法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2017-11-24
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12Q1/68 授权公告日:20160113 终止日期:20161010 申请日:20141010
专利权的终止
2016-01-13
授权
授权
2015-02-04
实质审查的生效 IPC(主分类):C12Q1/68 申请日:20141010
实质审查的生效
2015-01-07
公开
公开
技术领域
本发明属于食品检测技术领域，尤其涉及一种肉与肉制品中猪源成 分的检测方法、牛源成分的检测方法及羊源成分的检测方法。
背景技术
随着市场经济的不断深入发展，部分不法商贩为了谋求不正当利 益，在肉或肉制品中掺杂其他价格便宜的肉种，在肉及肉制品市场出现 了一种以次充好、以假乱真的现象。肉或肉制品中掺有标称以外的其他 价格便宜的动物源性成分，有的甚至全部为标称以外的其他价格便宜的 动物源性成分，这极大地损害了消费者的利益，扰乱了流通市场秩序和 健康发展，同时也对民族宗教信仰造成一定的潜在冲突。
传统一般采用感官方法对肉或肉制品的色泽、气味、组织形状等参 数进行判断，但是其可靠性较差，尤其是添加了色素和芳香剂等添加剂 或者经过其它加工处理的肉及肉制品而言，感官方法判断准确性更低。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种肉与肉制品中猪源成分的检 测方法、牛源成分的检测方法及羊源成分的检测方法，本发明提供的检 测方法结果准确、可靠。
本发明提供了一种用于检测肉与肉制品中猪源成分的试剂盒，包 括：如SEQ ID No.1所示的上游引物和如SEQ ID No.2所示的下游引物。
本发明以Genbank上已经登录公布的所有猪的Cytb基因序列为基 础，运用生物软件DnaStar进行序列比对分析，找出来自不同国家、地 区、品种猪、的Cytb基因种内保守序列区域，用于设计上下游扩增引 物，将所设计出的各物种PCR扩增引物进行再次比对，排除种间交叉 性，保证扩增的特异性。同时，找出猪的Cytb基因序列中共有的同源 序列，设计哺乳动物检测引物，用以对各检测体系进行监控。最后，将 获得的各物种上下游扩增引物序列提交Gembank，进行Blast确认，以 确保所设计的引物序列对目前已经公布的DNA序列没有非特异性检测 扩增，并选定上游引物和下游引物。本发明选用特定的上游引物和下游 引物用于检测肉与肉制品中的猪源成分，其具有良好的特异性，从而能 够实现对猪源成分的检测。
以如SEQ ID No.1所示的上游引物和如SEQ ID No.2所示的下游引 物进行PCR扩增，其扩增位点及扩增片段大小如表1所示：
表1猪源成分的扩增位点及扩增片段大小
所述上游引物的浓度优选为0.1μM～0.5μM，更优选为0.5μM； 所述下游引物的浓度优选为0.1μM～0.5μM，更优选为0.5μM。
所述试剂盒中还包括DNA聚合酶、10×PCR Buffer溶液和去离子 水，所述DNA聚合酶的浓度优选为0.5-1u/μL。所述试剂盒中还包括， 所述10×PCR Buffer溶液具体包括：100mM Tris-Hcl(pH8.3)，500mM KCl，15mM MgCl2。
本发明还提供了一种肉与肉制品中猪源成分的检测方法，包括以下 步骤：
提取肉样品或肉制品样品的DNA；
以所述DNA为模板进行PCR扩增，所述PCR扩增反应体系中的 上游引物如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示；
对所述PCR扩增产物进行电泳，鉴定所述扩增产物。
本发明首先提取肉样品或者肉制品样品中的DNA，本发明对所述 DNA的提取方法没有特殊限制，小量提取时可以使用商业试剂盒提取， 大量提取时可以按照CTAB-NaCl法进行提取，具体而言：
小量提取时，其提取方法为：
a.将称取的肉糜，放入研钵中，加入液氮，待样品冷冻完全后快速、 用力研磨至粉末状，研磨时应间断加入液氮以防止材料融化；
b.将研钵移入65℃水浴，当样品粉末刚开始融化时，向研钵中加 入700μl的Solution A和1.2μl的Rnase A，研磨30秒；
c.收集650μl研磨好的组织匀浆至Collection Tube中。如匀浆体积 不足650μl，补充Solution A至650μl。65℃保温10分钟；
d.加入400μl的Solution B，振荡混匀；
e.加入1ml的4℃预冷的Solution C，充分混匀后，12000rpm离心 2分钟；
f.弃去上层有机相，再加入1ml的4℃预冷的Solution C，充分混 匀后，12000rpm离心2分钟；
g.弃去上层有机相，然后将水相溶液(无色下层)转移至置于 Collection Tube上的Filter Cup中，12000rpm离心1分钟；
h.弃Filter Cup，在滤液中加入400μl的DB Buffer，混合均匀；
i.将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。将上述操 作的混合溶液转移至Spin Column中，12000rpm离心1分钟，弃滤液；
j.将500μl的Rinse A加入至Spin Column中，12000rpm离心30 秒，弃滤液；
k.将700μl的Rinse B加入至Spin Column中，12000rpm离心30 秒，弃滤液；
l.重复上步操作；
m.将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column 膜的中央处加入50－200μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1 分钟；
n.12000rpm离心1分钟洗脱收集DNA。
大量提取时，其提取方法可以为：
a.取2g硏碎的样本肌肉组织，至50mL离心管中，加10mL CTAB-Nacl裂解液，65℃振荡水浴1小时；
b.加入10μL Proteinase K(20mg/ml)，65℃振荡水浴，过夜；
c.取1ml过夜处理液至Eppendorf离心管中，12000rpm离心10min；
d.取800μL离心上清至新离心管中，加入600μL氯仿，充分混匀， 12000rpm离心10min；
e.取600μL上层水相至新的离心管中，加入500μL预冷异丙醇， 上下颠倒离心管，室温沉淀DNA，30min；
f.12000rpm离心10min，弃异丙醇，加入1ml 75％冰乙醇进行洗涤 DNA，12000rpm离心2min，弃尽乙醇，室温下风干，加入适量ddw溶 解DNA，并测定OD260值。
获取肉样品或者肉制品中的DNA后，以其作为模板进行PCR扩增， 所述PCR扩增反应体系中的上游引物如SEQ ID No.1所示，下游引物 如SEQ ID No.2所示。
所述上游引物的浓度优选为0.1μM～0.5μM，更优选为0.5μM； 所述下游引物的浓度优选为0.1μM～0.5μM，更优选为0.5μM。
所述PCR扩增反应体系中还包括DNA聚合酶、10×PCR Buffer溶 液和去离子水，所述DNA聚合酶的浓度优选为0.5-1u/μL。所述试剂盒 中还包括，所述10×PCR Buffer溶液具体包括：100mM Tris-Hcl(pH8.3)， 500mM KCl，15mM MgCl2。所述PCR扩增体系中，所述模板DNA的 浓度优选为10～100ng/μL。
在一个具体实施例中，所述PCR扩增反应体系可以包括：
所述PCR扩增参数为：
PCR扩增结束后，对得到的PCR扩增产物进行电泳，鉴定所述扩 增产物，具体方法如下：制备1％浓度琼脂糖凝胶，取8μL扩增产物， 进行电泳，电泳结束，EB染色，紫外下观察有无非特异性扩增条带， 若有说明肉或肉制品中含有猪源性成分，若无说明肉或肉制品中不含有 猪源性成分。
为了进一步确认检测结果，本发明还可以进一步对得到的扩增产物 进行酶切，鉴定酶切产物，从而判断肉样品或者肉制品中是否含有猪源 成分。本发明优选用限制性内切酶BamHI对所述扩增产物进行酶切， 其相关参数如下：
酶切完毕后，如果得到的酶切片段符合目标片段，即可确认被检测 样品中含有猪源性成分；若不符合目标片段，可以对酶切片段进行进一 步测序。
与现有技术相比，本发明以分子生物学中的聚合酶链式反应 (PCR)法为基础，从基因水平对肉与肉制品DNA进行鉴定鉴别，首 先提取肉样品或肉制品样品的DNA；然后以所述DNA为模板进行PCR 扩增，所述PCR扩增反应体系中的上游引物如SEQ ID No.1所示，下 游引物如SEQ ID No.2所示；对所述PCR扩增产物进行酶切，鉴定所 述酶切产物，从而根据扩增产物的长度大小以及酶切位点信息进行综合 分析，判断肉与肉制品中的猪源成分。本发明选择上述引物组对肉与肉 制品中提取的DNA模板进行PCR扩增，具有较高的特异性，能够保证 检测方法的灵敏度和准确性。实验结果表明，本发明提供的方法对肉与 肉制品中猪源成分的检测下限为1ng/μL，准确率可达100％。
本发明提供了一种用于检测肉与肉制品中牛源成分的试剂盒，包 括：如SEQ ID No.3所示的上游引物和如SEQ ID No.4所示的下游引物。
本发明以Genbank上已经登录公布的所有牛的Cytb基因序列为基 础，运用生物软件DnaStar进行序列比对分析，找出来自不同国家、地 区、品种的牛的Cytb基因种内保守序列区域，用于设计上下游扩增引 物，将所设计出的各物种PCR扩增引物进行再次比对，排除种间交叉 性，保证扩增的特异性。同时，找出牛的Cytb基因序列中共有的同源 序列，设计哺乳动物检测引物，用以对各检测体系进行监控。最后，将 获得的各物种上下游扩增引物序列提交Gembank，进行Blast确认，以 确保所设计的引物序列对目前已经公布的DNA序列没有非特异性检测 扩增，并选定上游引物和下游引物。本发明选用特定的上游引物和下游 引物用于检测肉与肉制品中的牛源成分，其具有良好的特异性，从而能 够实现对牛源成分的检测。
以如SEQ ID No.3所示的上游引物和如SEQ ID No.4所示的下游引 物进行PCR扩增，其扩增位点及扩增片段大小如表2所示：
表2牛源成分的扩增位点及扩增片段大小
所述上游引物的浓度优选为0.1μM～0.5μM，更优选为0.5μM； 所述下游引物的浓度优选为0.1μM～0.5μM，更优选为0.5μM。
所述试剂盒中还包括DNA聚合酶、10×PCR Buffer溶液和去离子 水，所述DNA聚合酶的浓度优选为0.5-1u/μL。所述试剂盒中还包括， 所述10×PCR Buffer溶液具体包括：100mM Tris-Hcl(pH8.3)，500mM KCl，15mM MgCl2。
本发明还提供了一种肉与肉制品中牛源成分的检测方法，包括以下 步骤：
提取肉样品或肉制品样品的DNA；
以所述DNA为模板进行PCR扩增，所述PCR扩增反应体系中的 上游引物如SEQ ID No.3所示，下游引物如SEQ ID No.4所示；
对所述PCR扩增产物进行电泳，鉴定所述扩增产物。
本发明首先提取肉样品或者肉制品样品中的DNA，本发明对所述 DNA的提取方法没有特殊限制，小量提取时可以使用商业试剂盒提取， 大量提取时可以按照CTAB-NaCl法进行提取，具体而言：
小量提取时，其提取方法为：
a.将称取的肉糜，放入研钵中，加入液氮，待样品冷冻完全后快速、 用力研磨至粉末状，研磨时应间断加入液氮以防止材料融化；
b.将研钵移入65℃水浴，当样品粉末刚开始融化时，向研钵中加 入700μl的Solution A和1.2μl的Rnase A，研磨30秒；
c.收集650μl研磨好的组织匀浆至Collection Tube中。如匀浆体积 不足650μl，补充Solution A至650μl。65℃保温10分钟；
d.加入400μl的Solution B，振荡混匀；
e.加入1ml的4℃预冷的Solution C，充分混匀后，12000rpm离心 2分钟；
f.弃去上层有机相，再加入1ml的4℃预冷的Solution C，充分混 匀后，12000rpm离心2分钟；
g.弃去上层有机相，然后将水相溶液(无色下层)转移至置于 Collection Tube上的Filter Cup中，12000rpm离心1分钟；
h.弃Filter Cup，在滤液中加入400μl的DB Buffer，混合均匀；
i.将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。将上述操 作的混合溶液转移至Spin Column中，12000rpm离心1分钟，弃滤液；
j.将500μl的Rinse A加入至Spin Column中，12000rpm离心30 秒，弃滤液；
k.将700μl的Rinse B加入至Spin Column中，12000rpm离心30 秒，弃滤液；
l.重复上步操作；
m.将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column 膜的中央处加入50－200μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1 分钟；
n.12000rpm离心1分钟洗脱收集DNA。
大量提取时，其提取方法可以为：
a.取2g硏碎的样本肌肉组织，至50mL离心管中，加10mL CTAB-Nacl裂解液，65℃振荡水浴1小时；
b.加入10μL Proteinase K(20mg/ml)，65℃振荡水浴，过夜；
c.取1ml过夜处理液至Eppendorf离心管中，12000rpm离心10min；
d.取800μL离心上清至新离心管中，加入600μL氯仿，充分混匀， 12000rpm离心10min；
e.取600μL上层水相至新的离心管中，加入500μL预冷异丙醇， 上下颠倒离心管，室温沉淀DNA，30min；
f.12000rpm离心10min，弃异丙醇，加入1ml 75％冰乙醇进行洗涤 DNA，12000rpm离心2min，弃尽乙醇，室温下风干，加入适量ddw溶 解DNA，并测定OD260值。
获取肉样品或者肉制品中的DNA后，以其作为模板进行PCR扩增， 所述PCR扩增反应体系中的上游引物如SEQ ID No.3所示，下游引物 如SEQ ID No.4所示。
所述上游引物的浓度优选为0.1μM～0.5μM，更优选为0.5μM； 所述下游引物的浓度优选为0.1μM～0.5μM，更优选为0.5μM。
所述PCR扩增反应体系中还包括DNA聚合酶、10×PCR Buffer溶 液和去离子水，所述DNA聚合酶的浓度优选为0.5-1u/μL。所述试剂盒 中还包括，所述10×PCR Buffer溶液具体包括：100mM Tris-Hcl(pH8.3)， 500mM KCl，15mM MgCl2。所述PCR扩增体系中，所述模板DNA的 浓度优选为10～100ng/μL。
在一个具体实施例中，所述PCR扩增反应体系可以包括：
所述PCR扩增参数为：
PCR扩增结束后，对得到的PCR扩增产物进行电泳，鉴定所述扩 增产物，具体方法如下：制备1％浓度琼脂糖凝胶，取8μL扩增产物， 进行电泳，电泳结束，EB染色，紫外下观察有无非特异性扩增条带， 若有说明肉或肉制品中含有牛源性成分，若无说明肉或肉制品中不含有 牛源性成分。
为了进一步确认检测结果，本发明还可以进一步对得到的扩增产物 进行酶切，鉴定酶切产物，从而判断肉样品或者肉制品中是否含有牛源 成分。本发明优选用限制性内切酶BamHI对所述扩增产物进行酶切， 其相关参数如下：
酶切完毕后，如果得到的酶切片段符合目标片段，即可确认被检测 样品中含有牛源性成分；若不符合目标片段，可以对酶切片段进行进一 步测序。
与现有技术相比，本发明以分子生物学中的聚合酶链式反应 (PCR)法为基础，从基因水平对肉与肉制品DNA进行鉴定鉴别，首 先提取肉样品或肉制品样品的DNA；然后以所述DNA为模板进行PCR 扩增，所述PCR扩增反应体系中的上游引物如SEQ ID No.3所示，下 游引物如SEQ ID No.4所示；对所述PCR扩增产物进行酶切，鉴定所 述酶切产物，从而根据扩增产物的长度大小以及酶切位点信息进行综合 分析，判断肉与肉制品中的牛源成分。本发明选择上述引物组对肉与肉 制品中提取的DNA模板进行PCR扩增，具有较高的特异性，能够保证 检测方法的灵敏度和准确性。实验结果表明，本发明提供的方法对肉与 肉制品中牛源成分的检测下限为0.1ng/μL，准确率可达100％。
本发明提供了一种用于检测肉与肉制品中羊源成分的试剂盒，包 括：如SEQ ID No.5所示的上游引物和如SEQ ID No.6所示的下游引物。
本发明以Genbank上已经登录公布的所有羊的Cytb基因序列为基 础，运用生物软件DnaStar进行序列比对分析，找出来自不同国家、地 区、品种的羊的Cytb基因种内保守序列区域，用于设计上下游扩增引 物，将所设计出的各物种PCR扩增引物进行再次比对，排除种间交叉 性，保证扩增的特异性。同时，找出羊的Cytb基因序列中共有的同源 序列，设计哺乳动物检测引物，用以对各检测体系进行监控。最后，将 获得的各物种上下游扩增引物序列提交Gembank，进行Blast确认，以 确保所设计的引物序列对目前已经公布的DNA序列没有非特异性检测 扩增，并选定上游引物和下游引物。本发明选用特定的上游引物和下游 引物用于检测肉与肉制品中的羊源成分，其具有良好的特异性，从而能 够实现对羊源成分的检测。
以如SEQ ID No.5所示的上游引物和如SEQ ID No.6所示的下游引 物进行PCR扩增，其扩增位点及扩增片段大小如表3所示：
表3羊源成分的扩增位点及扩增片段大小
所述上游引物的浓度优选为0.1μM～0.5μM，更优选为0.5μM； 所述下游引物的浓度优选为0.1μM～0.5μM，更优选为0.5μM。
所述试剂盒中还包括DNA聚合酶、10×PCR Buffer溶液和去离子 水，所述DNA聚合酶的浓度优选为0.5-1u/μL。所述试剂盒中还包括， 所述10×PCR Buffer溶液具体包括：100mM Tris-Hcl(pH8.3)，500mM KCl，15mM MgCl2。
本发明还提供了一种肉与肉制品中羊源成分的检测方法，包括以下 步骤：
提取肉样品或肉制品样品的DNA；
以所述DNA为模板进行PCR扩增，所述PCR扩增反应体系中的 上游引物如SEQ ID No.3所示，下游引物SEQ ID No.4所示；
对所述PCR扩增产物进行电泳，鉴定所述扩增产物。
本发明首先提取肉样品或者肉制品样品中的DNA，本发明对所述 DNA的提取方法没有特殊限制，小量提取时可以使用商业试剂盒提取， 大量提取时可以按照CTAB-NaCl法进行提取，具体而言：
小量提取时，其提取方法为：
a.将称取的肉糜，放入研钵中，加入液氮，待样品冷冻完全后快速、 用力研磨至粉末状，研磨时应间断加入液氮以防止材料融化；
b.将研钵移入65℃水浴，当样品粉末刚开始融化时，向研钵中加 入700μl的Solution A和1.2μl的Rnase A，研磨30秒；
c.收集650μl研磨好的组织匀浆至Collection Tube中。如匀浆体积 不足650μl，补充Solution A至650μl。65℃保温10分钟；
d.加入400μl的Solution B，振荡混匀；
e.加入1ml的4℃预冷的Solution C，充分混匀后，12000rpm离心 2分钟；
f.弃去上层有机相，再加入1ml的4℃预冷的Solution C，充分混 匀后，12000rpm离心2分钟；
g.弃去上层有机相，然后将水相溶液(无色下层)转移至置于 Collection Tube上的Filter Cup中，12000rpm离心1分钟；
h.弃Filter Cup，在滤液中加入400μl的DB Buffer，混合均匀；
i.将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。将上述操 作的混合溶液转移至Spin Column中，12000rpm离心1分钟，弃滤液；
j.将500μl的Rinse A加入至Spin Column中，12000rpm离心30 秒，弃滤液；
k.将700μl的Rinse B加入至Spin Column中，12000rpm离心30 秒，弃滤液；
l.重复上步操作；
m.将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column 膜的中央处加入50－200μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1 分钟；
n.12000rpm离心1分钟洗脱收集DNA。
大量提取时，其提取方法可以为：
a.取2g硏碎的样本肌肉组织，至50mL离心管中，加10mL CTAB-Nacl裂解液，65℃振荡水浴1小时；
b.加入10μL Proteinase K(20mg/ml)，65℃振荡水浴，过夜；
c.取1ml过夜处理液至Eppendorf离心管中，12000rpm离心10min；
d.取800μL离心上清至新离心管中，加入600μL氯仿，充分混匀， 12000rpm离心10min；
e.取600μL上层水相至新的离心管中，加入500μL预冷异丙醇， 上下颠倒离心管，室温沉淀DNA，30min；
f.12000rpm离心10min，弃异丙醇，加入1ml 75％冰乙醇进行洗涤 DNA，12000rpm离心2min，弃尽乙醇，室温下风干，加入适量ddw溶 解DNA，并测定OD260值。
获取肉样品或者肉制品中的DNA后，以其作为模板进行PCR扩增， 所述PCR扩增反应体系中的上游引物如SEQ ID No.3所示，下游引物 如SEQ ID No.4所示。
所述上游引物的浓度优选为0.1μM～0.5μM，更优选为0.5μM； 所述下游引物的浓度优选为0.1μM～0.5μM，更优选为0.5μM。
所述PCR扩增反应体系中还包括DNA聚合酶、10×PCR Buffer溶 液和去离子水，所述DNA聚合酶的浓度优选为0.5-1u/μL。所述试剂盒 中还包括，所述10×PCR Buffer溶液具体包括：100mM Tris-Hcl(pH8.3)， 500mM KCl，15mM MgCl2。所述PCR扩增体系中，所述模板DNA的 浓度优选为10～100ng/μL。
在一个具体实施例中，所述PCR扩增反应体系可以包括：
所述PCR扩增参数为：
PCR扩增结束后，对得到的PCR扩增产物进行电泳，鉴定所述扩 增产物，具体方法如下：制备1％浓度琼脂糖凝胶，取8μL扩增产物， 进行电泳，电泳结束，EB染色，紫外下观察有无非特异性扩增条带， 若有说明肉或肉制品中含有羊源性成分，若无说明肉或肉制品中不含有 羊源性成分。
为了进一步确认检测结果，本发明还可以进一步对得到的扩增产物 进行酶切，鉴定酶切产物，从而判断肉样品或者肉制品中是否含有羊源 成分。本发明优选用限制性内切酶BamHI对所述扩增产物进行酶切， 其相关参数如下：
酶切完毕后，如果得到的酶切片段符合目标片段，即可确认被检测 样品中含有羊源性成分；若不符合目标片段，可以对酶切片段进行进一 步测序。
与现有技术相比，本发明以分子生物学中的聚合酶链式反应 (PCR)法为基础，从基因水平对肉与肉制品DNA进行鉴定鉴别，首 先提取肉样品或肉制品样品的DNA；然后以所述DNA为模板进行PCR 扩增，所述PCR扩增反应体系中的上游引物如SEQ ID No.5所示，下 游引物如SEQ ID No.6所示；对所述PCR扩增产物进行酶切，鉴定所 述酶切产物，从而根据扩增产物的长度大小以及酶切位点信息进行综合 分析，判断肉与肉制品中的羊源成分。本发明选择上述引物组对肉与肉 制品中提取的DNA模板进行PCR扩增，具有较高的特异性，能够保证 检测方法的灵敏度和准确性。实验结果表明，本发明提供的方法对肉与 肉制品中羊源成分的检测下限为10ng/μL，准确率可达100％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将 对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见 地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人 员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其 他的附图。
图1为本发明实施例1得到的扩增产物的电泳结果；
图2为本发明实施例1及比较例1～8得到的扩增产物的电泳结果；
图3为本发明实施例提供的酶切片段的电泳结果；
图4为本发明实施例4得到的扩增产物的电泳结果；
图5为本发明实施例4及比较例9～17得到的扩增产物的电泳结果；
图6为本发明实施例提供的酶切片段的电泳结果；
图7为本发明实施例7～16得到的扩增产物的电泳结果；
图8为本发明实施例17～26得到的扩增产物的电泳结果。
图9为本发明实施例27得到的扩增产物的电泳结果；
图10为本发明实施例27及比较例18～25得到的扩增产物的电泳结 果；
图11为本发明实施例提供的酶切片段的电泳结果；
图12为本发明实施例30～39得到的扩增产物的电泳结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的实施例，对本发明实施例中的技术方 案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分 实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技 术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于 本发明保护的范围。
实施例1
按照上文所述小量提取的方法提取北京黑猪DNA；
以提取得到的DNA作为模板，在以下PCR扩增反应体系中按照以下
扩增参数进行扩增，得到扩增产物；
所述PCR扩增参数为：
其中，上游引物如SEQ ID No.1所示，下游引物SEQ ID No.2所示；
PCR扩增结束后，对得到的PCR扩增产物进行电泳，鉴定所述扩增 产物，具体方法如下：制备1％浓度琼脂糖凝胶，取8μL扩增产物，进行 电泳，电泳结束，EB染色，紫外下观察，结果参见图1，图1为本发明实 施例1得到的扩增产物的电泳结果，其中1为实施例1的扩增产物的电泳 结果，M为DL2000。由图1可知，本发明提供的方法能够扩增得到目的 基因，因此能够用于猪源成分的检测。
实施例2
按照与实施例1相同的方法对猪肉进行检测，区别在于，提取长白 猪的DNA，结果参见图1，图1为本发明实施例1得到的扩增产物的电泳 结果，其中2为实施例2的扩增产物的电泳结果，M为DL2000。由图1可 知，本发明提供的方法能够实现对不同品种的猪源成分的检测。
比较例1～8
按照与实施例1相同的方法分别对兔肉、鹅肉、鸭肉、鸡肉、羊肉、 牛肉、马肉和驴肉进行检测，结果参见图2，图2为本发明实施例1及比 较例1～8得到的扩增产物的电泳结果，其中M为DL2000。由图2可知，本 发明提供的方法具有较好的特异性。
实施例3
按照与实施例1相同的方法获得扩增产物后，采用限制性内切酶 BamHI对其进行酶切，结果参见图3，其中M为DL2000，图3为本发明实 施例提供的酶切片段的电泳结果。
实施例4
按照上文所述小量提取的方法提取西门塔尔牛的DNA；
以提取得到的DNA作为模板，在以下PCR扩增反应体系中按照以下 扩增参数进行扩增，得到扩增产物；
PCR扩增反应体系可以包括：
所述PCR扩增参数为：
其中，上游引物如SEQ ID No.3所示，下游引物SEQ ID No.4所示；
PCR扩增结束后，对得到的PCR扩增产物进行电泳，鉴定所述扩增 产物，具体方法如下：制备1％浓度琼脂糖凝胶，取8μL扩增产物，进行 电泳，电泳结束，EB染色，紫外下观察，结果参见图4，图4为本发明实 施例4得到的扩增产物的电泳结果，其中1为实施例4的扩增产物的电泳 结果，M为DL2000。由图4可知，本发明提供的方法能够扩增得到目的 基因，因此能够用于牛源成分的检测。
实施例5
按照与实施例4相同的方法对牛肉进行检测，区别在于，提取黑白 花牛的DNA，结果参见图4，图4为本发明实施例4得到的扩增产物的电 泳结果，其中2为实施例5的扩增产物的电泳结果，M为DL2000。由图4 可知，本发明提供的方法能够实现对不同品种的牛源成分的检测。
比较例9～17
按照与实施例4相同的方法分别对兔肉、鹅肉、鸭肉、鸡肉、羊肉、 猪肉、马肉和驴肉进行检测，结果参见图5，图5为本发明实施例4及比 较例9～17得到的扩增产物的电泳结果，其中M为DL2000。由图5可知， 本发明提供的方法具有较好的特异性。
实施例6
按照与实施例1相同的方法获得扩增产物后，采用限制性内切酶 BamHI对其进行酶切，结果参见图6，其中M为DL2000，图6为本发明实 施例提供的酶切片段的电泳结果。
实施例7～16
按照与实施例1相同的方法对猪肉进行检测，区别在于，DNA模板 的浓度分别为0.01、0.1、1.0、10、50、100、200、300、400和500ng/ μL，结果参见图7，图7为本发明实施例7～16得到的扩增产物的电泳结 果，其中M为DL2000.由图7可知，本发明提供的方法对猪源成分的检测 下限为1ng/μL。
实施例17～26
按照与实施例4相同的方法对牛肉进行检测，区别在于，DNA模板 的浓度分别为0.01、0.1、1.0、10、50、100、200、300、400和500ng/ μL，结果参见图8，图8为本发明实施例17～26得到的扩增产物的电泳结 果，其中M为DL2000.由图8可知，本发明提供的方法对猪源成分的检测 下限为0.1ng/μL。
实施例27
按照上文所述小量提取的方法提取山羊肉DNA；
以提取得到的DNA作为模板，在以下PCR扩增反应体系中按照以下 扩增参数进行扩增，得到扩增产物；
PCR扩增反应体系可以包括：
所述PCR扩增参数为：
其中，上游引物如SEQ ID No.5所示，下游引物SEQ ID No.6所示；
PCR扩增结束后，对得到的PCR扩增产物进行电泳，鉴定所述扩增 产物，具体方法如下：制备1％浓度琼脂糖凝胶，取8μL扩增产物，进行 电泳，电泳结束，EB染色，紫外下观察，结果参见图9，图9为本发明实 施例27得到的扩增产物的电泳结果，其中，1为实施例27得到的扩增产 物的电泳结果，M为DL2000。由图9可知，本发明提供的方法能够扩增 得到目的基因，因此能够用于羊源成分的检测。
实施例28
按照与实施例27相同的方法对羊肉进行检测，区别在于，提取绵羊 DNA。结果参见图9，图9为本发明实施例27得到的扩增产物的电泳结果， 其中2为实施例28得到的扩增产物的电泳结果M为DL2000。由图9可知， 本发明提供的方法能够实现对不同品种的羊源成分的检测。
比较例18～25
按照与实施例1相同的方法分别对兔肉、鹅肉、鸭肉、鸡肉、猪肉、 牛肉、马肉和驴肉进行检测，结果参见图10，图10为本发明实施例27及 比较例18～25得到的扩增产物的电泳结果，其中M为DL2000。由图10可 知，本发明提供的方法具有较好的特异性。
实施例29
按照与实施例27相同的方法获得扩增产物后，采用限制性内切酶 sSPI对其进行酶切，结果参见图11，其中M为DL2000，图11为本发明实 施例提供的酶切片段的电泳结果。
实施例30～39
按照与实施例27相同的方法对羊肉进行检测，区别在于，DNA模板 的浓度分别为0.01、0.1、1.0、10、50、100、200、300、400和500ng/ μL，结果参见图12，图12为本发明实施例30～39得到的扩增产物的电泳 结果，其中M为DL2000。由图12可知，本发明提供的方法对羊源成分的 检测下限为10ng/μL。
实施例40～42
按照与实施例1相同的方法进行检测，区别在于，检测对象为猪肉 和牛肉的混合物、猪肉和羊肉的混合物以及猪肉、牛肉和羊肉的混合物， 检测20次均能够检测出其含猪肉成分，本发明提供的方法的准确率可达 100％。
实施例43
按照与实施例1相同的方法进行检测，区别在于，检测对象为牛肉 和羊肉的混合物，检测20次均无法检测出其含猪肉成分，本发明提供的 方法的准确率可达100％。
实施例44～46
按照与实施例4相同的方法进行检测，区别在于，检测对象为猪肉 和牛肉的混合物、牛肉和羊肉的混合物以及猪肉、牛肉和羊肉的混合物， 检测20次均能够检测出其含牛肉成分，本发明提供的方法的准确率可达 100％。
实施例47
按照与实施例1相同的方法进行检测，区别在于，检测对象为猪肉 和羊肉的混合物，检测20次均无法检测出其含牛肉成分，本发明提供的 方法的准确率可达100％。
实施例48～50
按照与实施例27相同的方法进行检测，区别在于，检测对象为猪肉 和羊肉的混合物、牛肉和羊肉的混合物以及猪肉、牛肉和羊肉的混合物， 检测20次均能够检测出其含牛肉成分，本发明提供的方法的准确率可达 100％。
实施例51
按照与实施例1相同的方法进行检测，区别在于，检测对象为猪肉 和牛肉的混合物，检测20次均无法检测出其含羊肉成分，本发明提供的 方法的准确率可达100％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域 的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干 改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
机译： 产品中鸡源成分与蛋源成分区别的检测方法
机译： 样品中牛源成分的检测方法
机译： 样品中鸡源成分的检测方法
