)而没有磷酸化作用。这类化合物被称为解偶联剂 (Ozaki，S.；Kano，K.；Shirai，O.，Electrochemical elucidation on the mechanism ofuncoupling caused  by hydrophobic weak acids.Phys Chem Chem Phys 2008，10(30)，4449-55.)。

各种各样的大量的化合物被发现并证实为解偶联剂。它们当中大多数为质子型的弱酸，并 以解偶联的质子渗透模式表现。质子跨过内膜向膜间隙的转运使得膜间隙积累了大量的质子， 建立了质子梯度。由于膜间隙质子梯度的建立，使内膜两侧发生两个显著的变化：一是线粒体 膜间隙产生大量的正电荷，而线粒体基质产生大量的负电荷，使内膜两侧形成电位差；二是两 侧氢离子浓度的不同而产生pH差(ΔpH)，这两种梯度合称为电化学梯度(electrochemical  gradient)。线粒体内膜两侧电化学梯度的建立，能够形成质子运动力(proton-motive force，Δp)。 根据英国生物化学家P.Mitchell于1961年提出的解释氧化磷酸化偶联机理的假说(Mitchell，P.， Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemiosmotic type of mechanism. Nature 1961，191，144-8.)，这种电化学梯度正是ATP合成的直接能量动力。而质子型解偶联剂 消除或降低了这种电化学梯度，从而对人体代谢等多方面产生影响。

目前，对线粒体解偶联剂的研究已成为研究热点，已有报道明确了线粒体解偶联剂与许多 疾病有关，包括代谢综合症、神经退行性疾病、缺血-再灌注、癌症、衰老等(Wallace，D.C.，A  mitochondrial paradigm of metabolic and degenerative diseases，aging，and cancer：a dawn for  evolutionary medicine.Annu Rev Genet 2005，39，359-407.)。

发明内容

为了克服现有技术中人体代谢过程中解偶联剂对人体代谢的不良影响，本发明提供了一种 具有式(I)结构的N-(1，3-二氧代异吲哚啉)芳酰胺类化合物及其化合物制备方法和用途。

本发明提供一种N-(1，3-二氧代异吲哚啉)芳酰胺类化合物，其结构如以下式(I)所示：

式(I)中，芳环取代基R¹、R²、R³、R⁴、R⁵分别独立选自H、卤素、C1-C6的烷基、氰 基、甲氧基、或羟基；取代基R⁶选自C3-C16的烷基。

优选地，芳环取代基R¹、R²、R³、R⁴、R⁵分别独立选自H、F、Cl、Br、I、CH₃、CH₂CH₃、 CH(CH₃)₂、C(CH₃)₃、OCH₃、CN、OH；烷基取代基R⁶为i-Pr、n-Bu、i-Bu、CH₂CH₂CH(CH₃)₂、 CH₂CH(CH₂CH₃)CH₂CH₂CH₂CH₃、或(CH₂)_nCH₃，其中，n＝3、4、5、7、11、15。

较优选地，R¹为H、F、Cl、Br、I、CH₃、OCH₃、CN、或OH；R²为H、F、Cl、Br、CH₃、 OCH₃、CN、C(CH₃)₃、或OH；R³为H、F、Cl、Br、CH₃、OCH₃、CN、CH(CH₃)₂、C(CH₃)₃、 或OH；R⁴为H、F、Cl、Br、CH₃、OCH₃、C(CH₃)₃、或OH；R⁵为H、F、Cl、Br、CH₃、 OCH₃、或OH。

本发明式(I)N-(1，3-二氧代异吲哚啉)芳酰胺类化合物中，芳环取代基R¹、R²、R³、R⁴、 R⁵中含羟基化合物通过所述式(I)芳环取代基R¹、R²、R³、R⁴、R⁵中相对应的含甲氧基化合 物与三溴化硼脱甲基反应获得。

本发明还提供了一种式(I)N-(1，3-二氧代异吲哚啉)芳酰胺类化合物的制备方法，式(II) 所示的氨基化合物与式(III)所示的取代芳酰氯，在缚酸剂的作用下发生缩合反应，生成如式 (I)所示的N-(1，3-二氧代异吲哚啉)芳酰胺类化合物；

其中，芳环取代基R¹、R²、R³、R⁴、R⁵分别独立选自H、卤素、C1-C6的烷基、氰基、甲 氧基、或羟基；取代基R⁶选自C3-C16的烷基。

其中，式(I)中的芳环上含甲氧基取代化合物在BBr₃的作用下发生脱甲基反应，生成如 式(I)中所示相应的芳环含羟基取代化合物。其反应按现有BBr₃脱甲基技术制备。

本发明制备方法中，所述缚酸剂为三乙胺或吡啶。所述缚酸剂的加入量为式(II)化合物 的摩尔量的1.2～2.5倍。所述三溴化硼BBr₃的加入量为式(I)化合物的摩尔量的1.5～4倍；所 述加入三溴化硼BBr₃的浓度为1mol/L CH₂Cl₂的配制液。

本发明还提供式(I)所示的N-(1，3-二氧代异吲哚啉)芳酰胺类化合物作为制备人体代谢类 治疗药物、减肥类保健品中的用途。

本发明应用中，所述式(I)N-(1，3-二氧代异吲哚啉)芳酰胺类化合物是用作线粒体膜电位 (简称MMP)抑制剂。本发明应用中，所述式(I)N-(1，3-二氧代异吲哚啉)芳酰胺类化合物作 为化学解偶联剂。

本发明应用中，所述式(I)N-(1，3-二氧代异吲哚啉)芳酰胺类化合物作为葡萄糖消耗的 促进剂。本发明应用中，所述式(I)N-(1，3-二氧代异吲哚啉)芳酰胺类化合物作为细胞耗氧 的促进剂。

本发明式(I)N-(1，3-二氧代异吲哚啉)芳酰胺类化合物与现有MMP抑制剂或化学解偶联剂 的结构不同。本发明优点包括：本发明式(I)N-(1，3-二氧代异吲哚啉)芳酰胺类化合物作为MMP 抑制剂和/或化学解偶联剂，可用于制备人体代谢类治疗药物、减肥类保健品。

本发明有益效果还包括，式(I)N-(1，3-二氧代异吲哚啉)芳酰胺类化合物可作为线粒体解 偶联剂、化学解偶联剂、葡萄糖消耗促进剂或细胞耗氧促进剂等，在代谢类治疗及减肥保健治 疗等领域具广泛应用前景，其制备方法步骤少，收率高；其应用细胞安全性好，成药性佳。

附图说明

图1表示本发明式(I)化合物中的化合物I₁₀₀₁(R¹＝OH，R²＝H，R³＝H，R⁴＝Cl，R⁵＝H， R⁶＝CH₂CH₂CH(CH₃)₂)在细胞水平上表现出对葡萄糖消耗的明显促进并且表现对细胞耗氧能 力的明显促进。图1(A)所示为对葡萄糖消耗作用，图1(B)所示为对细胞耗氧作用。

图2表示细胞水平上本发明化合物I₁₀₂₉，I₁₀₉₃葡萄糖消耗、乳酸生成及葡萄糖吸收评估。 图2(A)为I₁₀₂₉，I₁₀₉₃葡萄糖消耗，图2(B)为I₁₀₂₉，I₁₀₉₃乳酸生成，图2(C)为I₁₀₂₉葡 萄糖吸收，图2(D)为I₁₀₉₃葡萄糖吸收。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限 于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点 都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试 剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明 没有特别限制内容。以下实施例所用的原料均为市售分析纯化学品。

本发明制备方法中，所用原料式(II)化合物(R⁶＝i-Pr、n-Bu、i-Bu、CH₂CH₂CH(CH₃)₂、 CH₂CH(CH₂CH₃)CH₂CH₂CH₂CH₃、(CH₂)_nCH₃，同时n＝3、4、5、7、11、15)，其制备过程 为：将邻苯二甲酰亚胺硝化后与卤代烷烃缩合再还原硝基得到，具体合成方法可参见文献(1) Organic Syntheses，Coll.Vol.2，p.459(1943)；Vol.16，p.58(1936)；文献(2)John H.Billman and  R.Vincent Cash，4-Nitrophthalimides.I.Derivatives of Alkyl Halides Giving a Saponification  Equivalent.Journal of the American Chemical Society 1953，75，2449-2501；及(3)Fibers and  Polymers 2008，Vol.9，No.2，143-151。

本发明制备方法中，所用原料式(III)化合物取代苯甲酰氯是由对应的取代苯甲酸经氯 化亚砜或草酰氯制得，按现有技术制备。

实施例1化合物I₁₀₀₃(R¹＝H，R²＝H，R³＝H，R⁴＝H，R⁵＝H，R⁶＝CH₂CH₂CH(CH₃)₂)的制 备。

将新制的苯甲酰氯III(2.5mmol，350mg)，催化量DMF和II(R⁶＝CH₂CH₂CH(CH₃)₂，2 mmol，464mg)溶于CH₂Cl₂(10mL)中，在氮气保护冰水浴条件下，缓慢加入吡啶(0.16mL)， 自然升至室温后反应4个小时。将反应物浓缩后，用5％稀HCl洗涤，将混合物过滤后用 95％EtOH重结晶得到白色固体化合物I₁₀₀₃。收率：91％；mp 169-170℃；¹H NMR(500MHz， CDCl₃)δ0.96(d，J＝6.2Hz，6H)，1.53-1.57(m，3H)，3.68(t，J＝7.3Hz，2H)，7.53(t，J＝7.4Hz， 2H)，7.61(t，J＝7.1Hz，1H)，7.83(d，J＝8.0Hz，1H)，7.91(d，J＝7.4Hz，2H)，8.09(d，J＝8.3Hz， 1H)，8.12(s，1H)，8.23(s，1H)；HRMS(ESI)：Calcd for C₂₀H₂₁N₂O₃[M+H]⁺，337.1552；Found， 337.1611。

实施例2化合物I₁₀₄₁(R¹＝OCH₃，R²＝H，R³＝H，R⁴＝H，R⁵＝H，R⁶＝CH₂CH₂CH(CH₃)₂) 的制备。

合成方法类似于实施例1，其中将以新制的邻甲氧基苯甲酰氯(III)替代新制苯甲酰氯 (III)。产物化合物I₁₀₄₁为白色固体；收率：91％；mp 153-154℃；¹H NMR(500MHz，CDCl₃) δ0.96(d，J＝6.5Hz，6H)，1.54-1.63(m，3H)，3.68(t，J＝7.0Hz，2H)，4.10(s，3H)，7.06(d，J＝ 8.5Hz，1H)，7.16(t，J＝7.5Hz，1H)，7.52(t，J＝7.0Hz，1H)，7.80(d，J＝8.0Hz，1H)，8.04(d，J＝ 1.5Hz，1H)，8.14(dd，J₁＝1.5Hz，J₂＝8.0Hz，1H)，8.28(dd，J₁＝1.5Hz，J₂＝7.5Hz，1H)，10.22 (s，1H)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)δ168.1，168.1，163.5，157.2，143.8，134.0，133.7，132.7， 126.7，124.3，124.3，121.9，120.9，114.4，111.6，56.4，37.3，36.5，25.9，22.4，22.4；HRMS(ESI)： Calcd for C₂₁H₂₃N₂O₄[M+H]⁺，367.1652；Found，367.1641。

实施例3～31

合成方法类似于实施例1，制备得到的产物结构分别如下表1。

表1

实施例32化合物I₁₀₂₂(R¹＝OH，R²＝H，R³＝H，R⁴＝H，R⁵＝H，R⁶＝CH₂CH₂CH(CH₃)₂) 的制备。

将化合物I(R¹＝OCH₃，R²＝H，R³＝H，R⁴＝H，R⁵＝H，R⁶＝CH₂CH₂CH(CH₃)₂，1mmol，366mg) 溶于CH₂Cl₂(5mL)中，在N₂/丙酮-80℃条件下，然后把BBr₃/CH₂Cl₂溶液(1mole/L，1.5mL) 滴加入反应体系中；滴加完毕后，将反应体系至于氮气保护环境下，自然升至室温反应过夜。 反应结束后，用10mL水小心将反应淬灭，用EtOAc萃取3次，合并有机相，饱和食盐水 洗涤，无水MgSO₄干燥，浓缩得到产品，为白色固体；收率：90％；mp 170-171℃；¹H NMR (400MHz，DMSO)δ11.40(s，1H)，10.81(s，1H)，8.33(s，1H)，8.04(d，J＝8.2Hz，1H)，7.89(d，J ＝7.9Hz，1H)，7.85(d，J＝8.2Hz，1H)，7.46(t，J＝7.7Hz，1H)，7.09-6.93(m，2H)，3.58(t，J＝ 7.1Hz，2H)，1.63-1.36(m，3H)，0.92(d，J＝6.3Hz，6H)；¹³C NMR(100MHz，DMSO)δ167.6， 167.5，166.6，157.5，143.9，133.8，133.0，129.5，126.0，124.6，124.0，119.2，118.5，117.1，114.0，36.8， 35.8，25.2，22.2(2C)；HRMS(ESI)：Calcd for C₂₀H₂₀N₂NaO₄[M+Na]⁺，375.1315；Found， 375.1354。

实施例33化合物I₁₀₀₂(R¹＝OH，R²＝H，R³＝Cl，R⁴＝H，R⁵＝H，R⁶＝CH₂CH₂CH(CH₃)₂) 的制备。

合成方法类似于实施例32。白色固体；收率：62％；mp 192-194℃；¹H NMR(500MHz， DMSO)δ0.91(d，J＝6.4Hz，6H)，1.47(q，J＝7.0Hz，2H)1.52-1.56(m，1H)，3.56(t，J＝7.2Hz， 2H)，6.56(d，J＝8.5Hz，1H)，6.69(s，1H)，7.76(d，J＝8.5Hz，1H)，7.79(d，J＝8.1Hz，1H)，7.85 (d，J＝8.2Hz，1H)，8.34(s，1H)，13.70(s，1H)；¹³C NMR(125MHz，DMSO)δ167.8，167.6，166.1， 137.7，137.2，133.2，131.1，124.9，124.1，123.9，118.6，117.5，114.6，113.5，107.9，36.8，35.8，25.3， 22.2，22.2；HRMS(ESI)：Calcd for C₂₀H₂₀ClN₂O₄[M+H]⁺，387.1106；Found，387.1152。

实施例34化合物I₁₀₉₃(R¹＝OH，R²＝H，R³＝Cl，R⁴＝H，R⁵＝H，R⁶＝CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃的制备。

合成方法类似于实施例32。白色固体；收率：91％；mp 192-193℃；¹H NMR(500MHz， CDCl₃)δ0.92(t，J＝7.3Hz，3H)，1.29-1.37(m，4H)，1.68(p，J＝7.3Hz，2H)，3.69(t，J＝7.3Hz， 2H)，6.97(dd，J₁＝1.5Hz，J₂＝8.5Hz，1H)，7.12(d，J＝1.5Hz，1H)，7.68(d，J＝8.5Hz，1H)，7.89 (d，J＝8.0Hz，1H)，8.13(d，J＝8.5Hz，1H)，8.17(s，1H)，8.68(s，1H)，11.79(s，1H).¹³C NMR (125MHz，CDCl₃)δ168.2，168.0，167.8，162.6，142.4，141.2，133.8，127.9，127.0，125.2，124.5， 119.8，119.2，115.3，112.9，38.4，29.0，28.3，22.3，13.9；HRMS(ESI)：Calcd for C₂₀H₁₉ClN₂NaO₄[M+Na]⁺，409.0926；Found，409.0917。

实施例35化合物I₁₀₄₃(R¹＝OH，R²＝H，R³＝H，R⁴＝H，R⁵＝H，R⁶＝CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃的制备。

合成方法类似于实施例32。白色固体；收率：80％；mp 156-157℃；¹H NMR(500MHz， DMSO)δ0.85(t，J＝7.0Hz，3H)，1.24-1.33(m，4H)，1.60(p，J＝7.0Hz，2H)，3.54(t，J＝7.0Hz， 2H)，6.96-7.02(m，2H)，7.44(t，J＝7.0Hz，1H)，7.82(d，J＝8.0Hz，1H)，7.91(d，J＝8.0Hz，1H)， 8.03(dd，J₁＝2.0Hz，J₂＝8.0Hz，1H)，8.30(s，1H)，10.74(s，1H)，11.38(s，1H)；¹³C NMR(125 MHz，DMSO)δ167.5，167.3，166.6，157.7，143.8，133.7，132.8，129.3，125.9，124.6，123.8，119.0， 118.0，117.0，114.1，37.2，28.3，27.4，21.5，13.6；HRMS(ESI)：Calcd for C₂₀H₂₀N₂NaO₄[M+Na]⁺， 375.1315；Found，375.1337。

实施例36化合物I₁₁₀₇(R¹＝OH，R²＝H，R³＝H，R⁴＝Cl，R⁵＝H，R⁶＝CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃的制备。

合成方法类似于实施例3。白色固体；收率：94％；mp 163-166℃；¹H NMR(500MHz， CDCl₃)δ0.85(t，J＝6.5Hz，3H)，1.25(d，J＝3.0Hz，6H)，1.61(p，J＝6.5Hz，2H)，3.66(t，J＝7.5 Hz，2H)，7.01(d，J＝9.0Hz，1H)，7.41(dd，J₁＝2.0Hz，J₂＝8.5Hz，1H)，7.73(d，J＝2.5Hz，1H)， 7.84(d，J＝8.0Hz，1H)，8.12(dd，J₁＝2.0Hz，J₂＝8.0Hz，1H)，8.16(d，J＝1.5Hz，1H)，8.87(s， 1H)11.50(s，1H).¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)δ168.3，167.8，167.4，160.2，142.4，135.1，133.6， 127.7，125.8，125.2，124.5，124.0120.5，115.3(2C)，38.3，31.3，28.6，26.5，22.5，13.9；HRMS(ESI)： Calcd for C₂₁H₂₁ClN₂NaO₄[M+Na]⁺，423.1082；Found，423.1059。

实施例37化合物I₁₁₂₃(R¹＝OH，R²＝H，R³＝H，R⁴＝Br，R⁵＝H，R⁶＝CH₂CH(CH₃)₂的制 备。

合成方法类似于实施例32。白色固体；收率：95％；mp 359-361℃；¹H NMR(500MHz， DMSO)δ0.88(d，J＝7.0Hz，6H)，1.96-2.05(m，1H)，3.39(d，J＝7.0Hz，2H)，7.00(d，J＝8.5 Hz，1H)，7.60(dd，J₁＝2.5Hz，J₂＝9.0Hz，1H)，7.87(d，J＝8.0Hz，1H)，7.98(d，J＝2.5Hz，1H)， 8.04(dd，J₁＝2.0Hz，J₂＝8.0Hz，1H)，8.31(d，J＝1.5Hz，1H)，10.82(s，1H).11.50(br，1H)；¹³C NMR(125MHz，DMSO)δ167.9，167.7，165.1，156.5，143.8，135.9，132.9，131.6，126.1，124.7， 124.1，119.4，114.2(2C)，110.2，44.8，27.4，20.0(2C)；HRMS(ESI)：Calcd for C₁₉H₁₇BrN₂NaO₄[M+Na]⁺，439.0264；Found，439.0252。

实施例38化合物I₁₀₂₉(R¹＝OH，R²＝H，R³＝H，R⁴＝Cl，R⁵＝H，R⁶＝CH₂CH₂CH₂CH₃的制 备。

合成方法类似于实施例32。白色固体；收率：40％；mp 189-190℃；¹H NMR(500MHz， CDCl₃)δ0.95(t，J＝7.5Hz，3H)，1.24-1.26(m，2H)，1.53-1.59(m，2H)，3.70(t，J＝7.5Hz，2H)， 7.04(d，J＝9.0Hz，1H)，7.46(d J＝9.0Hz，1H)，7.64(s，1H)，7.88(d，J＝8.0Hz，1H)，8.01(d，J＝ 9.0Hz，1H)，8.19(s，1H)，8.48(s，1H)，11.49(s，1H)；HRMS(ESI)：Calcd for C₁₉H₁₈ClN₂O₄[M+H]⁺，373.0955；Found，373.0965.

实施例39～40

合成方法类似于实施例32，制备得到的产物结构分别如下表2。

表2

实施例41：细胞水平上化合物I解偶联活性测试评估

L6肌管细胞在耗氧测试特定的96孔板中进行分化，分化完成后，按照Seahorse  XFe Assay操作系统加入不同的化合物进行耗氧检测。

式(I)化合物在L6肌管细胞上筛选解偶联活性结果如下表3。

表3：式(I)化合物解偶联活性

注释：耗氧分析在L6肌管细胞上进行。每个化合物测试在3-4个独立实验。Maximal Uncoupling：最大解偶联程度相对于 DMSO组。U₅₀：达到最大解偶联作用50％的样品浓度。*经典解偶联剂FCCP作为阳性对照2500％vs DMSO组在05μM。

实施例42：细胞水平上化合物I葡萄糖消耗、乳酸生成及葡萄糖吸收评估

由于化合物解偶联作用的存在，使得对葡萄糖的消耗加剧，通过测定细胞外葡萄糖的减 少量从而推知细胞摄入葡萄糖的相对量以反映细胞内的生命活动状态。这种作用同时可能带 来乳酸生成量的改变，本发明通过测试进行评估。

测试方法：

1、L6myotubes细胞以6000/孔接入透明96孔板中，第二天换液分化，隔天换液，连续 分化5天；

2、细胞分化程度大于50％时可用于葡萄糖消耗实验；

3、用含0.5％BSA的低糖培养基稀释化合物，DMSO含量为1％；

4、化合物处理的时间为12h；

5、使用葡萄糖检测试剂盒检测培养基的葡萄糖量，用总的葡萄量(同样点于板上在培养 箱中蒸腾)减去培养基中剩余葡萄糖量便是所消耗的葡萄糖量；

6、同时吸取4μl，用乳酸测定试剂盒检测培养基中乳酸的含量。

葡萄糖吸收测试：

1、L6肌管细胞在24孔板上分化好后，饥饿2小时后给予化合物处理2.5小时。

2、化合物处理完成后，每孔用500ul37度预热的HBSS buffer洗1遍，加入450ul含有 化合物的HBSS处理半小时。

3、每孔加入50ul含2-DG和H3标记2-DG的HBSS，混匀。

4、置于培养箱中15min，后用冰的PBS(500ml每孔)洗3次，置于烘箱中干燥1h。

5、第二天取出每孔加入200ul含0.1％Trixton X-100的PBS，置于冰箱中裂解2-3h。

6、将每孔中的液体取150ul移至1.5ml EP管中。

7、每管加入1ml的闪烁液，上下颠倒混匀。

8、读数。

化合物I₁₀₉₃、I₁₀₂₉的测试结果如图2所示，表示细胞水平上本发明化合物I₁₀₂₉，I₁₀₉₃葡萄 糖消耗、乳酸生成及葡萄糖吸收评估。

为了消除细胞毒性对于糖耗实验的影响，在糖耗和乳酸生成测试的同时加入L6细胞的 SRB分析并将实验结果整理，测试化合物采用1.25～40μM六个浓度在低糖培养基(5.55mM  glucose)，采用3个副孔实验：*，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001与DMSO空白组对 照。阳性对照Berberine采用10μM的测试浓度，简写为BBR。

如图1所示，本发明化合物I₁₀₀₁(R¹＝OH，R²＝H，R³＝H，R⁴＝Cl，R⁵＝H，R⁶＝CH₂CH₂CH(CH₃)₂) 在细胞水平上表现出对葡萄糖消耗的明显促进，并且表现对细胞耗氧能力的明显促进。

如图1(A)所示，化合物I₁₀₀₁(R¹＝OH，R²＝H，R³＝H，R⁴＝Cl，R⁵＝H，R⁶＝CH₂CH₂CH(CH₃)₂) 浓度在5μM和10μM时有明显促进葡萄糖消耗的作用，细胞对葡萄糖消耗量为DMSO对照组 150％以上，同时也高于阳性对照化合物小檗碱(Berberine/BBR)在10μM的对葡萄糖消耗。

如图1(B)所示，化合物I₁₀₀₁(R¹＝OH，R²＝H，R³＝H，R⁴＝Cl，R⁵＝H，R⁶＝CH₂CH₂CH(CH₃)₂) 在0.625μM到40μM的7个浓度中均有效提高了细胞的耗氧水平，其中，在1.25μM时将细 胞的基本耗氧水平提高到300％。