用于鉴定茄病镰刀菌或/和尖孢镰刀菌的引物序列、试剂盒及其方法

摘要

本发明公开了一种用于鉴定茄病镰刀菌或/和尖孢镰刀菌的引物序列、试剂盒及其分子检测方法，并且验证具有极高的特异性，利用该组引物及鉴定方法能够快速、准确地鉴定茄病镰刀菌和尖孢镰刀菌，该体系的建立将对瓜类根腐病和枯萎病病害早期快速检测、土壤病菌群体分布及病害的防治具有重要意义。同时，基于TEF1-α为靶标基因的分子检测体系的建立为复杂的镰刀菌属病原菌系统学分类鉴定提供理论依据和鉴定方法。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，开发出一种能够快速鉴定茄病镰刀菌或/和尖孢镰刀 菌的引物序列、试剂盒及其鉴定方法。

背景技术

瓜类枯萎病是一种世界性土传维管束病害，对瓜类的产量和品质构成严重威胁，连 作地块的损失率达到30%以上，严重地块甚至绝收。瓜类枯萎病是由尖孢镰刀菌 （Fusarium oxysporum）引起的，根据瓜类上不同的寄主可以将尖孢镰刀菌划分为7个 专化型。该病菌在土壤和植物残体上可长期存活，并且植株的整个生育期均可发生，一 旦发病就难以根除，化学药剂的施用也难以达到控制病害的效果。随着保护地瓜类生产 的快速发展，瓜类根腐病也逐渐上升为主要病害之一，对瓜类的产量和质量造成了极为 不利的影响。根腐病发生早、蔓延快、为害大、损失重，保护地的平均发病率为15%， 高的达到72%，损失率达20%以上。瓜类根腐病的主要致病菌是茄病镰刀菌（Fusarium  solani）,该病从始花期开始发病，为害植物根部，造成根部皮层腐烂，上部茎叶萎蔫死 亡。

由于瓜类根腐病的发病症状特征与枯萎病极为相似，并且引起病害的主要致病菌茄 病镰刀菌（Fusarium solani）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）又同属于镰刀菌属。 迄今为止，基于镰刀菌形态学方面的分类鉴定方法很难适用于极易发生突变的镰刀菌， 操作复杂并且鉴定准确度低，很容易造成误诊，贻误防治时机、影响防治效果。

随着分子生物学技术的不断发展，镰刀菌属的鉴定工作也引入了分子系统学方法， 常用于鉴定该属系统学研究的主要DNA序列包括：核糖体内转录间隔区ITS、β微管 蛋白等。而茄病镰刀菌（Fusarium solani）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的ITS、 β微管蛋白等序列的相似度极高，利用这些基因的多位点序列设计的鉴定引物无法区分 这两种病原菌。因此，需要找到能够区分这两种病原菌的基因序列，建立一套新的分子 生物学鉴定体系，能够快速、准确地鉴定茄病镰刀菌或/和尖孢镰刀菌，该体系的建立将 对瓜类根腐病和枯萎病病害早期快速检测、土壤病菌群体分布及病害的防治具有重要意 义。

已有的专利号为201010567807.5的中国专利技术报道《一种检测尖孢镰刀菌的PCR 方法及试剂盒》，该发明根据克隆测序的尖孢镰刀菌ITS区序列设计出特异性引物 Fo1/Fo2。然而镰刀菌真菌由于种间rDNA-ITS序列相似性较高，仅以ITS区做为靶序列 设计引物，有可能无法将其与同属中的其它种分开。且利用Fo1/Fo2引物并未检测到本 发明中样品FO-2的尖孢镰刀菌DNA，即该引物不能鉴定所有的尖孢镰刀菌。另外，赤霉 菌属分类上的许多镰刀菌种并没有ITS2同源基因，因此以ITS区为靶标序列用于区分镰 刀菌种容易得出错误的系统发育推断。另一专利号为201110444010.0的中国专利技术报 道《尖孢镰刀菌的分子检测方法及其引物》，该发明分析比较了尖孢镰刀菌（F. oxysporum）与其它病原真菌的CYP51C序列，设计出对尖孢镰刀菌基因组DNA有高度特 异性的引物。但是CYP51基因在不同真菌中的同源基因的数量不同，多数病原真菌的 CYP51的同源基因为1-2个，只有尖孢镰刀菌和禾谷镰刀菌等有3个CYP51同源基因，因 此以有多个同源基因的CYP51序列为靶标基因可能造成鉴定失败。利用C1/C2该对引物 并未检测到本发明中样品FO-X的尖孢镰刀菌DNA，即该引物不能鉴定所有的尖孢镰刀 菌。

发明内容

本发明所要解决的首要技术问题是提供鉴定茄病镰刀菌或/和尖孢镰刀菌的引物序 列，该组引物灵敏度好特异性高，利用该组引物能对瓜类根腐病和枯萎病进行早期预警 和防治。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供鉴定茄病镰刀菌或/和尖孢镰刀菌的试剂 盒，该试剂盒内引物灵敏度好特异性高，利用该组引物能对瓜类根腐病和枯萎病进行早 期预警和防治。

本发明所要解决的再一个技术问题是提供相关的鉴定茄病镰刀菌或/和尖孢镰刀菌 的方法。

本发明解决上述首要技术问题的技术方案是：一种用于鉴定茄病镰刀菌的引物序 列，其特征在于：上游引物具有序列表中SEQ ID NO:1所述的碱基序列，下游引物具有 序列表中SEQ ID NO:2所述的碱基序列。

一种用于鉴定尖孢镰刀菌的引物序列，其特征在于：上游引物具有序列表中SEQ ID  NO:3所述的碱基序列，下游引物具有序列表中SEQ ID NO:2所述的碱基序列。

一种用于同时鉴定茄病镰刀菌和尖孢镰刀菌的引物序列，其特征在于：包括三条引 物，第一条引物具有序列表中SEQ ID NO:1所述的碱基序列，第二条引物具有序列表中 SEQ ID NO:2所述的碱基序列，第三条引物具有序列表中SEQ ID NO:3所述的碱基序列。

本发明解决上述另一个技术问题的技术方案是：一种检测茄病镰刀菌的试剂盒，该 试剂盒包含两条引物，上游引物具有序列表中SEQ ID NO:1所述的碱基序列，下游引物 具有序列表中SEQ ID NO:2所述的碱基序列。

一种检测尖孢镰刀菌的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包含两条引物，上游引物具 有序列表中SEQ ID NO:3所述的碱基序列，下游引物具有序列表中SEQ ID NO:2所述 的碱基序列。

一种同时检测茄病镰刀菌和尖孢镰刀菌的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包含三条 引物，第一条引物具有序列表中SEQ ID NO:1所述的碱基序列，第二条引物具有序列表 中SEQ ID NO:2所述的碱基序列，第三条引物具有序列表中SEQ ID NO:3所述的碱基 序列。

本发明解决上述再一个技术问题的技术方案是：一种鉴定茄病镰刀菌的方法，其特 征在于：提取待测样品DNA作为模版，利用上述第1组对应的引物进行PCR扩增反应， PCR产物经凝胶电泳后用溴化乙锭染色，根据凝胶中条带大小判断：若存在347-bp的 DNA条带，则检测样品中含有茄病镰刀菌。

一种鉴定尖孢镰刀菌的方法，其特征在于：提取待测样品DNA作为模版，利用上 述第2组对应的引物进行PCR扩增反应，PCR产物经凝胶电泳后用溴化乙锭染色，根 据凝胶中条带大小判断：若存在228-bp的DNA条带，则检测样品中含有尖孢镰刀菌。

一种鉴定茄病镰刀菌和尖孢镰刀菌的方法，其特征在于：提取待测样品DNA作为 模版，利用上述第3组对应的引物进行PCR扩增反应，PCR产物经凝胶电泳后用溴化 乙锭染色，根据凝胶中条带大小判断：若存在347-bp的DNA条带，则检测样品中含有 茄病镰刀菌；若存在228-bp的DNA条带，则检测样品中含有尖孢镰刀菌。

优选，所述的PCR反应的扩增体系为：1μL DNA模板（约0.4ng），引物各0.2μmol l^－1，dNTP0.2μmol l^－1,MgCl₂2mmol l^－1,1×缓冲液（上海博彩生产），聚合酶1.5U个 单位，双蒸水补足至25μL。

优选，所述的PCR反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性30s，53℃退火30s， 72℃延伸30s，进行35个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物用1.5%的琼脂糖在 1×TAE缓冲液中电泳后，用溴化乙锭显色拍照。

研究表明，茄病镰刀菌和尖孢镰刀菌的ITS、β微管蛋白等序列的相似度极高，在 镰刀菌属种间的变异小，利用这些基因的多位点序列设计的引物特异性低，可能无法将 镰刀菌属中的其他种区分开；而编码蛋白翻译装置主要部分的翻译延长因子1-α （Translation elongation factor1-α,TEF1-α）具有较高的系统多样性,在区分茄病镰刀菌 和尖孢镰刀菌这两个种的多位点序列中利用率极高。首先，TEF1-α基因在Fusarium镰 刀菌的种水平上包含大量信息，且不同种的TEF1-α具有遗传多样性和种内稳定性；其 次，TEF1-α在Fusarium镰刀病菌基因组上只有单个拷贝；第三，目前已有扩增不同 Fusarium种中TEF1-α基因的通用引物，因此TEF1-α能够作为鉴定镰刀菌不同种的特 异性基因序列。通过比对茄病镰刀菌和尖孢镰刀菌的TEF1-α序列发现，这两个菌种之 间的TEF1-α序列存在较大差异，但也有完全一致的序列片段。根据两个菌种的TEF1- α基因序列的差异，分别设计正向引物FS-F与茄病镰刀菌菌株的特异碱基序列配对， 正向引物FO-F与尖孢镰刀菌菌株的特异碱基序列配对；根据两个菌种TEF1-α基因序 列一致部分，设计反向引物Fu-R与这两个菌株的一致序列配对。

利用引物对FS-F和Fu-R对含有茄病镰刀菌DNA的样品进行扩增可以得到347-bp 的条带；利用引物对FO-F和Fu-R对含有尖孢镰刀菌DNA的样品进行扩增可以得到 228-bp的条带；利用三条引物FS-F、FO-F和Fu-R对含有茄病镰刀菌和尖孢镰刀菌混 合DNA的样品进行扩增可以同时得到347-bp和228-bp两个条带；利用任何一组引物 对含有其他真菌DNA的样品进行扩增，都不能扩增出任何产物。

与现有技术相比，本发明利用的靶标基因TEF1-α在Fusarium镰刀菌的种水平上包 含大量信息，且不同种的TEF1-α具有遗传多样性和种内稳定性；TEF1-α在Fusarium 镰刀病菌基因组上只有单个拷贝，即每个镰刀病菌在种水平上都只有一个独一无二的 TEF1-α基因，因此TEF1-α能够作为鉴定镰刀菌不同种的特异性基因序列。本发明根 据茄病镰刀菌和尖孢镰刀菌的TEF1-α序列差异，设计了上述三条特异性引物，能用来 快速、准确、便捷地鉴定样品中茄病镰刀菌或/和尖孢镰刀菌，该鉴定方法为瓜类根腐病 和枯萎病的治理提供技术支持。

附图说明

图1为本发明引物在TEF1-α上的位置序列；

图2为本发明引物特异性检测样品DNA扩增后的凝胶电泳图；

图3为本发明田间病株DNA扩增后的凝胶电泳图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来详细阐明本发明，但本发明并不局限于以下实施例。

菌株选用

2个茄病镰刀菌(Fusarium solani)FS-4和FS-5、2个尖孢镰刀菌(F.oxysporum)FO-1 和FO-2、禾谷镰刀菌(F.graminearum)、半裸镰刀菌（F.semitectum）、灰葡萄孢菌（Botrytis  cinerea）、蔓枯病菌(Didymella bryoniae)、立枯病菌(Rhizoctonia solani)和菌核病菌 (Sclerotinia sclerotiorum)。

上述菌株均保藏于宁波市农科院蔬菜研究所，也可以通过病原真菌分离纯化方法从 瓜类等病株中获得。而且实验室一般可以分离得到。

DNA提取

本发明中茄病镰刀菌、尖孢镰刀菌和其他病原真菌均采用简便快速的菌丝DNA提 取办法，具体操作步骤如下：

用灭菌牙签从平板上刮取菌丝约100mg，置于1.5-mL Eppendorf管中，加500μL DNA提取裂解液（0.2mol/L Tris-HCl，0.05mol/L EDTA，0.02mol/L NaCl，1%SDS）， 用电钻充分研磨，振荡混匀，室温静止10min；13200r/min4℃，离心5min；取上清液 约400μL于新的1.5-mL Eppendorf管中，加750μL无水乙醇，混和混匀，13200r/min 4℃，离心5min，弃上清；沉淀用70%乙醇洗涤，室温放置干燥5-10min，溶于30μ L TE缓冲液(pH8.0)，-20℃保存备用。

本发明中田间病株DNA提取方法：剪取病组织约100mg，置于1.5-mL Eppendorf 管中，加500μL抽提液（2%聚乙烯吡咯烷酮和DNA提取裂解液混合物），其他步骤 参照菌丝DNA提取办法，将提取后的DNA溶液用UNIQ-10柱式PCR产物回收试剂盒 （上海生工生产）过柱纯化，-20℃保存备用。

引物合成

根据茄病镰刀菌和尖孢镰刀菌这两个菌种的TEF1-α基因序列的差异，分别设计正 向引物FS-F和FO-F，反向引物Fu-R（引物所在的序列如图1所示）。

上述引物的具体序列与序列表中序列对应关系如下表1所示：

表1、本发明中所有的PCR引物序列

上述序列的引物由上海博彩合成。

引物特异性验证

以提取的茄病镰刀菌、尖孢镰刀菌和其它6种真菌的DNA为模板，分别用种特异 性引物FS-F、FO-F和Fu-R进行常规PCR反应，每个反应均有一个阴性对照（以无菌 水作为模板）。

PCR反应的扩增体系为：1μL DNA模板（约0.4ng），三条引物各0.2μmol l^－1， dNTP0.2μmol l^－1,MgCl₂2mmol l^－1,1×缓冲液（上海博彩生产），聚合酶1.5U个单位， 双蒸水补足至25μL。

PCR反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s， 进行35个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物用1.5%的琼脂糖在1×TAE缓冲液中 电泳后，用溴化乙锭显色拍照。

从电泳照片上看（如图2所示），用FS-F、FO-F和Fu-R三条引物扩增的PCR产物 中，2个茄病镰刀菌(F.solani)FS-4和FS-5的DNA均能扩增到347-bp的DNA条带，2 个尖孢镰刀菌(F.oxysporum)FO-1和FO-2的DNA均能扩增到228-bp的DNA条带，茄 病镰刀菌和尖孢镰刀菌的混合DNA(Fu-1,Fu-3)能同时扩增到347-bp和228-bp的条带， 而其它病原真菌没有扩增到任何条带。说明该组种特异性引物对能够鉴定茄病镰刀菌和 尖孢镰刀菌。

田间病株检测

将田间采集的叶片萎蔫、根茎部发病的西瓜病株提取DNA，提取方法参照病株DNA 提取。提取的DNA利用FS-F、FO-F和Fu-R进行常规PCR反应，每个反应均有一个阴 性对照（以无菌水作为模板）。PCR反应的扩增体系和反应条件如上所述。如图3所示， 病株1、2均能扩增到228-bp的DNA条带，说明病株被尖孢镰刀菌侵染，病株7、8能 扩增到347-bp的DNA条带，说明病株被茄病镰刀菌侵染，病株5扩增不到任何条带， 说明病株并未被尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌这两种病菌侵染。