RE-1涂层稀土纳米颗粒减少其诱发的炎症效应

摘要

本发明涉及RE-1涂层稀土纳米颗粒减少其诱发的炎症效应，具体地，本发明提供一种降低稀土纳米颗粒诱发炎症效应的方法，其通过将所述稀土纳米颗粒用短肽涂层实现，所述短肽氨基酸序列为ACTARSPWICG。

说明书

技术领域

本发明涉及一种降低稀土纳米颗粒诱发炎症效应的表面短肽涂层方 法。

背景技术

稀土纳米材料的开发及应用已成为当前的一个研究热点。其原因在于 该材料集稀土特性和纳米特性于一体，必然会开创出非稀土纳米材料和稀 土非纳米材料所不具有的综合优良特性，此应用前景巨大。由于稀土纳米 材料本身具有的特殊的理化性质，包括荧光效应、催化作用等，使其广泛 用于当代通讯技术、感光材料、石油化工、电子计算机、宇航开发、光电、 冶金、机械、能源、轻工、环境保护、农业和催化剂材料等领域。

稀土金属氧化物是稀土纳米材料的重要组成部分，由于其本身具有稀 土元素的特殊性质，使其在生物医药领域具有巨大的应用价值。稀土金属 氧化物纳米材料用于放射疗法治疗癌症在我国和加拿大已都有广泛应用， 而基于稀土金属氧化物纳米材料的荧光探针和纳米器件用于体内外诊断、 显象(Imaging)以及疾病治疗的应用则具有无可限量的潜力。然而，目前 稀土金属氧化物纳米材料的生物安全性研究不多。

UCN(Upconversion Nanoparticles)是一种稀土上转换发光纳米材料， (NaYF4:Yb,Er)，粒径为50nm，这种纳米颗粒具有独特的上转化发光 效应，相比有机荧光染料和量子点等下转换发光标记而言，上转换发光纳 米材料具有光稳定性好、化学稳定性强、吸收和发射带很窄、发光寿命长、 不易发生光漂白、潜在生物毒性小等优点，上转换发光标记因采用近红外 连续激光作为激发源，具有较深的光穿透深度、无生物背景荧光干扰、对 生物组织几乎无损伤等显著优势。上转换发光纳米材料的这些特征克服了 传统荧光标记材料的缺点，正是生物成像的理想标记物应具备的。另外还 有组成相同，仅是尺寸不同的UCP(Upconversion Particles,粒径500nm)和 UCN-S(UCN-small，粒径20nm)。

UCN作为一种上转化发光材料，可在近红外光激发下转换发出短波长 近红外光或可见光或紫外光。这类材料在许多研究领域(如生物检测、疾 病诊断、生物传感、光显示和太阳能电池等)具有巨大的研发价值和应用 前景。具有均匀单分散、微小尺寸和生物相容的上转换发光纳米晶体将其 应用于细胞标识与动物深层组织的荧光成像和连续监控上。与传统的下转 换发光材料相比，这种材料具有入射深、自发荧光弱、背景噪音小、敏感 度高以及毒性小等优点，并且对生物组织损伤小，很适合于在生物医学领 域的应用。与双光子等非线性材料相比，上转换发光材料的激发过程虽然 也是基于双光子或多光子吸收，其发光效率比较高，是一种性能优越的新 型荧光材料。此外，该材料为稀土元素掺杂，通过调节所掺杂稀土元素的 种类和基质材料，可在同一红外激发光下，实现多色上转换可见光区发光， 可用于多靶点同时标记。这种新材料不但具有巨大的科学研究价值，还有 广大的商业前景并吸引了众多商业机构的青睐。荧光材料在生物化学传感 与分析、生物检测、药物追踪、光学数据存贮、光学标识、光显示、环境 监控、太阳能电池及激光等领域都有广泛的应用，具有巨大的市场需求。 在2010年对光学纳米材料的市场需求预测为100亿美元，并在未来5年 内以50％的速度增长。由于上转换发光材料的独特性能，在很多应用中它 将成为传统发光材料的替代，具有不可估量的应用前景。

由于UCN为稀土掺杂氟化物纳米材料，其具有较低的声子能可以降 低非辐射跃迁提高发光强度，在氧化物、硫化物、磷化物等众多基质中脱 颖而出，近年来也被广泛应用在分析检测，疾病治疗等领域。其优势在光 动力治疗上尤为突出，将稀土上转换发光纳米颗粒作为光敏剂的能量供 体，包覆二氧化硅的同时掺杂部花青，实现UCN和部花青的能量转移产 生单线态氧。在活体实验中，将约50nm大小的共价连接叶酸、非共价吸 附酞菁锌的聚乙烯亚胺包覆的稀土上转换发光纳米颗粒。当用980nm的 激发上转换发光纳米颗粒时，光敏剂酞菁锌因发生能量转移，会产生单线 态氧，可以杀死肿瘤细胞。介孔二氧化硅包覆的上转换发光纳米颗粒共价 连接肿瘤靶向剂后，其双光敏作用可以有效抑制荷瘤小鼠黑色素瘤的生 长。大量的研究数据表明，稀土上转换发光纳米材料已基本取代了量子点 广泛应用于生物成像。由于其独特的上转换发光特质，激发光为红外激光， 因此具有较深的光穿透深度、无生物背景荧光干扰、对生物组织几乎无损 伤。这些特点使得其在深层组织成像和活体成像中尤为占据优势。研究表 明，PEI包裹的稀土上转换纳米材料在深度为10mm的组织里依然可见清 晰的荧光，而量子点在大鼠足部半透明的皮肤下发出的荧光仍很微弱。

稀土上转换发光纳米材料UCN还广泛应用于药物输运和基因转染。 使用光敏感化学基团对生物分子(DNA、RNA、蛋白质、药物等)进行保 护，在不同的入射光作用下，稀土上转换纳米材料可实现生物分子的远程 操控和释放功能。研究发现，稀土上转换发光纳米材料利用荧光共振能量 转移技术可以在细胞内实现siRNA的输运。

纳米材料的效应和安全性研究显示，稀土纳米颗粒也并不是完全有益 的，它们在细胞、亚细胞甚至蛋白质水平上影响着生物体。它们能够通过 对细胞分裂、增殖、凋亡等基本生命过程的影响和对相关信号传导通路的 调控，从而在细胞水平上产生一定的生物学效应，表现出一定的细胞毒性， 可诱导细胞的死亡。纳米材料的毒性，主要来源于材料转变为纳米级的过 程中所发生的理化性质变化等。比如，稳定性增强的纳米物质，用于人体 表面或者被人体吸收后不易被降解，长期积聚体内会影响健康。生物体水 平上，纳米材料效应和毒性的相关研究表明，纳米材料可以通过呼吸系统、 消化道和皮肤进入机体避开免疫系统的清除作用并沉淀在呼吸系统引起 炎症反应、导致肺清除功能下降、引发肺部慢性炎症病变和氧化损伤；可 以从沉淀部位向周围组织弥散、穿透血气屏障进入循环系统；还可穿透血 脑屏障和经嗅神经通路导致脑损伤。

固有免疫作为机体第一道屏障系统,对外来病原体的清除以及引导机 体产生有效的适应性免疫应答具有至关重要的作用。固有免疫通过模式识 别受体(PRR)来识别病原体的保守结构即病原体相关分子模式(PAMP)。 常见的PAMP包括脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)、鞭毛蛋白以及一些微生 物的核酸分子。这些PAMP能够被PRR识别进而激活下游信号通路,引 起炎症反应或者抗菌应答。到目前为止,已经发现三类PRR:(1)Toll样受 体(TLR):一类主要定位于细胞膜或者内体膜的跨膜分子,其胞外区识别 配体分子,胞内区传递信号,激活下游N F-κB等信号通路；(2)RIGI样 受体(RLR):一类胞内的螺旋酶,主要参与病毒的识别并激活型干扰素, 抵抗病毒感染；(3)NOD样受体(NLR):一类细胞内感应分子。有一些 NOD样受体在激活后,形成巨大的蛋白复合体即炎症小体,激活胱天蛋 白酶Caspase 1,进而对I L-1β和I L-18等炎症因子的前体形式进行切割, 使其成熟并释放到胞外,引起炎症反应。最初被确认的家族性周期性自身 炎症反应以及II型糖尿病、阿尔海默茨病和动脉粥样硬化症等都与相关 炎症小体的激活有关。

纳米材料由于纳米材料由于和生物大分子尺寸相当，且具有优良的光、 电、磁等性质，为研究癌症的检测和治疗提供了有力的工具，使其在药物 输运、疾病诊断与治疗、组织工程等生物医学领域有极大的应用前景。然 而，纳米材料的某些理化性质使其在生物体内产生一定的毒性效应。近期 越来越多的研究表明，炎症小体的激活是纳米诱发的一类重要的生物学效 应。其中，NLRP3炎症小体是研究的最多的，它能与纳米材料产生直接的 相互作用。根据最新的报道，纳米Ag，Au，TiO₂，CeO₂，MWCNTs，SiO₂等纳米颗粒都会诱发炎症。而且这些纳米材料诱发炎症的强弱与材料的形 状，大小都是有一定的关系的。

上述纳米材料都是通过激活NLRP3炎症小体来诱发炎症的，NLRP3 也是目前研究得最多的一种炎症小体。NLRP3炎症小体不仅能被许多细 菌、病毒等病原体所激活,同时也能被体内自身产生的危险信号激活。能 够激活NLRP3炎症小体的病原体包括以下几种。在真菌中,白色念珠菌 和酿酒酵母能够通过蛋白酪氨酸激酶Syk介导的信号通路来激活NLRP3 炎症小体；细菌方面,金黄色葡萄球菌和李斯特菌能够通过NLRP3炎症 小体引起免疫反应；同时还发现腺病毒和流感病毒也能通过不同的方式激 活NLRP 3炎症小体。腺病毒通过其DNA发挥作用,而流感病毒则利用 其M 2离子通道激活NLRP 3炎症小体。除了病原体之外,一些病原体 分泌的毒素也能激活NLRP3炎症小体,主要包括nigericin和maitotoxin, 它们能够引起细胞膜通透性的改变,使得细胞内的钾离子外流,进而引起 N L RP 3的激活。体内一些危险信号和代谢产物也能通过N LR P3炎症 小体来引起炎症反应。当宿主细胞受到损伤而发生坏死时,细胞中的A T P 和尿酸盐等分子会释放到胞外,而这些分子能够激活N LRP3炎症小体， 引起炎症反应。因此，NLRP3作为一种模式识别受体能够识别多种外来 病原体和内在危险信号。

NLRP炎症小体的调控。NLRP3炎症小体在疾病的防御和发生过程中 具有重要作用,因此,对于NLRP3炎症小体的调控至关重要。尽管在体内 生理条件下如何调控现在还不是很清楚,但是已发现在体外许多蛋白参与 调控炎症小体的装配以Caspase-1的激活。根据结构上的特点,这些蛋白 分为两类:一类包含有CARD结构域,如Iceberg、INCA、COP和Cas  pase 12,通过CARD结构域之间的相互作用,这些蛋白可以阻断Cas pase 1 与ASC之间的相互作用,进而负向调控白介素1β即IL-1β的分泌；另一 类NLRP3炎症小体的抑制分子含有PYD结构域,主要通过与ASC或 NLRP3相互作用,阻断炎症小体的形成,这类分子主要包括Pyrin、POP 和病毒PYD(v PYD)。缺失vPYD的病毒能诱导产生大量的I L-1β,说 明炎症小体不仅仅在抗细菌反应中起作用,还具有抗病毒作用。除此之外, ATG16 L1也能通过参与自噬体的形成来抑制NLRP3炎症小体的激活和 I L-1β的分泌。

炎症小体是一种由细胞浆内天然免疫识别受体参与组装的多蛋白复合 物，能够介导IL-1β等多种炎症介质的产生，对炎症反应的发生至关重要， 并参与肿瘤、神经退行性疾病、代谢性疾病等多种人类炎症相关重大疾病 的发生发展。根据《免疫》(Immunity)杂志的最新报导，科研人员发现 Omega-3脂肪酸能够抑制NLRP3炎症小体的活化，减少炎症关键因子 IL-1b的分泌。此前的研究发现，NLRP3炎症小体在高脂食物诱导的2 型糖尿病发生过程中起到重要作用。此次研究人员进一步利用动物实验， 发现Omega-3脂肪酸可以通过抑制NLRP3炎症小体相关炎症，从而缓解 高脂食物诱发的Ⅱ型糖尿病。

发明内容

本发明涉及一种降低稀土纳米颗粒诱发炎症效应的表面短肽涂层方 法。

具体的，本发明的第一个方面提供一种降低稀土纳米颗粒诱发炎症效 应的方法，其特征在于将所述稀土纳米颗粒用氨基酸序列为 ACTARSPWICG的肽涂层。

在一个优选的实施方案中，所述稀土纳米颗粒为含稀土金属元素的纳 米颗粒。

在一个优选的实施方案中，所述稀土纳米颗粒选自稀土金属氧化物纳 米颗粒。

在一个优选的实施方案中，所述稀土纳米颗粒选自UCN,UCP。

在一个优选的实施方案中，所述稀土金属氧化物选自CeO₂，Y₂O₃, Er₂O₃,La₂O₃,Lu₂O₃,Pr₂O₃、Nd₂O₃、Pm₂O₃、Sm₂O₃、Eu₂O₃、Gd₂O₃、Tb₂O₃、 Dy₂O₃、Ho₂O₃、Tm₂O₃、Yb₂O₃、Sc₂O₃或其任意组合。

本发明的另一个方面提供一种降低稀土纳米颗粒诱发NLRP3炎症小 体激活的方法，其特征在于将所述稀土纳米颗粒用氨基酸序列为 ACTARSPWICG的肽涂层。

在一个优选的实施方案中，所述稀土纳米颗粒为含稀土金属元素的纳 米颗粒。

在一个优选的实施方案中，所述稀土纳米颗粒选自稀土金属氧化物纳 米颗粒。

在一个优选的实施方案中，所述稀土纳米颗粒选自UCN,UCP。

在一个优选的实施方案中，所述稀土金属氧化物选自CeO₂，Y₂O₃, Er₂O₃,La₂O₃,Lu₂O₃,Pr₂O₃、Nd₂O₃、Pm₂O₃、Sm₂O₃、Eu₂O₃、Gd₂O₃、Tb₂O₃、 Dy₂O₃、Ho₂O₃、Tm₂O₃、Yb₂O₃、Sc₂O₃或其任意组合。

附图说明

图1 本发明合成的UCN的TEM图

图2 Western blotting检测UCN处理后，细胞上清中Cleaved-IL-1β和 Cleaved-Caspase-1的水平(图中所用的UCN粒径为50nm)

图3 UCN诱发炎症,RE-1涂层UCN，以及RE-1涂层UCN后诱发炎症的 示意图(左边图的UCN粒径为50nm，右边图UCN1为50nm纳米颗粒， 右边UCN2为100nm纳米颗粒)

图4 Western blotting检测RE-1涂层UCN后，细胞上清中Cleaved-IL-1β 和Cleaved-Caspase-1量的变化

图5ELISA检测UCN处理后或RE-1涂层UCN后细胞上清中的 Cleaved-IL-1β和Cleaved-IL-18

图6Western blotting检测RE-1涂层Y₂O₃后，细胞上清中Cleaved-IL-1β和 Cleaved-Caspase-1量的变化

图7 Western blotting检测RE-1涂层Er₂O₃后，细胞上清中Cleaved-IL-1β 和Cleaved-Caspase-1量的变化

具体实施方式

实验方法

稀土上转化发光材料UCN(NaYF4:Yb,Er)的合成方法

YCl3，YbCl3，ErCl3，十八烯均购自Sigma；油酸购自西格玛奥德里 奇；C57BL6小鼠购自上海斯莱克，所用培养基包括 DMEM,OPTI-MEM,1640均购自GIBCO；THP-1,L929两种细胞源自ATCC 细胞库，脂多糖LPS，丙二醇甲醚醋酸酯PMA均购自Sigma，LC3抗体 购自NOVUS

本发明使用的稀土上转换发光纳米材料(UCN和UCN-S)均为球状 的NaYF4：18％Yb，2％Er纳米颗粒，合成方法如下。YCl3(0.1562g)， YbCl3(0.0503g)，ErC 3(0.0055g)与6mL油酸和17mL十八烯混合 在50mL长颈瓶中，加热到160℃，然后冷却至室温。NaOH(0.01g) 和NH4F(0.148g)溶入10mL甲醇中，并逐滴加入上述长颈瓶中，搅拌 30min确保氯化物充分反应。将上述溶液慢慢加热蒸发掉甲醇，100℃脱 气10min，然后在氩气中加热至300℃并维持1h。溶液自然冷却，此时 纳米晶体就沉淀下来了。再用乙醇沉淀，乙醇/水(体积比1:1)洗涤三次 之后，在室温下用1M HCl处理5h以除去纳米颗粒表面的油酸，再用水 和环己烷洗涤10次。用紫外分光光度计检测230nm(油酸的特征吸收峰) 的吸收值以确保油酸完全去除干净。在合成过程中，通过加入不同量的油 酸来控制UCN和UCN-S纳米颗粒粒径的大小(UCN：3mL油酸，UCN-S： 6mL油酸)。已合成的UCN储存在水中以备实验中使用。(注：由于去 除了UCN和UCN-S纳米颗粒表面的油酸，颗粒表面呈裸露状，极其不稳 定，易发生团聚，因此纳米颗粒需随用随制备)。

由UCN电镜图(图1)可以看出我们合成的UCN颗粒均一，并且经 980nm波长的激光器检测，具有良好的上转化发光效应。合成UCN过程 中，可以通过改变油酸和十八烯的比例来控制UCN颗粒的大小。

RE-1多肽的合成

本发明使用的多肽均由上海吉尔生化公司(Shanghai，GL  Biochemicals)利用多肽自动合成仪采用标准的固相-FMOC合成法得出， 并用HPLC分析其纯度在99％以上。所有合成的多肽均用质谱分析鉴定， 确认序列无误后再使用。

ICP-MS鉴定稀土上转换发光纳米材料的浓度

利用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)来确定UCN的浓度。分别 取50μL合成或预处理好的UCN纳米颗粒溶解在300μL浓硝酸溶液中， 2h后直至纳米颗粒完全消融，可使用激发光为980nm的激光器进行检测， 若溶液中仍有绿色荧光发出，说明颗粒还没有完全溶解。待纳米颗粒完全 溶解后，方可用于电感耦合等离子体质谱分析。

RE-1与稀土上转换发光纳米材料结合实验

将50μg RE-1加入100μL UCN(1mg/mL)，分别混合均匀后，37 度孵育3h。12,000rpm离心10min后，沉淀的纳米颗粒用Milli-Q水洗涤 2～3次，然后根据实验类型用适当的水或者溶剂重悬，以备用。

L929细胞培养液上清的获得

大皿培养L929细胞(购自美国ATCC细胞库)，48h后，收集培养液， 0.22um滤膜过滤除去死细胞。放置4℃备用。DMEM培养基中加入20％ 上述L929细胞上清，置于4℃以培养BMDM骨髓巨噬细胞。

原代骨髓巨噬细胞(BMDM)获取方法

C57BL6小鼠颈椎脱臼处死，取双侧股骨与胫骨。转移至超净台，仔 细分离肌肉等组织，完全暴露骨质，剪成几小段。20ml注射器吸满DMEM 培养基，取下大针头，换上4号针头，冲洗骨髓至15mL离心管，1500rpm 离心10min。弃上清，1mL红细胞裂解液重悬细胞，充分吹匀以裂解红细 胞，5mLDMEM中和红细胞裂解液，充分吹匀，1500rpm离心10min。弃 上清，1mL加L929细胞上清的培养基重悬细胞，计数。然后用加有L929 上清的DMEM培养细胞。5天后细胞分化贴壁，可以用于实验。

人单核巨噬细胞(THP-1)(购自美国ATCC细胞库)的刺激分化：

从细胞培养瓶中取一定量细胞至50mL离心管中，计数。加入PMA， 终浓度为100nM.50mL离心管置于细胞培养箱中，旋松管盖，PMA刺激 3h。3h后铺板，12孔板每孔1mL，过夜，待细胞贴壁后用于实验。

UCN处理细胞诱发炎症

用UCN处理鼠源的BMDM细胞以及人源的THP-1细胞。加材料处理 前3h将细胞培养基换为含有100nM LPS的OPTI-MEM培养基，12孔板 每孔500uL。3h后加入UCN(50μg/mL)处理细胞，6h后收样。收样前45min 加入阳性对照尼日利亚菌素Nigericin(5μM)。一块细胞板用于提取细胞 培养上清里的分泌蛋白用于Western Blotting检测细胞分泌在上清中的促 炎因子cleaved-IL-1β和cleaved-Caspase-1。

RE-1涂层UCN以降低其诱发的炎症

将UCN与RE-1在37度孵育3个小时，离心，吸出未结合的肽，用 超纯水重悬。按上述方法制备RE-1涂层的UCN。用RE-1涂层的UCN处 理鼠源的BMDM细胞以及人源的THP-1细胞，检测其诱发的炎症，并与 UCN诱发的炎症做对比。加材料处理前3h将细胞培养基换为含有100nM  LPS的OPTI-MEM培养基，12孔板每孔500uL。3h后加入RE-1涂层的 UCN(UCN的浓度为50μg/mL)处理细胞，6h后收样。收样前45min加入 阳性对照Nigericin(5μM)。一块细胞板用于提取细胞培养上清里的分泌 蛋白用于Western Blotting检测细胞分泌在上清中的促炎因子cleaved-IL-1β 和cleaved-Caspase-1。

甲醇-氯仿提取法提取细胞外分泌蛋白

预先将标记好的1.5mL EP管置于冰上，分别吸取12孔板不同处理的 细胞培养基上清至不同的EP管中，4℃离心机离心，13000rpm离心5min， 离去死细胞。吸取上清到另一个EP管，加入500μL甲醇，125μL氯仿， 震荡混匀，13000rpm离心5min，EP中两种液体分层，蛋白存在于分层界 面。吸去上层液体，加入500μL甲醇溶解下层氯仿，震荡混匀，13000rpm 离心5min，管底可见蛋白。弃去上层液体，将EP管置于55℃烘箱5min， 使甲醇挥发。然后加入60μL sample buffer裂解蛋白，充分裂解后，沸水 煮10min，制备的样品用于Western blotting检测。

Western blotting检测细胞外分泌的cleaved-IL-1β和cleaved-Caspase-1

配置15％蛋白分离胶用于SDS-PAGE,用于分离上清提取蛋白和细胞 裂解液。在细胞上清提取蛋白中检测cleaved-IL-1β和cleaved-Caspase-1， 细胞裂解液中检测Pro-IL-1β和Pro-Caspase-1。根据蛋白marker判断目标 蛋白已分离，然后将蛋白胶上的蛋白转移至PVDF膜上，恒流350mA,湿 转90min。5％脱脂牛奶封闭2h，染一抗(human IL-1β购自Santa Cruz， mouse IL-1β购自R&D,Caspase-1购自Abcam，一抗4℃过夜。TBST洗一 抗，5min一次洗8次，染二抗(兔抗或羊抗均购自Promega)，常温1h， TBST洗二抗，5min一次，洗8次，显影。

ELISA检测细胞外分泌蛋白cleaved-IL-1β和cleaved-IL-18

取一定量的细胞上清，测BCA。按照ELISA试剂盒说明书制作蛋白 浓度标准曲线。根据BCA结果及标准曲线，选择一定的稀释比例。然后 按照ELISA试剂盒protocol测得不同处理外分泌蛋白的浓度。ELISA试剂 盒：mouse IL-1b(R&D),human IL-1b(BD biosciences),mouse IL-18 (eBioscience)，。

实施例1：UCN处理细胞诱发炎症

用UCN处理鼠源的BMDM细胞以及人源的THP-1细胞。加材料处理 前3h将细胞培养基换为含有100nM LPS的OPTI-MEM培养基，12孔板 每孔500uL。3h后加入UCN(50μg/mL)处理细胞，6h后收样。收样前15min 加入阳性对照Nigericin(5μM)。一块细胞板用于提取细胞培养上清里的 分泌蛋白用于Western Blotting检测细胞分泌在上清中的促炎因子 cleaved-IL-1β和cleaved-Caspase-1，另一块细胞板用于ELISA检测 cleaved-IL-1β和cleaved-IL-18。

由图2所示的Western blotting可以看出，UCN(50μg/mL)会使细胞 上清中外分泌蛋白Cleaved-IL-1β和Cleaved-Caspase-1显著增多。而且， 细胞裂解液中的Pro-IL-1β和Pro-Caspase-1的量是没有变化的，证明UCN 确实引起NLRP3炎症小体的组装，进而使得Pro-Caspase1自我激活剪切 为有活性的Cleaved-Caspase-1，Cleaved-Caspase-1切割Pro-IL-1β为 Cleaved-IL-1β，并分泌到胞外。而且从图中LC3II型的变化也可看出UCN 引起的自噬效应。

实施例2：RE-1涂层UCN以降低其诱发的炎症

制备RE-1涂层的UCN。用RE-1涂层的UCN处理鼠源的BMDM细 胞以及人源的THP-1细胞，检测其诱发的炎症，并与UCN诱发的炎症做 对比。加材料处理前3h将细胞培养基换为含有100nM LPS的OPTI-MEM 培养基，12孔板每孔500uL。3h后加入RE-1涂层的UCN(UCN的浓度为 50μg/mL)处理细胞，6h后收样。收样前45min加入阳性对照Nigericin (5μM)。一块细胞板用于提取细胞培养上清里的分泌蛋白用于Western  Blotting检测细胞分泌在上清中的促炎因子cleaved-IL-1β和 cleaved-Caspase-1，另一块细胞板用于ELISA检测cleaved-IL-1β和 cleaved-IL-18。

由图4所示Western blotting可以看出，RE-1涂层UCN(50μg/mL) 会使UCN诱发的细胞上清中外分泌蛋白Cleaved-IL-1β和 Cleaved-Caspase-1显著减少。而且，细胞裂解液中的Pro-IL-1β和 Pro-Caspase-1的量是没有变化的。证明RE-1涂层UCN会抑制UCN激活 炎症小体，从而使得细胞分泌到上清中的Cleaved-IL-1β和 Cleaved-Caspase-1减少。

对于实施例1和2中ELISA检测cleaved-IL-1β和cleaved-IL-18的结 果如图5所示，由ELISA结果可以看出UCN诱发BMDM细胞分泌 Cleaved-IL-1β和Cleaved-IL-18，而RE-1涂层会显著减少UCN诱发的分 泌至细胞上清中的Cleaved-IL-1β和Cleaved-IL-18。

实施例3：Y₂O₃处理细胞诱发炎症

用Y₂O₃处理鼠源的BMDM细胞以及人源的THP-1细胞。加材料处理 前3h将细胞培养基换为含有100nM LPS的OPTI-MEM培养基，12孔板 每孔500uL。3h后加入Y₂O₃(5μg/mL)处理细胞，6h后收样。收样前45min 加入阳性对照Nigericin(5μM)。提取细胞培养上清里的分泌蛋白用于 Western Blotting检测细胞分泌在上清中的促炎因子cleaved-IL-1β和 cleaved-Caspase-1。

实施例4：RE-1涂层Y₂O₃以降低其诱发的炎症

将50μg RE-1加入100μLY₂O₃(1mg/mL)分别混合均匀后，37度孵 育3h。12,000rpm离心10min后，沉淀的纳米颗粒用Milli-Q水洗涤2～3 次，然后用分别混合均匀后，37度孵育3h。12,000rpm离心10min后， 沉淀的纳米颗粒用Milli-Q水洗涤2～3次，然后根据实验类型用适当的水 或者溶剂重悬，制备RE-1涂层的Y₂O₃。用RE-1涂层的Y₂O₃处理鼠源的 BMDM细胞以及人源的THP-1细胞，检测其诱发的炎症。加材料处理前 3h将细胞培养基换为含有100nM LPS的OPTI-MEM培养基，12孔板每孔 500uL。3h后加入RE-1涂层的Y₂O₃(Y₂O₃的浓度为5μg/mL)处理细胞，6h 后收样。收样前15min加入阳性对照Nigericin(5μM)。Western Blotting 检测细胞分泌在上清中的促炎因子cleaved-IL-1β和cleaved-Caspase-1。对 于实施例3和4中Western blotting检测Cleaved-IL-1β和Cleaved-Caspase-1 量的结果如图6所示，可以看出，RE-1涂层Y₂O₃(5μg/mL)会使Y₂O₃诱发的细胞上清中外分泌蛋白Cleaved-IL-1β和Cleaved-Caspase-1显著减 少。而且，细胞裂解液中的Pro-IL-1β和Pro-Caspase-1的量是没有变化的。 证明RE-1涂层Y₂O₃会抑制Y₂O₃激活炎症小体，从而使得细胞分泌到上 清中的Cleaved-IL-1β和Cleaved-Caspase-1减少。

实施例5：Er₂O₃处理细胞诱发炎症

用Er₂O₃处理鼠源的BMDM细胞以及人源的THP-1细胞。加材料处 理前3h将细胞培养基换为含有100nM LPS的OPTI-MEM培养基，12孔 板每孔500uL。3h后加入Er₂O₃(5μg/mL)处理细胞，6h后收样。收样前45min 加入阳性对照Nigericin(5μM)。提取细胞培养上清里的分泌蛋白用于 Western Blotting检测细胞分泌在上清中的促炎因子cleaved-IL-1β和 cleaved-Caspase-1。

实施例6：RE-1涂层Er₂O₃以降低其诱发的炎症

将50μg RE-1加入100μLEr₂O₃(1mg/mL)分别混合均匀后，37度 孵育3h。12,000rpm离心10min后，沉淀的纳米颗粒用Milli-Q水洗涤 2～3次，然后用分别混合均匀后，37度孵育3h。12,000rpm离心10min 后，沉淀的纳米颗粒用Milli-Q水洗涤2～3次，然后根据实验类型用适当 的水或者溶剂重悬，制备RE-1涂层的Er₂O₃。用RE-1涂层的Er₂O₃处理 鼠源的BMDM细胞以及人源的THP-1细胞，检测其诱发的炎症。加材料 处理前3h将细胞培养基换为含有100nM LPS的OPTI-MEM培养基，12 孔板每孔500uL。3h后加入RE-1涂层的Er₂O₃处理细胞，6h后收样。收 样前15min加入阳性对照Nigericin(5μM)。Western Blotting检测细胞分 泌在上清中的促炎因子cleaved-IL-1β和cleaved-Caspase-1。对于实施例5 和6中Western blotting检测Cleaved-IL-1β和Cleaved-Caspase-1量的结果 如图7所示，可以看出，RE-1涂层Er₂O₃((5μg/mL)会使Er₂O₃诱发的细 胞上清中外分泌蛋白Cleaved-IL-1β和Cleaved-Caspase-1显著减少。而且， 细胞裂解液中的Pro-IL-1β和Pro-Caspase-1的量是没有变化的。证明RE-1 涂层Er₂O₃会抑制Er₂O₃激活炎症小体，从而使得细胞分泌到上清中的 Cleaved-IL-1β和Cleaved-Caspase-1减少。