一种用于免疫治疗EBV相关疾病的抗原组合物、生物制剂及其制备方法

摘要

本发明提供了一种用于免疫治疗EBV相关疾病的抗原组合物、包括所述抗原组合物的生物制剂及其制备方法，该生物制剂可以是预防和治疗这类疾病的疫苗、药物或活细胞制剂。本发明提供的一种新的治疗鼻咽癌在内的EBV相关疾病的免疫培育EBV-CTLs的方法，该方法采用生物信息学方法，基于中国人群在HLA-A、B和DR位点等位基因表达特点，分析不同EBV病毒株，尤其包括中国广东来源的病毒株，三种蛋白EBNA-1、LMP1和LMP2中可能表位的存在序列，并制备包括这些序列在内的肽段组合作为抗原，结合特定细胞因子组合，使得培养得到的EBV-CTLs中含有数量和种类更多的抗原特异性T细胞，尤其适用于中国人群，该方法培养周期短、针对性强、对肿瘤细胞杀伤作用强。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于免疫治疗EBV相关疾病的抗原组合物、生物制剂及其制备方法，尤其涉及一种适合于中国人群鼻咽癌治疗的抗原组合物。还涉及包括所述抗原组合物的用于免疫治疗EBV相关疾病的生物制剂，该生物制剂可以是预防和治疗这类疾病的疫苗或药物。

背景技术

鼻咽癌是中国两广地区的特有疾病，与遗传、环境和生活习惯等有相关性，尤其与EBV(Epstein-Barr virus，EBV)关系密切。EBV为疱疹病毒科嗜淋巴病毒属的成员，为95％以上的成人所携带，与鼻咽癌的发生有密切关系，约在90％鼻咽癌样本中都能检测到EBV基因组存在，是Epstein和Barr于1964年首次成功地将Burkitt非洲儿童淋巴瘤细胞通过体外悬浮培养而建株，在建株细胞涂片中用电镜观察到疱疹病毒颗粒，故而得名。

中国南方(广东、广西)及东南亚是全球鼻咽癌高发区，发病率是低发地区的100倍。造成这种巨大差异的原因被认为可能与以下两个方面相关：人种遗传差异性和EB病毒株地区分布差异性。人类白细胞抗原(Human leukocyteantigen，HLA)，即人类主要组织相容性复合体(major histocompatiabilitycomplex，MHC)，是一组决定移植组织是否相容、与免疫应答密切相关、紧密连锁的基因群，是人体多态性最丰富的基因系统。不同HLA等位基因的表达频率在高加索人群和中国广东人群中存在着较大的差异。如在高加索人群中，HLA-A位点最常表达的等位基因为A2，而在广东人群中A11分子的表达频率约为50％，占绝对优势。这种差异使得高加索人群和中国广东人群在识别EBV抗原的最小单位—表位上，存在着相当大的差异。目前已经报道的EBV相关表位中，多数为A2、A24限制性。使得这些结果无法直接广泛应用于中国人群。另一方面，在广东及东南亚地区发现得许多EBV病毒株中，与欧美地区的优势病毒株B95-8相比较，在一些中国人优势HLA分子限制性表位序列中存在突变，使得免疫系统无法处理、提呈病毒抗原来引发针对EBV的免疫反应，从而使得这些病毒引起的感染和肿瘤无法被清除。

EBV在感染宿主细胞后，可以大规模复制新的病毒颗粒，也可以长期静息于记忆性B细胞中，也可以转化宿主细胞，因此形成了所谓不同的隐匿阶段，表达不同的抗原。在EBV阳性的鼻咽癌和何杰金淋巴瘤中，EBV处于所谓II型隐匿阶段，仅表达三种病毒抗原，分别为EBNA-1、LMP1和LMP2。如果能在体外筛选并扩增那些可以识别这三种抗原的特异性T淋巴细胞，即EBV-CTLs，将这些细胞输注给患者，恢复或提高患者原有针对EBV的细胞免疫反应，就可以在体内杀伤肿瘤细胞，达到治疗鼻咽癌的目的。

EBV-CTLs已经被试验性用于移植后淋巴细胞增殖性疾病，淋巴瘤和鼻咽癌的治疗。但目前所采用的培养方法，或者需要用EBV转化的自体淋巴细胞系作为刺激细胞，培养的时间长达数月，无法实现对患者的及时治疗；或者采用已经报道的表位进行选择性分离、刺激培养，由于目前已知的表位限定于少数高加索人群高频表达HLA分子限制性，使得多数中国人无法应用。

发明内容

本发明为解决现有技术中的上述问题提出的。

本发明提供了一种用于免疫治疗EBV相关疾病的抗原组合物。

本发明还提供了一种包括所述抗原组合物的用于免疫治疗EBV相关疾病的细胞类生物制剂及其制备方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一个方面是提供一种用于免疫治疗EBV相关疾病的抗原组合物，所述抗原组合物为不同EBV病毒株来源的三种蛋白EBNA-1、LMP1和LMP2中特定序列组成的肽段组合。

其中，所述肽段组合包括至少三条肽段，优选为3-90条肽段、更优选为89条肽段，所述单个肽段长度优选为15-25个氨基酸、更优选为20-25个氨基酸，相邻两肽段具有10-15个、更优选为10-12个连续氨基酸残基之间的重叠。

本发明的第二个方面是提供一种用于免疫治疗EBV相关疾病的生物制剂，所述生物制剂包括上述的抗原组合物。该生物制剂可以是预防和治疗这类疾病的疫苗、药物或活细胞制剂。

其中，所述EBV相关疾病包括鼻咽癌、慢性活动性EBV感染、嗜血细胞综合症、造血干细胞移植或器官移植后EBV感染、淋巴增殖性疾病、以及与EBV高度相关的淋巴瘤和胃癌等。

本发明的第三个方面是提供一种用于免疫治疗EBV相关疾病的生物制剂的制备方法，步骤包括：

步骤1，将免疫细胞与所述抗原在液态细胞培养基中共同培养，从而获得具有相应抗原特异性免疫细胞培养物；

步骤2，从步骤1中获得的培养物中分离并扩增培养具有抗原反应性细胞；

其中，所述的液态细胞培养基中，除免疫细胞和抗原外，还包括克隆抗体、细胞因子和免疫佐剂。

优选地，所述免疫细胞选自：异体细胞或自体细胞的任意一种，或不经基因改性的免疫细胞或基因改性的免疫细胞的任意一种，或抗原提呈细胞或淋巴细胞的任意一种。

优选地，所述免疫细胞选自：外围血单个核细胞、骨髓细胞、造血前趋细胞或干细胞的任意一种或多种、或它们的衍生细胞，更优选为外围血单个核细胞。

优选地，所述具有抗原反应性细胞选自：肿瘤浸润淋巴细胞、细胞毒T淋巴细胞和/或树突状细胞，更优选为CD3⁺T淋巴细胞，包括CD8⁺T和CD4⁺T淋巴细胞。

CD8⁺T和CD4⁺T淋巴细胞识别的抗原有很大不同，CD8⁺T细胞识别MHC I类分子提呈的8-10个氨基酸长度的表位，而CD4⁺T淋巴细胞则可以识别MHC II类分子提呈的15个氨基酸长度或更长的表位。CD8⁺T细胞被认为是抗肿瘤的主要效应细胞，通过释放穿孔素/颗粒酶直接杀伤肿瘤细胞，或通过死亡信号途径，诱导肿瘤细胞的凋亡。CD4⁺抗原特异性T细胞，被认为是CD8⁺T细胞抗肿瘤的重要组成成分，它主要通过旁分泌、自分泌的形式，辅助CD8⁺T细胞及其它的免疫细胞，如抗原提呈细胞，提高对肿瘤的免疫排斥作用达到治疗肿瘤的目的。采用供者来源EBV-CTL用于移植后淋巴增殖性疾病的临床试验中，提示CD4⁺T细胞比例高者，可以获得更好的临床反应。

本发明采用了不同细胞因子的组合，所述细胞因子选自GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、IL-15中的任意一种或多种，其中更优选了GM-CSF、IL-2、IL-7的组合，使得培养得到的EBV-CTLs中含有更多数量和种类的抗原反应性细胞。

本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明提供的一种新的治疗鼻咽癌在内的EBV相关疾病的免疫培育EBV-CTLs的方法，该方法采用生物信息学方法，基于中国人群在HLA-A、B和DR位点等位基因表达特点，分析不同EBV病毒株，尤其包括中国广东来源的病毒株，三种蛋白EBNA-1、LMP1和LMP2中可能表位的存在序列，并制备包括这些序列在内的肽段组合作为抗原，结合特定细胞因子组合，使得培养得到的EBV-CTLs中含有数量和种类更多的抗原特异性T细胞，尤其适用于中国人群，该方法培养周期短、针对性强、对肿瘤细胞杀伤作用强。

附图说明

图1为合成肽段位于LMP1、LMP2和EBNA1序列中的位置，其中灰色为原有蛋白序列，黑色为B98-8序列来源肽段，空白段为GD1和GD2序列来源肽段。

图2为不同细胞因子组合条件下，EBV-CTLs对抗原的反应性，其中黑色块代表未去贴壁细胞组，灰色块代表去贴壁细胞组。

图3为不同供者来源的EBV-CTLs对抗原肽段的反应性。

图4为A010来源EBV-CTLs对自体LCL的杀伤作用。

图5为本发明所述方法制备的EBV-CTLs同时包含抗原反应性CD4和CD8阳性细胞的分布图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

本发明的第一个方面是提供一种用于免疫治疗鼻咽癌在内的EBV相关疾病药物的制备方法，步骤包括：

步骤1，将免疫细胞与抗原在液态细胞培养基中共同培养，从而获得具有相应抗原特异性免疫细胞培养物；其中，所述抗原为不同EBV病毒株来源处于III型隐匿阶段所表达的三种蛋白EBNA-1、LMP1和LMP2中特定序列组成的肽段组合；

步骤2，从步骤1中获得的培养物中分离并扩增培养具有抗原反应性细胞；

其中，所述的液态细胞培养基中，除免疫细胞和抗原外，还包括细胞因子和免疫佐剂。

优选地，所述免疫细胞选自：异体细胞或自体细胞的任意一种，或不经基因改性的免疫细胞或基因改性的免疫细胞的任意一种，或抗原提呈细胞或淋巴细胞的任意一种。

优选地，所述免疫细胞选自外围血单个核细胞。

其中，所述肽段组合包括至少三条肽段，优选为3-90条肽段，所述单个肽段长度优选为15-25个氨基酸、更优选为20-25个氨基酸，相邻两肽段具有10-15个、更优选为10-12个连续氨基酸残基之间的重叠。

所述具有抗原反应性细胞优选为CD3⁺T淋巴细胞，包括CD8⁺T和CD4⁺T淋巴细胞。

所述细胞因子选自GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、IL-15中的任意一种或多种，其中更优选了GM-CSF、IL-2、IL-7的组合。

1、抗原的设计与合成：

本发明以中国人与高加索人HLA分子表达差异为出发点，分别找出中国人在HLA-A、B和DR三个基因座中优势表达的5-7个等位基因，这些等位基因的表达频率之和，超过了该位点所有等位基因表达频率总和的80％以上(请见下表1)。这些等位基因代表了绝大多数人的表达情况。随后以此为基础，采用生物信息学方法，预测这些等位基因限制条件下，来源于B95-8、GD1和GD2三种病毒株中EBNA-1、LMP1和LMP2三种抗原中可能存在的表位。其中，GD1和GD2都是近年来自于广东地区分离测序得到的病毒株，最能反映当地流行的病毒株基因特征。最后，合成一系列重叠肽段，这些肽段长度在20个氨基酸左右，相邻两个肽段的重叠部分为10-12个氨基酸，覆盖所有预测表位分布区域，共需合成肽段LMP1 27段、LMP2 41段、以及EBNA1 21段(请见图1)。

表1 中国人HLA-A、B、DR位点优势等位基因

HLA-AHLA-BHLA-DRB111014001090124024601150102015801070133031301120102071302080315020301

2、EBV-CTLs的刺激与培养：

本发明用20个左右氨基酸长度的肽段作为抗原培养得到的EBV-CTL，可以同时刺激得到抗原特异性CD8⁺T和CD4⁺T淋巴细胞(请见图5)。

本发明采用了GM-CSF、IL-2与IL-7组合的细胞因子，使得培养得到的EBV-CTLs中含有更多的抗原反应性细胞(请见图2)。

本发明获取的免疫细胞为健康人外周血单个核细胞，培养得到抗原反应性EBV-CTLs，而且每名供者来源的EBV-CTLs对不同肽段的反应性均有所不同，表明了本发明提供的方法具有很高的可重复性以及适应性(请见图3)。

本发明培养得到的EBV-CTLs在与荷载抗原的靶细胞、如自体LCL相遇后，可有效杀伤靶细胞，请见图4。

3、实验方法：

1)实验材料及仪器：

EX VIVO 15培养基；

IL-7，用含0.1HAS PBS配置为10μg/ml，-20℃保存；

注射用人重组IL-2，用PBS配置为100000U/ml，-20℃保存；

注射用重组人GM-CSF，用PBS配置为100000U/ml，-20℃保存；

PBS，不含钙、镁离子，细胞培养级；

EBNA-1、LMP1和LMP2来源，20aa重叠肽段，用DMSO溶解配置为1mM，-20℃保存；

Ficoll plus；

DMSO；

Human IFN-γELISA KIT 96T；

BD Cytofix/Cytoperm^TMPlus Fixation/Permeabilization Kit(用含有莫能菌素的蛋白转运抑制剂BD GolgStop^TM)；

生理盐水；

PMA，1mg/vial，用DMSO配置为10μg/ml，-20℃保存；

离子霉素，1mg/vial，用DMSO配置为250μg/ml，-20℃保存；

CD3-pc7标记单克隆抗体；

CD4-pc5标记单克隆抗体；

CD8-FITC标记单克隆抗体；

IFN-γ-PE标记单抗体；

100μm以及40μm孔径滤网；

15ml以及50ml离心管；

5ml移液管；

96孔U形底细胞培养板；

24孔细胞培养板；

5-50μl和50-300μl多道移液器；

1.5或0.5ml离心管；

X-12R离心机；

流式细胞仪；

计数板；

显微镜。

2)实验步骤及方法：

A.从外周血中分离获得单个核细胞：

a)将患者全血用肝素抗凝，加载到Ficoll表面，通常采用15ml锥底离心管，在其中预先加入Ficoll 5ml，将10ml全血缓慢加载到其表面；

b)900g离心20min，缓慢减速；

c)用移液管吸取白膜细胞层，将其用PBS洗涤两次，并用细胞筛网去除其中的细胞团块，计数。

B.抗原刺激培养：

a)按肽来源不同和其水溶性特征，将所有肽段分成16组，部分肽段可完全溶于水，部分肽段仅溶于100％DMSO，其余肽段分别溶于不同配比的水：DMSO溶液中，每种肽段的浓度均为2mM；采用这种方法的目的在于减少培养体系中DMSO的含量，1％以上的DMSO被认为对细胞生长具有不利影响；

b)用培养基将细胞密度调整为1*10⁷/ml，以1：1000体积比加入重叠肽混合物，充分吹打混匀后，37℃下孵育30min；

c)用PBS洗涤两次，用培养基将细胞密度调整为1*10⁷/ml，加入GM-CSF至终浓度为100ng/ml，混匀后接种入96孔U底板中，每孔200μl，培养48小时；

d)每孔吸弃90μl上清，加入含IL-2100U/ml、IL-720ng/ml的培养基100μl，继续培养48小时；

e)每孔吸弃90μl上清，加入含IL-2100U/ml、IL-720ng/ml的培养基100μl，继续培养48小时。

C.EBV-CTLs特异性检测：

a)分别取细胞悬液200μl，加入三支细胞培养管中，补充培养基至1ml，其中一管加入EBV肽混合物，一管加入PMA 1μl，离子霉素1μl作为阳性对照，另一管加入DMSO作为阴性对照，再在每管加入Golgstop(莫能菌素)0.7μl，在37℃下、5％CO₂条件下培养4小时；

b)离心，弃上清，用PBS洗涤细胞一次，弃上清后，用残留少量液体悬浮细胞，加入PC5-CD4、PC7-CD3、FITC-CD8，2-8℃下孵育30min；

c)用PBS洗涤细胞一次，完全吸弃上清，振荡悬浮细胞，每管加入250μl破膜固定液，2-8℃下避光孵育30min；

d)每管加入1ml破膜洗涤液洗涤细胞一次，离心，弃上清后每管加入相应量的PE-IFN-γ，再次2-8℃下避光孵育30min；

e)1*破膜洗涤液洗涤细胞两次后，用250μl破膜洗涤液重悬细胞，上机检测CD3⁺IFN-γ⁺细胞，以及CD4⁺IFN-γ⁺和CD8⁺IFN-γ⁺占总细胞比例。

D.扩增培养：

a)如检测到CD3⁺IFN-γ⁺细胞，启动快速扩增程序；

b)将EBV-CTLs用培养基将细胞密度调节为2*10⁶/ml，转入25/75cm²细胞培养瓶中；

c)在培养基中加入IL-2至终浓度为500U/ml，加入混合肽至0.1μM，培养7天，每两至三天补充IL-2，直至细胞数量达到所需要求。

E.质量检测：

a)取部分扩增细胞，离心，弃上清，洗涤一次，用不含细胞因子的培养基培养24小时，离心、弃上清，取适量细胞按步骤C方法，检测抗原特异性细胞比例；

b)取适量细胞将细胞密度调节为1*10⁶/ml，接种入96孔平底培养板中，每孔100μl，用培养基1：500分别稀释单个肽段，对应接种入细胞中，每孔100μl，空白对照加入100μl培养基，培养18-24小时，按相应IFN-γELISA检测试剂盒说明，检测样品中IFN-γ的含量，分析EBV-CTLs可能表位所在的位置；

c)按国家药典相关方法检测产品微生物限度；

d)按国家药典相关方法检测产品内霉素含量；

e)确定最终产品的细胞数量及细胞活率。

本发明提供的一种新的治疗鼻咽癌在内的EBV相关疾病的免疫培育EBV-CTLs的方法，该方法采用生物信息学方法，基于中国人群在HLA-A、B和DR位点等位基因表达特点，分析不同EBV病毒株，尤其包括中国广东来源的病毒株，三种蛋白EBNA-1、LMP1和LMP2中可能表位的存在序列，并制备包括这些序列在内的肽段组合作为抗原，结合特定细胞因子组合，使得培养得到的EBV-CTLs中含有数量和种类更多的抗原特异性T细胞，尤其适用于中国人群，该方法培养周期短、针对性强、对肿瘤细胞杀伤作用强。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。