一次细针穿刺材料提取基因组DNA和RNA的方法

摘要

本发明公开了一种一次细针穿刺活检材料提取基因组DNA和RNA的方法。本发明是将微量活检材料用涡旋混合器对细胞裂解液和样品进行混合，以实现对DNA和RNA的同时提取，替代了传统液氮研磨或机械粉碎方法由于操作过程中样品损失过大而只能分别对DNA和RNA进行提取。本发明的操作步骤简单，成本低，所需样本量少，实验操作时间短，有效的防止DNA和RNA降解；提取后的DNA和RNA的浓度、纯度和完整性，能够满足后续的基因组学各方面的分析要求。

说明书

技术领域

本发明涉及分离、制备或纯化DNA或RNA的方法，具体是一种一次细针穿刺材料提取基因组DNA和RNA的方法，可供下游基因组学分析。

背景技术

据我国卫生部和科技部在全国范围内进行的第三次居民死亡原因抽样调查结果表明：恶性肿瘤已成为我国第二位死亡原因，占死亡总数的22.32%，仅次于脑血管病，在城市更是高居死因首位(占城市死亡总数的25.0%)。近30年以来，癌症发病数以年均3%～5%的速度递增。目前，医学上采用的传统的影像学诊断、组织细胞学诊断都是对已经形成肿瘤组织块的样本进行分析，不能及时发现肿瘤的踪迹。由于传统的方法存在上述滞后的问题，肿瘤分子诊断由此诞生，其最大优点在于能早期甚至“超早期”发现肿瘤特有的突变基因，在这些基因突变尚未累积形成肿瘤组织块时，就能及时发现肿瘤踪迹，从而实现有效干预。其中，基因分子检测是实现“三早”的根本途径之一。目前，化疗总体有效率在30%到40%，而通过基因检测筛选出获益病人，有效率可以提高到80%。

肿瘤个体化医疗系统生物学基因组技术综合检测是一种全新的个性化治疗方法，其原理是利用细针穿刺活检材料，采用多种基因组技术（下代测序、RNA表达谱、拷贝数变化）和系统生物方法，捕捉到的不仅是个体的细胞畸变，还有在所有已知的细胞生物中的复杂交互。目前的研究表明，癌症的诱因是多种多样的。肿瘤个体化医疗系统生物学基因组技术综合检测能够在全基因组监测条件下，对不同的人采用不同的靶向治疗方法。该项目可同时应用于健康人群及高危人群的癌症患病风险分析和癌症病人的疾病探源、治疗辅助诊断、用药指导等。

肿瘤个体化医疗系统生物学基因组技术综合检测需要用肿瘤组织（穿刺活检或手术取材）来进行DNA和RNA分离提取。但目前传统的总RNA 制备方法（Trizol法、CTAB-LiCl 法、CTAB-异丙醇法、异硫氰酸胍热苯酚法）和DNA制备方法（浓盐法、阴离子去污剂法、苯酚抽提法、水抽提法）不能充分满足对一次细针穿刺的微量活检材料同时提取DNA和RNA的要求，微创活检材料有限是目前进行多层面全基因组检测的最大瓶颈。

发明内容

本发明就是为了解决活检材料少而不能满足多层面全基因组学分析需求的问题，而提供的一种一次细针穿刺活检材料提取基因组DNA和RNA的方法。

本发明是按以下技术方案实现的。

一种一次穿刺材料提取基因组DNA和RNA的方法，步骤如下：

a.将一次细针穿刺材料置于细胞裂解液中, 室温孵育；

b.使用涡旋混合器对上述混合物进行涡旋混匀，静置，重复涡旋混匀和静置步骤；

c.取1/4体积的细胞裂解液混合物用于分离RNA；

d.剩余细胞裂解液混合物用于分离DNA；

所述步骤c中分离RNA的步骤为：

Ⅰ.向细胞裂解液混合物中加入TRIzol，用涡旋混合器作匀浆处理，室温静置，再加入氯仿，振荡，室温静置；

Ⅱ.低温条件下离心，吸取上层水相，加入异丙醇沉淀RNA，室温静置；

Ⅲ.低温条件下离心，弃掉上清液， 加入75%乙醇洗涤RNA沉淀；

Ⅳ.在低温、低离心力条件下离心，弃掉上清液，室温静置，加入无RNase的水、0.5%十二烷基磺酸钠或100%的去离子甲酰胺溶液，悬浮沉淀，充分溶解RNA，-70℃保存备用；

所述步骤d中分离DNA的步骤为：

Ⅰ.向剩余裂解液混合物中加入蛋白酶K，混匀，水浴，振荡，离心，吸取上清液；

Ⅱ.加入Ⅰ步所述上清液2倍体积的异丙醇，混匀，再加入与上清液、异丙醇混合后体积相等的酚:氯仿:异戊醇混合物，混匀，离心；

Ⅲ.取上层溶液并加入与上层溶液等体积的氯仿:异戊醇混合溶液，混匀，离心； 

Ⅳ.取上层溶液并加入上层溶液1/2体积的乙酸氨，再加入上层溶液2倍体积的无水乙醇，混匀，室温静置，离心； 

Ⅴ.弃掉上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，离心； 

Ⅵ.弃掉上清液及管壁残液，加入TE溶液重新溶解沉淀物，置于4℃或-20℃保存备用。

这样设计的本发明，用涡旋混合器对一次细针穿刺获得的约几毫克的活检样品和细胞裂解液进行涡旋混匀替代传统液氮研磨或机械粉碎组织匀浆方法对样品进行处理，使得提取DNA和RNA的方法操作步骤简单，成本低；使用一次细针穿刺获得的活检材料可以同时对DNA和RNA进行提取，所需样本量少，减少了实验操作时间，有效的防止DNA和RNA降解；同时，使用本发明所述的方法提取的DNA和RNA的浓度、纯度和完整性能够满足后续对全基因组拷贝数、全基因组表达和全外显子测序等分析的要求。

附图说明

图1是样品1提取的RNA完整性检测图；

图2是样品2提取的RNA完整性检测图；

图3是样品3提取的RNA完整性检测图；

图4是样品4提取的RNA完整性检测图；

图5是样品5提取的RNA完整性检测图；

图6是琼脂糖电泳检测五个样品提取的DNA完整性检测图；

图7是样品1提取的RNA全基因组基因表达分析图；

图8是样品2提取的RNA全基因组基因表达分析图；

图9是样品3提取的RNA全基因组基因表达分析图；

图10是样品4提取的RNA全基因组基因表达分析图；

图11是样品5提取的RNA全基因组基因表达分析图；

图12是样品1提取的DNA全基因组拷贝数变异分析图;

图13是样品2提取的DNA全基因组拷贝数变异分析图;

图14是样品3提取的DNA全基因组拷贝数变异分析图;

图15是样品4提取的DNA全基因组拷贝数变异分析图;

图16是样品5提取的DNA全基因组拷贝数变异分析图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细的说明。

一. 主要材料及设备

本发明所采用的样品为经过一次细针（7#）穿刺得到的活检材料。

TRIzol—Invitrogen公司。

细胞裂解液的成分为：三羟甲基氨基甲烷（Tris）终浓度为100 mmol/L、乙二胺四乙酸（EDTA）终浓度为500 mmol/L、氯化钠（NaCl）终浓度为20 mmol/L、十二烷基硫酸钠（SDS）终浓度为10%、胰RNA酶终浓度为20ug/ml。

TE溶液的成分为：三羟甲基氨基甲烷（Tris）终浓度为10 mmol/L、乙二胺四乙酸（EDTA）终浓度为1 mmol/L。

酚:氯仿:异戊醇混合溶液的体积比为25:24:1。

氯仿:异戊醇混合溶液的体积比为24:1。

涡旋混合器—美国伯乐公司 BR-2000。

离心机—德国艾本德公司5804R。

二.    DNA和RNA提取方法

使用一次细针穿刺活检材料提取基因组DNA和RNA的方法，步骤如下：

a.将细针穿刺活检材料全部置于150～300 ul细胞裂解液中, 在室温孵育5～18min；

b.使用涡旋混合器对上述混合物进行涡旋混匀1～3 min，静置1～5min，本操作重复2～6次；

c.取1/4体积的细胞裂解液混合物用于分离RNA；

d.剩余细胞裂解液混合物用于分离DNA；

所述步骤c中分离RNA的步骤为：

Ⅰ.向50ul细胞裂解液混合物中加入0.5～2 ml TRIzol，用涡旋混合器进行匀浆处理1min；

Ⅱ.将匀浆样品在室温下放置2～8min，使核酸蛋白复合物完全分离；

Ⅲ.向匀浆样品中加入0.1～0.4 ml的氯仿，剧烈振荡10～22s，室温放置2～6min；

Ⅳ.2～8℃的条件下8500～12000×g离心9～30min，吸取上层水相中的液体；

Ⅴ.把水相中的液体转移到新离心管中，加入0.2～0.8 ml的异丙醇沉淀水相中的RNA，室温放置7～20min；

Ⅵ.2～8℃的条件下8500～12000×g离心9～30min，弃掉上清液；

Ⅶ.至少加入1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀；在2～8℃，离心力不超过7500×g的条件下离心3～10min，弃掉上清液；

Ⅷ.室温放置5～10min，加入10～30μl无RNase的水、0.5% SDS或100%的去离子甲酰胺溶液，用移液器吸打几次，55～60℃放置7～20min使RNA溶解，-70℃保存备用；

所述步骤d中分离DNA的步骤为：

Ⅰ.取剩余裂解液混合物转入离心管中，加入500μg/ml蛋白酶K 15～25μl，混匀；在60～70℃恒温水浴锅中水浴25～55min，或37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管3～5次，13400×g离心3～9min，吸取上清液到新离心管中；

Ⅱ.加入340μl的异丙醇，倒转混匀；

Ⅲ.加入510μl的酚:氯仿:异戊醇混合溶液振荡混匀，13400×g离心3～9min；

Ⅳ.取上层溶液至一个新离心管，加入500μl的氯仿:异戊醇混合溶液，振荡混匀，13400×g离心2～8min； 

Ⅴ.取上层溶液至一个新离心管，加入250μl的7.5mol/L乙酸氨，再加入1ml的无水乙醇，混匀，室温沉淀1～6min，13400×g离心6～15min； 

Ⅵ.弃掉上清液，除去管壁上的残余液体；

Ⅶ. 用1～2 ml 70%乙醇洗涤沉淀物1～3次，13400×g离心3～9min； 

Ⅷ.弃掉上清液，除去管壁上的残余液体；

Ⅸ.加25～40μl TE溶液重新溶解沉淀物，置于4℃或-20℃保存备用。 

三.结果

1.所提取的RNA样本检测

（1）RNA样本浓度和纯度检测

使用本发明所述方法分离的RNA总量在140～420 ng之间，浓度在10～30 ng/ul之间，OD 260/280 比值在1.8～2.2之间（NanoDrop 8000， Thermo Scientific公司），参见表1。

（2）RNA样本完整性检测

所提取的5个RNA样本的完整性均在8～10（RIN Number）之间（Agilent2100，Agilent 公司），参见附图1～5。

2. 所提取的DNA样本检测

（1）DNA样本浓度和纯度检测

使用本发明所述的方法提取的DNA总量在600～1200ng之间，浓度在20～40ng/ul之间，OD260/280 比值在1.8～2.2之间（NanoDrop 8000， Thermo Scientific公司），见表2。

（2）DNA样本完整性检测

采用1% 琼脂糖电泳检测5个样品的DNA完整性，参见附图6，结果显示基因组DNA没有发生降解。

3. 用分离RNA样本和Affymetrix Human U133plus2.0（Affymetrix公司）芯片进行全基因组基因表达分析

为证明所分离RNA的质量，用Affymetrix Human U133plus2.0 芯片进行全基因组基因表达分析，检测其杂交信号和质量，参见图7～11。结果表明：5个样本的杂交信号都在200以上，并无杂交背景；5个样本的比例因子（SF）都在3以下，表达基因的百分比在50%左右，质量完全符合要求，参见表3。

4.用分离DNA样本和Affymetrix CytoScanHD（Affymetrix公司）芯片进行全基因组拷贝数变异分析

为证明所得DNA符合下游分析的标准，用分离DNA和Affymetrix CytoScanHD 芯片进行全基因组拷贝数变异分析，参见图12～16，结果表明：5个样品各项指标均达到芯片质控指标：①中位绝对配对差异(Mapd)≤0.25；②单核苷酸多态性( SNP)≥15；③波动性（Wavines）≤0.12。

采用本发明所述的方法可以从一次细针穿刺获得的几毫克的活检材料中快速、简便地分离足够的DNA和RNA进行全基因组拷贝数分析、全基因组表达和全外显子测序。本发明解决了目前活检材料少和不能满足多层面全基因组学分析需求之间的矛盾，为个体化医疗的基因检测提供了新的途径。