基于中药药渣生产漆酶酶液及粉状漆酶的方法

摘要

本发明涉及一种基于中药药渣生产漆酶酶液及粉状漆酶的方法，步骤：⑴、PDA固体培养基的准备；⑵、种子培养基的准备；⑶、发酵产酶种子液的制备；⑷、发酵产酶培养基的制备；⑸、发酵产酶；⑹、漆酶酶液提取：⑺、上述漆酶酶液经过喷雾干燥后即得粉状漆酶。本发明发酵条件温和，工艺简单，成本低廉且变废为宝，降低了中药药渣对环境的污染；利用中药药渣中的有效成分诱导真菌产酶，缩短了发酵时间，产漆酶活性高，稳定性好，所产漆酶可广泛应用于造纸、印染、污水处理等领域。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于中药药渣生产漆酶酶液及 粉状漆酶的方法。

背景技术

漆酶(Laccase，EC1.10.3.2)是一类含铜的多酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶 家族。漆酶广泛存在于真菌、细菌、昆虫和植物中，其中研究和应用最为广 泛的是真菌漆酶，主要集中在担子菌和子囊菌，担子菌类的白腐菌是自然界 中漆酶最主要的生产者。白腐真菌漆酶具有较高的氧化还原电势和非常广泛 的底物范围，可以催化氧化酚类化合物,降解酚类及木素类化合物。近年来， 白腐真菌漆酶在纸浆生物漂白、有机染料脱色、工业废水处理和高分子催化 合成等方面，表现出了很大的研究价值和应用潜力。但是白腐真菌漆酶应用 于上述工业领域，需要解决的一个关键性因素是如何在控制发酵成本的前提 下提高漆酶产量。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于中药药渣生产漆 酶酶液的方法，该方法简单环保，降低了漆酶生产的工业成本，以中药药渣 为主要原料进行漆酶发酵生产，不仅可以促进白腐真菌生长，提高漆酶产量， 而且能够充分利用低价值的废弃物，在降低漆酶生产成本的同时，减少药渣 焚烧处理对环境造成的影响。

本发明的另一个目的在于提供一种基于中药药渣生产粉状漆酶的方法。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种基于中药药渣生产漆酶酶液的方法，其步骤：

⑴、PDA固体培养基的准备：以质量体积浓度计，马铃薯汁20％，葡 萄糖2％，琼脂2％，KH₂PO₄0.3％，MgSO₄·7H₂O 0.15％，在121℃高压蒸汽 灭菌20min后制备完成；

⑵、种子培养基的准备：以质量体积浓度计，马铃薯汁20％，葡萄糖 2％，酒石酸铵0.2％，自然pH值，在121℃高压蒸汽灭菌20min后制备完成；

⑶、发酵产酶种子液的制备：取斜面菌种一环在PDA固体培养基上点 接菌丝，30℃培养7天，切取3块直径大小为6mm左右的菌落接入装有50mL 种子培养基的250mL规格的三角瓶中，加入玻璃珠10粒，置于摇床，转速 控制在200rpm，温度30℃，恒温培养2-4天，得到发酵产酶种子液；

⑷、发酵产酶培养基的制备：以质量百分含量计，中药药渣30-40％， 豆粕10％，麦麸10％，水量40-50％，CaCl₂0.5％，KH₂PO₄0.5％，MgSO₄·7H₂O  0.2％，自然pH值，在1.01MPa，121℃高压蒸汽灭菌20min后制备完成；

⑸、发酵产酶：接种量6-10％，温度24-30℃，自然湿度，恒温发酵6-9 天，得到发酵后的培养物；

⑹、漆酶酶液提取：向发酵后的培养物中加入其重量2-6倍的水，在 25-40℃下浸提4-6小时后经过离心、过滤，即得到漆酶酶液。

而且，所述的中药药渣为大黄药渣、虎杖药渣或者两者任意配比的组合 药渣。

而且，所述的中药药渣含水量在30％-40％。

而且，所述的斜面菌种为白腐真菌菌株。

而且，所述的马铃薯汁的制备为取马铃薯，切成小片或小块，加水煮 20-30min，用4-6层纱布过，取滤液即得到马铃薯汁。

一种基于中药药渣生产粉状漆酶的方法，其步骤：

⑴、PDA固体培养基的准备：以质量体积浓度计，马铃薯汁20％，葡 萄糖2％，琼脂2％，KH₂PO₄0.3％，MgSO₄·7H₂O 0.15％，在121℃高压蒸汽 灭菌20min后制备完成；

⑵、种子培养基的准备：以质量体积浓度计，马铃薯汁20％，葡萄糖 2％，酒石酸铵0.2％，自然pH值，在121℃高压蒸汽灭菌20min后制备完成；

⑶、发酵产酶种子液的制备：取斜面菌种一环在PDA固体培养基上点 接菌丝，30℃培养7天，切取3块直径大小为6mm左右的菌落接入装有50mL 种子培养基的250mL规格的三角瓶中，加入玻璃珠10粒，置于摇床，转速 控制在200rpm，温度30℃，恒温培养2-4天，得到发酵产酶种子液；

⑷、发酵产酶培养基的制备：以质量百分含量计，中药药渣30-40％， 豆粕10％，麦麸10％，水量40-50％，CaCl₂0.5％，KH₂PO₄0.5％，MgSO₄·7H₂O  0.2％，自然pH值，在1.01MPa，121℃高压蒸汽灭菌20min后制备完成；

⑸、发酵产酶：接种量6-10％，温度24-30℃，自然湿度，恒温发酵6-9 天，得到发酵后的培养物；

⑹、漆酶酶液提取：向发酵后的培养物中加入其重量2-6倍的水，在 25-40℃下浸提4-6小时后经过离心、过滤，即得到漆酶酶液。

⑺、上述漆酶酶液经过喷雾干燥后即得粉状漆酶。

而且，所述的中药药渣为大黄药渣、虎杖药渣或者两者任意配比的组合 药渣。

而且，所述的中药药渣含水量在30％-40％。

而且，所述的斜面菌种为白腐真菌菌株。

而且，所述的马铃薯汁的制备为取马铃薯，切成小片或小块，加水煮 20-30min，用4-6层纱布过，取滤液即得到马铃薯汁。

本发明的优点及有益效果是：

1、采用中药药渣作为发酵原料，既充分利用了药渣中粗纤维、粗蛋白、 粗脂肪以及多种微量元素等生物质资源，变废为宝，降低了生产成本，又避 免了传统药渣填埋、焚烧或堆放处理过程中造成的资金浪费和环境污染。

2、由于药渣培养基中木质纤维素含量高、蛋白质含量较低，缩短了真 菌生长期，真菌产酶期提前；药渣中部分小分子芳香化合物、糖苷类物质可 有效诱导剂菌种分泌漆酶，大大提高了漆酶生产效率，缩短了发酵时间。

3、发酵设备简单，资金投入少。

4、产品漆酶性质稳定，酶活可达95U/g干基(DMP法)，产品作用底 物广泛，可应用于纸浆、生物漂白、纺织印染及废水处理等方面，具有广泛 的工业使用价值和显著的经济效益前景。

具体实施方式

本发明通过以下实施例进一步详述。需要说明的是：下述实施例是说明 性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

实施例1

一种基于中药药渣生产漆酶酶液的方法，其步骤：

⑴、PDA固体培养基的准备：以质量体积浓度计，马铃薯汁20％，葡 萄糖2％，琼脂2％，KH₂PO₄0.3％，MgSO₄·7H₂O 0.15％，在121℃高压蒸汽 灭菌20min后制备完成；

⑵、种子培养基的准备：以质量体积浓度计，马铃薯汁20％，葡萄糖 2％，酒石酸铵0.2％，自然pH值，在121℃高压蒸汽灭菌20min后制备完成；

⑶、发酵产酶种子液的制备：取斜面菌种一环在PDA固体培养基上点 接菌丝，30℃培养7天，切取3块直径大小为6mm左右的菌落接入装有50mL 种子培养基的250mL规格的三角瓶中，加入玻璃珠10粒，置于摇床，转速 控制在200rpm，温度30℃，恒温培养3天，得到发酵产酶种子液；斜面菌 种为白腐真菌菌株；

⑷、发酵产酶培养基的制备：以质量百分含量计，中药药渣30-40％， 豆粕10％，麦麸10％，水量45％，CaCl₂0.5％，KH₂PO₄0.5％，MgSO₄·7H₂O  0.2％，自然pH值，在1.01MPa，121℃高压蒸汽灭菌20min后制备完成；中 药药渣为大黄药渣，其含水量在30％；

⑸、发酵产酶：接种量8％，温度27℃，自然湿度，恒温发酵7天，得 到发酵后的培养物；

⑹、漆酶酶液提取：向发酵后的培养物中加入其重量3倍的水，在30℃ 下浸提5小时后经过离心、过滤，即得到漆酶酶液。本发明中马铃薯汁的制 备为取马铃薯，切成小片或小块，加水煮20-30min，用4-6层纱布过，取滤 液即得到马铃薯汁。

利用DMP法测得漆酶酶活为92.7U/g干基。

实施例2

一种基于中药药渣生产粉状漆酶的方法，其步骤：

⑴、PDA固体培养基的准备：以质量体积浓度计，马铃薯汁20％，葡 萄糖2％，琼脂2％，KH₂PO₄0.3％，MgSO₄·7H₂O 0.15％，在121℃高压蒸汽 灭菌20min后制备完成；

⑵、种子培养基的准备：以质量体积浓度计，马铃薯汁20％，葡萄糖 2％，酒石酸铵0.2％，自然pH值，在121℃高压蒸汽灭菌20min后制备完成；

⑶、发酵产酶种子液的制备：取斜面菌种一环在PDA固体培养基上点 接菌丝，30℃培养7天，切取3块直径大小为6mm左右的菌落接入装有50mL 种子培养基的250mL规格的三角瓶中，加入玻璃珠10粒，置于摇床，转速 控制在200rpm，温度30℃，恒温培养2天，得到发酵产酶种子液；斜面菌 种为白腐真菌菌株；

⑷、发酵产酶培养基的制备：以质量百分含量计，中药药渣30-40％， 豆粕10％，麦麸10％，水量50％，CaCl₂0.5％，KH₂PO₄0.5％，MgSO₄·7H₂O  0.2％，自然pH值，在1.01MPa，121℃高压蒸汽灭菌20min后制备完成；中 药药渣为虎杖药渣，其含水量在40％

⑸、发酵产酶：接种量6％，温度24℃，自然湿度，恒温发酵6天，得 到发酵后的培养物；

⑹、漆酶酶液提取：向发酵后的培养物中加入其重量6倍的水，在40℃ 下浸提6小时后经过离心、过滤，即得到漆酶酶液。

⑺、上述漆酶酶液经过喷雾干燥后即得粉状漆酶。本发明中马铃薯汁的 制备为取马铃薯，切成小片或小块，加水煮20-30min，用4-6层纱布过，取 滤液即得到马铃薯汁。

利用DMP法测得漆酶酶活为95.2U/g。

实施例3

一种基于中药药渣生产粉状漆酶的方法，其步骤：

⑴、PDA固体培养基的准备：以质量体积浓度计，马铃薯汁20％，葡 萄糖2％，琼脂2％，KH₂PO₄0.3％，MgSO₄·7H₂O 0.15％，在121℃高压蒸汽 灭菌20min后制备完成；

⑵、种子培养基的准备：以质量体积浓度计，马铃薯汁20％，葡萄糖 2％，酒石酸铵0.2％，自然pH值，在121℃高压蒸汽灭菌20min后制备完成；

⑶、发酵产酶种子液的制备：取斜面菌种一环在PDA固体培养基上点 接菌丝，30℃培养7天，切取3块直径大小为6mm左右的菌落接入装有50mL 种子培养基的250mL规格的三角瓶中，加入玻璃珠10粒，置于摇床，转速 控制在200rpm，温度30℃，恒温培养4天，得到发酵产酶种子液；斜面菌 种为白腐真菌菌株；

⑷、发酵产酶培养基的制备：以质量百分含量计，中药药渣30-40％， 豆粕10％，麦麸10％，水量40-50％，CaCl₂0.5％，KH₂PO₄0.5％，MgSO₄·7H₂O  0.2％，自然pH值，在1.01MPa，121℃高压蒸汽灭菌20min后制备完成；中 药药渣为大黄药渣和虎杖药渣按照1:1重量配比的组合药渣，其含水量在 35％

⑸、发酵产酶：接种量10％，温度30℃，自然湿度，恒温发酵9天， 得到发酵后的培养物；

⑹、漆酶酶液提取：向发酵后的培养物中加入其重量2倍的水，在40℃ 下浸提4小时后经过离心、过滤，即得到漆酶酶液。

⑺、上述漆酶酶液经过喷雾干燥后即得粉状漆酶。本发明中马铃薯汁的 制备为取马铃薯，切成小片或小块，加水煮20-30min，用4-6层纱布过，取 滤液即得到马铃薯汁。

利用DMP法测得漆酶酶活为94.6U/g干基。

本利用DMP法测得酶活力定义和测定：

1、酶活力定义：以每1min氧化1μmol的DMP(2,6-二甲氧基酚)成 为3,5,3’,5’-四甲氧基二苯醌(ε＝49.6mmol^-1·L·cm^-1)所需的酶量，定义 为1个酶活性单位，以U/mL表示。产品用DMP法测酶活，并计算总酶 活除药渣、豆粕和麦麸等干基的重量，得到干物质产漆酶的酶活力。

2、酶活测定：将所得酶曲按1:5的比例加水，浸泡过夜，8000r/min、 4℃离心得上清液，即为粗酶液，4℃保存备用。漆酶酶活测定以DMP为底 物，每3mL反应体系含：160mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 3.5)，1.67 mmol/LDMP，30℃保温5min后加入100μL酶液，在420nm处测吸光 值。

经过检索长期以来，工业上生产漆酶多采用液体发酵，但液体发酵存在 能耗大、工艺操作复杂，工艺污染重等问题；与液态发酵相比，固体发酵由 于其发酵原料成本经济、工艺节能节水、基质前处理简单、回收纯化过程及 废弃物处理简单等优点，受到了越来越多的重视。

目前，固态发酵产漆酶主要存在发酵周期长的缺点。相关资料表明(国 内文献、专利)，大部分真菌固态培养基产漆酶工艺的最高峰要在培养14-18 天后才出现。以马铃薯为主要原料进行固态发酵产漆酶时，酶活最大值出现 在14天左右，酶活约为75-80U/g干基；以栗子壳和麸皮或木糖渣等为主 要原料进行固态发酵产漆酶时，酶活最大值出现在14天左右，漆酶酶活约 为75-80U/g干基。

专利CN 102851260一种以水稻秸秆为原料固态发酵产漆酶的方法，以 常见农作物水稻秸秆等为培养基进行固态发酵，酶活最大值出现在8-10天 左右，缩短了产酶时间，但酶活约为80-85U/g干基。专利CN 103571802A一 种以水葫芦和木屑为主要原料固态发酵产漆酶的方法，以水葫芦和木屑等为 培养基进行固态发酵，酶活最大值出现在8天左右，缩短了产酶时间，但漆 酶酶活约为73U/g干基。

综上所述现有技术漆酶酶活远低于本发明制备方法漆酶酶活。