一种增强肿瘤细胞对抗肿瘤药物敏感性的多肽及其应用

摘要

本发明公开了一种增强肿瘤细胞对抗肿瘤药物敏感性的多肽及其应用。具体而言，公开了一种用于增强肿瘤细胞对抗肿瘤药物敏感性及抑制肿瘤细胞迁移的多肽，及与该多肽相关的融合蛋白、复合体、核酸序列、核酸载体、宿主细胞和药物组合物。本发明还提供该多肽在制备用于增强肿瘤细胞对抗肿瘤药物敏感性及抑制肿瘤细胞迁移的药物中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种增强肿瘤细胞对抗肿瘤药物 敏感性的多肽及其应用。

背景技术

趋化因子是细胞因子超家族成员中一大类具有化学趋化作用的小分子蛋白 质，其中，趋化因子CXCL12及其位于多种肿瘤细胞膜表面上的受体CXCR4 的相互作用对肿瘤的发展、侵袭和转移具有重要作用（Fukuda S.,Broxmeyer H.E. and Pelus L.M.,Blood,2005,105,3117-3126）。通过干扰CXCR4与CXCL12的 相互作用，从而抑制肿瘤细胞在体内的侵袭转移及其抗药性，为肿瘤疾病的治 疗提供了可能途径（Burger J.A.and Peled A.,Leukemia,2009,23,43-52）。

白血病是造血组织的恶性疾病，由于化疗后体内抗药性白血病细胞的残留 以及白血病细胞在体内的侵袭转移，完全彻底地治愈白血病仍面临着巨大挑战 （Gerard C.and Rollins B.J.,Nat.Immunol.,2001,2,108-115），发展新型药物和 治疗方法是提高白血病治愈率的重要目标。

发明内容

本发明人经过大量实验和创造性劳动，得到了一组多肽，并发现这组多肽 具有增强肿瘤细胞对抗肿瘤药物敏感性及抑制肿瘤细胞迁移的能力，具有作为 治疗或辅助性治疗肿瘤（尤其是白血病和乳腺癌）的药物的潜力。

本发明提供以下技术方案：

在第一方面，本发明提供一种用于增强肿瘤细胞对抗肿瘤药物敏感性及抑 制肿瘤细胞迁移的多肽，所述多肽具有选自SEQ ID NO：1～4所示的氨基酸序 列：

（1）GGFDRRNANFNDI（SEQ ID NO：1），

（2）GGYDLDLSVARL（SEQ ID NO：2），

（3）GGQGCRFRNTVDDWISITRAL（SEQ ID NO：3），和

（4）GGTRALAFFDC（SEQ ID NO：4）。

所述多肽可以通过人工化学合成制得。

在第二方面，本发明提供一种包含第一方面所述的多肽的融合蛋白。

在第三方面，本发明提供一种第一方面所述的多肽与大分子载体偶联而得 到的复合物。所述大分子载体有例如牛血清白蛋白、人血清白蛋白、钥孔血白 蛋白、牛甲状腺球蛋白及其他γ球蛋白等蛋白类载体。所述偶联可以是戊二醛 法、MBS法、碳二亚胺法、卤代硝基苯法及活泼酯法等。

在第四方面，本发明提供一种编码第一方面所述的多肽的核酸序列。

在第五方面，本发明提供一种包含第四方面所述的核酸序列的核酸载体。

在第六方面，本发明提供一种包含第五方面所述的核酸载体的宿主细胞。 比如可以是所述核酸载体转化的宿主细胞，典型但非限定性的实例，如微生物 宿主细胞如大肠杆菌宿主细胞等。

在第七方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含第一方面 所述的多肽或第二方面所述的融合蛋白或第三方面所述的复合物或第四方面所 述的核酸序列或第五方面所述的核酸载体或第六方面所述的宿主细胞。

在第八方面，本发明提供一种第一方面所述的多肽或第二方面所述的融合 蛋白或第三方面所述的复合物或第四方面所述的核酸序列或第五方面所述的核 酸载体或第六方面所述的宿主细胞或第七方面所述的药物组合物在制备用于增 强肿瘤细胞对抗肿瘤药物敏感性及抑制肿瘤细胞迁移的药物中的应用。优选地， 所述肿瘤细胞为白血病细胞和/或乳腺癌细胞。

本发明还提供治疗或辅助性治疗肿瘤（尤其是白血病和乳腺癌）的方法， 包括给予人或者动物有效量的第一方面所述的多肽或第二方面所述的融合蛋白 或第三方面所述的复合物或第四方面所述的核酸序列或第五方面所述的核酸载 体或第六方面所述的宿主细胞或第七方面所述的药物组合物。

本发明的有益效果为：本发明所述的多肽具有增强肿瘤细胞对抗肿瘤药物 敏感性及抑制肿瘤细胞迁移的能力，可以用作治疗或辅助性治疗肿瘤（尤其是 白血病和乳腺癌）的药物。

附图说明

图1为C1～C4多肽分子在含1%DMSO的1×PBS溶液中的光散射实验结果 图，其中表示阴性对照PBS的信号强度曲线；表示C1多肽溶液的 信号强度曲线；表示C2多肽溶液的信号强度曲线；表示C3多肽溶 液的信号强度曲线；表示C4多肽溶液的信号强度曲线。

图2为流式细胞术中C1～C4多肽分子对K562细胞的染色率结果图，其中： （a）为只用FITC-SA标记的K562细胞，（b）C1和FITC-SA标记的K562细胞， （c）C2和FITC-SA标记的K562细胞，（d）C3和FITC-SA标记的K562细胞， （e）C4和FITC-SA标记的K562细胞。10^∧0表示所检测的细胞产生的荧光信 号相对强度为10^∧0（即10⁰），其余类似。

图3为C1～C4多肽分子对K562细胞活力的影响结果图，其中：阴性对照 为不加多肽分子的K562细胞，其余各组加入10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、 250ng/mL、500ng/mL、1μg/mL的C1～C4多肽。

图4为C1～C4多肽分子对环磷酰胺（Cyclophosphamide,CPA）增敏杀伤 K562细胞的影响结果图，其中：（a）10ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1μg/mL 的C1多肽分子对0mM、5mM、10mM的CPA的增敏作用；（b）10ng/mL、 100ng/mL、500ng/mL、1μg/mL的C2多肽分子对0mM、5mM、10mM的CPA 的增敏作用；（c）10ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1μg/mL的C3多肽分子 对0mM、5mM、10mM的CPA的增敏作用；（d）10ng/mL、100ng/mL、500 ng/mL、1μg/mL的C4多肽分子对0mM、5mM、10mM的CPA的增敏作用。

图5为10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1μg/mL 的C2多肽分子对0mM、6mM的CPA的增敏作用的结果图。

图6为C3多肽分子与HL-60细胞的亲和力结果图，其中对照为只加入 FITC-SA的细胞组。

图7为C1～C4多肽分子对HL-60细胞的亲和力ELISA方法的结果图，其中 空白对照为不含多肽分子的PBS对照组。

图8为C1～C4多肽分子对HL-60细胞活力的影响结果图，其中：阴性对照 为不加多肽分子的HL-60细胞，其余各组加入10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、 500ng/mL、1μg/mL的C1～C4多肽。

图9为C1、C3多肽分子对HL-60细胞凋亡的影响的结果图，其中对照为 只加培养基溶液而不加C1或C3多肽分子的阴性对照，其余各组分别加入 100nM、1μM、10μM的C1或C3多肽分子。

图10为C1～C4多肽分子对CXCL12分子诱导HL-60细胞迁移的抑制作用 的结果图，其中对照为在没有加入趋化因子CXCL12时，HL-60细胞的迁移率； CXCL12为加入趋化因子CXCL12时，HL-60细胞的迁移率；其余各组为加入 C1～C4多肽分子后，HL-60细胞的迁移率。

图11为C3多肽分子对MS-5细胞诱导HL-60细胞迁移的抑制作用的结果 图。

图12为C3多肽分子对MS-5细胞诱导HL-60细胞粘附到MS-5上的抑制作 用的结果图。

图13为激光共聚焦显微镜(放大1000倍)拍摄到的C3多肽分子对CXCL12 分子诱导HL-60细胞骨架蛋白组装的抑制作用的结果图。

图14为C3多肽分子在HL-60细胞上对CXCL12分子诱导的信号通路的抑 制作用的电泳结果图，其中1、2、3、4分别表示4个平行的泳道，p38表示p38 蛋白，P-p38表示磷酸化p38蛋白，Erk表示Erk蛋白，P-Erk表示磷酸化Erk 蛋白，“+”表示加入相应物质（CXCL12或C3），“-”表示不加相应物质（CXCL12 或C3）。

图15为C3多肽分子对10-羟基喜树碱（Cam）杀伤HL-60细胞的影响的结 果图，其中对照表示不作处理，C3表示C3多肽处理，10-羟基喜树碱表示10- 羟基喜树碱处理，10-羟基喜树碱+C3表示先用C3多肽处理再用10-羟基喜树碱 处理。

图16为C3多肽分子对肿瘤相关细胞NB4细胞的亲和力结果图，其中对照 为只加入FITC-SA的细胞组。

图17为C3多肽分子对CXCL12分子诱导NB4细胞迁移的抑制作用的结果 图。

图18为C3多肽分子对MS-5细胞诱导NB4细胞迁移的抑制作用的结果图。

图19为C3多肽分子对MS-5细胞诱导NB4细胞粘附到MS-5上的抑制作 用的结果图。

图20为C3多肽分子对10-羟基喜树碱（Cam）杀伤NB4细胞的影响的结 果图，其中对照表示不作处理，C3表示C3多肽处理，10-羟基喜树碱表示10- 羟基喜树碱处理，10-羟基喜树碱+C3表示先用C3多肽处理再用10-羟基喜树碱 处理。

图21为C3多肽分子对肿瘤相关细胞THP-1细胞的亲和力结果图，其中对 照为只加入FITC-SA的细胞组。

图22为C3多肽分子对CXCL12分子诱导THP-1细胞迁移的抑制作用的结 果图。

图23为C3多肽分子对MS-5细胞诱导THP-1细胞迁移的抑制作用的结果 图。

图24为C3多肽分子对MS-5细胞诱导THP-1细胞粘附到MS-5上的抑制 作用的结果图。

图25激光共聚焦显微镜(放大1000倍)拍摄到的C3多肽分子对CXCL12分 子诱导THP-1细胞骨架蛋白组装的抑制作用的结果图。

图26为C3多肽分子对U937细胞的亲和力结果图，其中对照为只加入 FITC-SA的细胞组。

图27为C3多肽分子对CXCL12分子诱导U937细胞迁移的抑制作用的结 果图。

图28为C3多肽分子对MS-5细胞诱导U937细胞迁移的抑制作用的结果图。

图29为C3多肽分子对MS-5细胞诱导U937细胞粘附到MS-5上的抑制作 用的结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将 会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实 施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件， 或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过 市购获得的常规产品。

实施例1：多肽的合成

按照表1所示的序列合成多肽，实验中按照需要稀释成合适的浓度。

表1  合成的多肽

名称 序列 C1 Biotin-GGFDRRNANFNDI C2 Biotin-GGYDLDLSVARL C3 Biotin-GGQGCRFRNTVDDWISITRAL C4 Biotin-GGTRALAFFDC

其中，C1～C4多肽的氨基酸序列分别对应于发明内容中SEQ ID NO：1～4。 生物素（Biotin）的作用是在酶联免疫反应中与链霉亲和素（SA）结合，属于常 用的技术手段，对本发明多肽的作用没有实质性影响。

实施例2：多肽分子在溶液中的聚集状态及稳定性实验

1×PBS溶液的配制：称取0.4g NaCl，0.01g KCl，182mg Na₂HPO₄·12H₂O， 12mg KH₂PO₄，0.01g NaN₃，使用50ml二次水溶解，用0.22μm水相滤膜过滤， 待用。

将C1～C4多肽分子配成30μM的含1%DMSO的1×PBS溶液。将配制好 的多肽溶液置于120r/min，37℃恒温的摇床中，保持36小时。以含1%DMSO 的1×PBS溶液作为阴性对照。

自样品配制完成时刻起，每隔4小时，从测试溶液中取出400μL样品溶液， 加到1cm×1cm的石英比色皿中。在荧光分光光度计（SL55）中，以405nm作 为激发波长，收集405nm的发射光信号。狭缝宽为1.0nm，1.0nm。静态光散 射反映溶液中的多肽分子随时间的聚集状态的变化。如图1所示，随时间的延 长，由于受到液体环境机械性剪切作用的影响，C1～C4多肽分子会从具有一定 聚集尺寸的状态向单分散状态转变。从第4个小时起，多肽分子的聚集状态保 持稳定，实验结果中表现为强度（a.u.）趋于稳定。

实施例3：多肽分子对白血病相关细胞K562细胞的亲和力实验

以K562细胞作为研究白血病细胞的模型。在ELISA实验中，将50万个已 固定的K562细胞铺到96孔培养板中，待干燥后将含有100nM多肽分子的PBS 加入各孔中37℃下与细胞孵育，3h后移除非特异性吸附的多肽后，再向其中加 入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（HRP-SA）孵育，之后加入辣根过氧化物 酶的底物反应，使用多功能酶标仪测定其在490nm处的吸收值。

在流式细胞分析实验中，将50万个已固定的K562细胞铺到96孔培养板 中，待干燥后将含有100nM多肽的PBS加入各孔中37℃下与细胞孵育，3小时 后移除非特异性吸附的多肽后，检测细胞与带有荧光基团的多肽分子结合的比 例。激发波长490nm，检测发射波长525nm。如图2所示，C1～C4多肽分子均 可以标记K562细胞（荧光染色率大于阴性对照四倍）。其中，C3多肽对K562 细胞的亲和力最强，为65.30%。

实施例4：多肽分子对K562细胞活力的影响实验

以K562作为研究白血病细胞的模型体系。在Conning96孔板中，每孔培 养4万个细胞，使用RPMI-1640培养基（含10%北美小牛血清，1‰链青霉素）。 将10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1μg/mL的C1～C4 多肽与K562细胞共同孵育72小时。在孵育后的第72小时吸走培养板中上层培 养基，将新鲜培养基与MTS（单溶液细胞增殖检测试剂盒）溶液按照5:1混合， 每孔加入120ul混合液在37℃下反应1.5h。在连续光谱多功能酶标仪（Tecan  infinite M200）中，测定其在490nm处的吸光度值。

如图3所示，向K562细胞中加入10ng/mL～1μg/mL的C1～C4多肽分子， 其细胞存活率与单独的K562细胞相比，没有显著性差异，且加入多肽后的细胞 存活率与所加的多肽量之间没有线性关系。即C1～C4多肽基本不会影响K562 细胞存活率。

实施例5：多肽分子对CPA杀伤K562细胞的影响实验

以K562作为研究白血病细胞的模型体系。在Conning96孔板中，每孔培养 4万个细胞，使用RPMI-1640培养基（含10%北美小牛血清，1‰链青霉素）。 将10ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1μg/mL的C1～C4多肽分子与K562细胞共 同孵育24小时。向多肽及K562细胞的混合体系加入CPA，使CPA的最终浓度 分别为5mM、10mM。再过48小时后，吸走培养板中上层培养基，将新鲜培养 基与MTS溶液按照5:1混合，每孔加入120μL混合液在37℃下反应1.5h。在连 续光谱多功能酶标仪（Tecan infinite M200）中，测定其在490nm处的吸光度 值。

如图4a～图4d所示，C1～C4多肽均可不同程度上增加CPA对K562细胞的 杀伤作用，增加K562的药敏性。其中C1、C2、C4多肽在100ng/mL浓度下可 以显著增强CPA对细胞的杀伤作用。C3多肽在1μg/mL的浓度下，可以对10m  M的CPA一定程度上增加其杀伤作用。

在Conning96孔板中，每孔培养4万个细胞，使用RPMI-1640培养基（含 10%北美小牛血清，1‰链青霉素）。将10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/ mL、500ng/mL、1μg/mL的C2多肽与K562细胞共同孵育24小时。向多肽及K 562细胞的混合体系加入CPA，使CPA的最终浓度为6mM。经过48小时后， 吸走培养板中上层培养基，将新鲜培养基与MTS溶液按照5:1混合，每孔加入 120μL混合液在37℃下反应1.5h。在连续光谱多功能酶标仪（Tecan infinite M2 00）中，测定其在490nm处的吸光度值。

如图5所示，当C2多肽浓度为500ng/mL时（CPA浓度为6mM），能显著 增加CPA的杀伤效果（P=0.0034）。

即C1～C4多肽分子可以有效地增加白血病细胞的药物敏感性。

实施例6：多肽分子对HL-60细胞的亲和力-流式细胞分析方法实验

以HL-60细胞作为研究白血病细胞的模型。将含50万个HL-60细胞1% DMSO的无血清培养基种到24孔培养板中,加入终浓度为10μM的C3多肽分子 一起孵育4h。收集细胞后用PBS清洗两遍，之后在5μg/ml的FITC-SA溶液中 4℃孵育0.5h。用PBS清洗两遍，以100目细胞滤网过筛。只加入FITC-SA的 细胞组作为阴性对照。在流式细胞分析仪中，检测细胞被标记比例。

如图6所示，多肽分子与HL-60细胞有高结合力。

实施例7：多肽分子对肿瘤相关细胞HL-60细胞的亲和力-ELISA方法实验

以HL-60细胞作为研究白血病细胞的模型。将50万个已固定的HL-60细胞 铺到96孔培养板中，待贴壁后将含有100nM多肽的PBS加入各孔中37℃下与 细胞孵育，3h后移除非特异性吸附的多肽后，再向其中加入辣根过氧化物酶标 记的链霉亲和素（HRP-SA）孵育，之后加入辣根过氧化物酶的底物反应，使用 多功能酶标仪测定其在490nm处的吸收值。

如图7所示，C1～C4多肽分子均与HL-60细胞有不同程度的结合。

实施例8：多肽分子对肿瘤相关细胞HL-60细胞活力的影响实验

以HL-60作为研究白血病细胞的模型体系。在Conning96孔板中，每孔培 养10万个细胞，使用RPMI-1640培养基（含10%北美小牛血清，1‰链青霉素）。 将0ng/mL，10ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，500ng/mL,1μg/mL的C1～C4多肽 与HL-60细胞共同孵育24、48、72小时。在孵育后的第24、48、72小时，吸 走培养板中上层培养基，将新鲜培养基与MTS溶液按照5:1混合，每孔加入 120μL混合液在37℃下反应1.5小时。在连续光谱多功能酶标仪（Tecan infinite  M200）中，测定其在490nm处的吸光度值。

如图8所示，向HL-60细胞中加入10ng/mL～1μg/mL的C1～C4多肽，其细 胞存活率与单独的HL-60细胞相比，没有显著性差异，且加入多肽后的细胞存 活率与所加的多肽量之间没有线性关系。即C1～C4多肽基本不会影响HL-60细 胞活力与增殖能力。

实施例9：多肽分子对HL-60细胞凋亡的影响实验

以HL-60细胞作为研究白血病细胞的模型。HL-60细胞接种在24孔板中， 每孔50万个，往孔板中加入100nM～10μM的C1或C3多肽溶液，对照组加入 相同体积的培养基溶液，孵育24h。之后细胞用PBS洗两遍，并用结合缓冲液(1 0mM Hepes/NaOH,pH7.4,140mM NaCl,2.5mMCaCl)重悬，FITC-Annexin V溶 液染色3分钟后，加入碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)溶液一起避光染色10分 钟，用流式细胞仪进行检测分析。

如图9所示，经100nM～10μM的C1或C3多肽处理的HL-60细胞，其凋 亡率与未处理的细胞相比，没有显著性差异。即C1和C3多肽基本不会诱导H  L-60细胞的凋亡。

实施例10：多肽分子对CXCL12分子诱导HL-60细胞迁移的抑制作用实验

以HL-60细胞作为研究白血病细胞的模型。HL-60细胞与浓度为200ng/mL  C1～C4多肽在无血清培养基溶液中一起孵育1h后，加到上室中，每室15万个 细胞，下室为200ng/ml的CXCL12溶液。迁移24h后收集下室细胞溶液，离心 后计数并统计结果。进一步将HL-60细胞与浓度范围为0.1～10μM的C3溶液处 理后，检测细胞的迁移率。

如图10所示，在没有加入趋化因子CXCL12时（对照实验组），HL-60细 胞的迁移率较低。下室加入CXCL12后，细胞表现出很强的向下室迁移的能力。 在上室中加入200ng/mL的C1～C4多肽分子与细胞孵育后，HL-60细胞的迁移 能力被依次降低了40%、38%、36%、17%。即C1～C4多肽分子可以有效地抑 制肿瘤细胞被趋化因子诱导的转移迁移作用。而且迁移率的降低与多肽的浓度 成正比，当C3多肽浓度分别为0.1μM、1μM、10μM时，相对于CXCL12组， HL-60细胞的迁移率分别为65±9.7%，61±3.6%，36±5.7%。

实施例11：多肽分子对MS-5细胞诱导HL-60细胞迁移的抑制作用实验

以HL-60细胞作为研究白血病细胞的模型。HL-60细胞用钙黄绿素染色10 分钟后，用培养基溶液洗一遍，之后与10μM C3多肽在无血清培养基溶液中孵 育1小时，加到小室中，每室15万个细胞，下室为用8μg/ml的丝裂霉素处理2 小时后静置过夜的MS-5细胞，每孔10万个。孵育6小时后收集下室细胞溶液， 离心后在激发光488nm、吸收光514nm处检测细胞溶液的荧光值。

如图11所示，与对照相比，MS-5细胞会诱导更多的HL-60细胞迁移至下 室，而C3多肽预处理的HL-60细胞对MS-5的响应能力显著降低，细胞迁移率 降至74±9.0%。

实施例12：多肽分子对MS-5细胞诱导HL-60细胞粘附到MS-5上的抑制 作用实验

以HL-60细胞作为研究白血病细胞的模型。24孔板中每孔预先接种10万 个MS-5细胞，静置过夜。HL-60细胞用钙黄绿素染色10分钟后与0.1-10μM的 C3多肽溶液在无血清培养基中孵育2小时，以每孔50万细胞数目加到铺有MS-5 细胞的24孔板中。孵育1小时后收集上清液中未粘附的细胞，离心浓缩后在激 发光488nm、吸收光514nm处检测细胞溶液的荧光值并计算得出粘附率。而粘 附到MS-5细胞上的HL-60细胞在荧光显微镜下拍照。

结果如图12所示，与对照相比，经C3多肽预处理的HL-60细胞对基质细 胞的粘附能力明显减小，且随多肽浓度的增加，粘附率逐渐降低。当多肽浓度 为0.1μM、1μM、10μM时，HL-60细胞的粘附率分别为0.78±0.16，0.69±0.15， 0.64±0.21。

实施例13：多肽分子对CXCL12分子诱导HL-60细胞骨架蛋白组装的抑制 作用实验

以HL-60细胞作为研究白血病细胞的模型。将50万个HL-60细胞经10μM 的C3多肽处理1h后，与200ng/ml的CXCL12在37℃孵育1h；收集HL-60细 胞，将细胞用2%多聚甲醛在37℃固定30min，PBS清洗两遍后用0.5%Triton  X-100/PBS透膜5min，PBS洗两遍后用1%BSA/PBS封闭5min，晾干后用2μg/ml 的罗丹明标记的鬼笔环肽溶液在37℃处理40min，之后用0.5%Tween20/PBS清 洗3遍。最后用激光共聚焦显微镜观察细胞的微丝骨架结构。

如图13所示，HL-60细胞经CXCL12活化后微丝更多集中于细胞膜上，细 胞质在微丝的作用下相对凝集，而先经C3多肽处理的细胞在CXCL12作用下微 丝多在细胞核周围，细胞质中的微丝相对松散，呈弥散状态。

实施例14：多肽分子在HL-60细胞上对CXCL12分子诱导的信号通路的抑 制作用实验

以HL-60细胞作为研究白血病细胞的模型。HL-60细胞用无血清培养基重 悬后加入到24孔板中，每孔50万个细胞。孵育0.5h后加入终浓度为10μM C3 多肽溶液孵育1h，对照组加入相同体积的DMSO。之后往孔中加入200ng/ml 的CXCL12，孵育1h后用冷PBS终止反应并收集细胞。用含1mM PMSF和磷 酸酶抑制剂混合剂的RIPA裂解液在4℃裂解细胞团30min。之后4℃， 15000rpm/min，10min离心裂解好的细胞液，取上清液后用BCA法检测蛋白浓 度。往上样孔中加入30μg蛋白，经12%聚丙烯酰胺电泳分离并转移到0.45μm 的PVDF膜上，1%脱脂牛奶封闭后先后与特异性的一抗和HRP标记的二抗孵育 后，显色观察并分析结果。

结果如图14所示，CXCL12能提高细胞的P38和ERK磷酸化水平，而拮 抗多肽能抑制CXCL12的这种激活通路的效应，而且拮抗多肽能在一定程度上 降低细胞自身的P38和ERK的磷酸化水平，证实了拮抗多肽对CXCR4/CXCL12 轴的阻断作用。

实施例15：多肽分子对10-羟基喜树碱（Cam）杀伤HL-60细胞的影响实 验

以HL-60细胞作为研究白血病细胞的模型。15万个小鼠骨髓基质细胞MS- 5种到24孔板中，过夜贴壁。往96孔板中种入用无血清培养基重悬的50万个 HL-60细胞，之后加入的终浓度为10μM的含1%DMSO的C3多肽分子一起孵 育1h。将96孔板里的细胞转移到种有MS-5细胞的24孔板或只含相同体积培 养基的24孔板中，板中事先加入终浓度为10μM的含1%DMSO的C3多肽分子， 孵育4h后加入50nM的10-羟基喜树碱（Cam），24h后收集24孔板里的HL-60 细胞，PBS清洗两遍后用结合缓冲液(10mM Hepes/NaOH，pH7.4，140mM Na  Cl，2.5mM CaCl₂)重悬，FITC-Annexin V溶液避光染色3min后，加入PI溶液 一起染色10min，用流式细胞仪进行检测分析。

如图15所示，MS-5细胞能在一定程度上保护HL-60细胞免受10-羟基喜 树碱的杀伤作用，并提高HL-60细胞的存活。而经C3多肽预处理之后，在一定 程度上降低了MS-5细胞对HL-60细胞的保护作用，从而提高10-羟基喜树碱的 敏感度。

实施例16：多肽分子对肿瘤相关细胞NB4细胞的亲和力实验

以NB4细胞作为研究白血病细胞的模型。将含50万个NB4细胞1%DMS  O的无血清培养基种到24孔培养板中,加入终浓度为10μM的C3多肽分子一起 孵育4h。收集细胞后用PBS清洗两遍，之后在5μg/ml的FITC-SA溶液中4℃ 孵育0.5h。用PBS清洗两遍，以100目细胞滤网过筛。只加入FITC-SA的细胞 组作为阴性对照。在流式细胞分析仪中，检测细胞被标记比例。

如图16所示，多肽分子与NB4细胞有高结合力。

实施例17：多肽分子对CXCL12分子诱导NB4细胞迁移的抑制作用实验

以NB4细胞作为研究白血病细胞的模型。NB4细胞与浓度为0.1～10μM的 C3多肽溶液在无血清培养基溶液中一起孵育1h后，加到上室中，每室15万个 细胞，下室为200ng/ml的CXCL12溶液。迁移24h后收集下室细胞溶液，离心 后计数并统计结果。

如图17所示，在没有加入趋化因子CXCL12时，NB4细胞的迁移率较低。 下室加入CXCL12后，细胞表现出较强的向下室迁移的能力。当C3多肽浓度分 别为0.1μM、1μM、10μM时，相对于CXCL12组，NB4细胞的迁移率分别为 76±8.8%,57±18.5%，41±11.1%。

实施例18：多肽分子对MS-5细胞诱导NB4细胞迁移的抑制作用实验

以NB4细胞作为研究白血病细胞的模型。NB4细胞用钙黄绿素染色10min 后，用培养基溶液洗一遍，之后与10μM C3多肽在无血清培养基溶液中孵育1h， 加到小室中，每室15万个细胞，下室为用8μg/ml的丝裂霉素处理2h后静置过 夜的MS-5细胞，每孔10万个。孵育6h后收集下室细胞溶液，离心后在激发 光488nm、吸收光514nm处检测细胞溶液的荧光值。

如图18所示，与对照相比，MS-5细胞会诱导更多的NB4细胞迁移至下室， 而C3多肽预处理的NB4细胞对MS-5的响应能力显著降低，细胞迁移率降至 68±6.1%。

实施例19：多肽分子对MS-5细胞诱导NB4细胞粘附到MS-5上的抑制作 用实验

以NB4细胞作为研究白血病细胞的模型。24孔板中每孔预先接种10万个 MS-5细胞，静置过夜。NB4细胞用钙黄绿素染色10min后与0.1-10μM的C3 多肽溶液在无血清培养基中孵育2h，以每孔50万细胞数目加到铺有MS-5细胞 的24孔板中。孵育1h后收集上清液中未粘附的细胞，离心浓缩后在激发光488 nm、吸收光514nm处检测细胞溶液的荧光值并计算得出粘附率。而粘附到MS-5 细胞上的NB4细胞在荧光显微镜下拍照。

结果如图19所示，与对照相比，经C3多肽预处理的NB4细胞对基质细胞 的粘附能力明显减小，且随多肽浓度的增加，粘附率逐渐降低。当多肽浓度为 0.1μM、1μM、10μM时，NB4细胞的粘附率分别为0.91±0.09,0.63±0.08， 0.41±0.27。

实施例20：多肽分子对10-羟基喜树碱杀伤NB4细胞的影响实验

以NB4细胞作为研究白血病细胞的模型。15万个小鼠骨髓基质细胞MS-5 种到24孔板中，过夜贴壁。往96孔板中种入用无血清培养基重悬的50万个N  B4细胞，之后加入的终浓度为10μM的含1%DMSO的C3多肽分子一起孵育 1h。将96孔板里的细胞转移到种有MS-5细胞的24孔板或只含相同体积培养 基的24孔板中，板中事先加入终浓度为10μM的含1%DMSO的C3多肽分子， 孵育4h后加入11nM的10-羟基喜树碱，24h后收集24孔板里的NB4细胞， PBS清洗两遍后用结合缓冲液(10mM Hepes/NaOH，pH7.4，140mM NaCl，2.5 mM CaCl₂)重悬，FITC-Annexin V溶液避光染色3min后，加入PI溶液一起染 色10min，用流式细胞仪进行检测分析。

如图20所示，MS-5细胞能在一定程度上保护NB4细胞免受10-羟基喜树 碱的杀伤作用，并提高NB4细胞的存活。而经C3多肽预处理之后，在一定程 度上降低了MS-5细胞对NB4细胞的保护作用，从而提高10-羟基喜树碱的敏感 度。

实施例21：多肽分子对肿瘤相关细胞THP-1细胞的亲和力实验

以THP-1细胞作为研究白血病细胞的模型。将含50万个THP-1细胞1% DMSO的无血清培养基种到24孔培养板中,加入终浓度为10μM的C3多肽分子 一起孵育4h。收集细胞后用PBS清洗两遍，之后在5μg/ml的FITC-SA溶液中 4℃孵育0.5h。用PBS清洗两遍，以100目细胞滤网过筛。只加入FITC-SA的 细胞组作为阴性对照。在流式细胞分析仪中，检测细胞被标记比例。

如图21所示，C3与THP-1细胞有高结合力。

实施例22：多肽分子对CXCL12分子诱导THP-1细胞迁移的抑制作用实验

以THP-1细胞作为研究白血病细胞的模型。THP-1细胞与浓度为0.1～10μM 的C3多肽溶液在无血清培养基溶液中一起孵育1h后，加到上室中，每室15万 个细胞，下室为50ng/ml的CXCL12溶液。迁移24h后收集下室细胞溶液，离 心后计数并统计结果。

如图22所示，在没有加入趋化因子CXCL12时，THP-1细胞的迁移率较低。 下室加入CXCL12后，细胞表现出较强的向下室迁移的能力。当C3多肽浓度分 别为0.1μM、1μM、10μM时，相对于CXCL12组，THP-1细胞的迁移率分别 为90±5.4%,76±5.0%，65±17.8%。

实施例23：多肽分子对MS-5细胞诱导THP-1细胞迁移的抑制作用实验

以THP-1细胞作为研究白血病细胞的模型。THP-1细胞用钙黄绿素染色 10min后，用培养基溶液洗一遍，之后与10μM C3多肽在无血清培养基溶液中 孵育1h，加到小室中，每室15万个细胞，下室为用8μg/ml的丝裂霉素处理2h 后静置过夜的MS-5细胞，每孔10万个。孵育6h后收集下室细胞溶液，离心后 在激发光488nm、吸收光514nm处检测细胞溶液的荧光值。

如图23所示，与对照相比，MS-5细胞会诱导更多的THP-1细胞迁移至下 室，而C3多肽预处理的THP-1细胞对MS-5的响应能力显著降低，细胞迁移率 降至77±10.5%。

实施例24：多肽分子对MS-5细胞诱导THP-1细胞粘附到MS-5上的抑制 作用实验

以THP-1细胞作为研究白血病细胞的模型。24孔板中每孔预先接种10万 个MS-5细胞，静置过夜。THP-1细胞用钙黄绿素染色10min后与0.1-10μM的 C3多肽溶液在无血清培养基中孵育2h，以每孔50万细胞数目加到铺有MS-5 细胞的24孔板中。孵育1h后收集上清液中未粘附的细胞，离心浓缩后在激发 光488nm、吸收光514nm处检测细胞溶液的荧光值并计算得出粘附率。而粘附 到MS-5细胞上的THP-1细胞在荧光显微镜下拍照。

结果如图24所示，与对照相比，经C3多肽预处理的THP-1细胞对基质细 胞的粘附能力明显减小，且随多肽浓度的增加，粘附率逐渐降低。当多肽浓度 为0.1μM、1μM、10μM时，THP-1细胞的粘附率分别为0.72±0.19,0.59±0. 08，0.51±0.23。

实施例25：多肽分子对CXCL12分子诱导THP-1细胞骨架蛋白组装的抑制 作用实验

以THP-1细胞作为研究白血病细胞的模型。将50万个THP-1细胞经10μM 的C3多肽处理1h后，与50ng/ml的CXCL12在37℃孵育1h；收集THP-1细 胞，将细胞用2%多聚甲醛在37℃固定30min，PBS清洗两遍后用0.5%Triton  X-100/PBS透膜5min，PBS洗两遍后用1%BSA/PBS封闭5min，晾干后用2 μg/ml的罗丹明标记的鬼笔环肽溶液在37℃处理40min，之后用0.5%Tween 20/PBS清洗3遍。最后用激光共聚焦显微镜观察细胞的微丝骨架结构。

如图25所示，THP-1细胞经CXCL12活化后微丝骨架排布相对紧密，且细 胞膜表面不规则，有类似突触状结构形成，这与细胞迁移能力和粘附能力增强 相对应，而先经C3多肽处理的细胞在CXCL12作用后骨架排布较弥散不规则， 多在细胞核周围，与对照相似。

实施例26：多肽分子对U937细胞的亲和力实验

以U937细胞作为研究白血病细胞的模型。将含50万个U937细胞1%D  MSO的无血清培养基种到24孔培养板中,加入终浓度为10μM的C3多肽分子 一起孵育4h。收集细胞后用PBS清洗两遍，之后在5μg/ml的FITC-SA溶液 中4℃孵育0.5h。用PBS清洗两遍，以100目细胞滤网过筛。只加入FITC-SA 的细胞组作为阴性对照。在流式细胞分析仪中，检测细胞被标记比例。

如图26所示，多肽分子与U937细胞有高结合力。

实施例27：多肽分子对CXCL12分子诱导U937细胞迁移的抑制作用实验

以U937细胞作为研究白血病细胞的模型。U937细胞与浓度为0.1～10μM 的C3多肽溶液在无血清培养基溶液中一起孵育1h后，加到上室中，每室15 万个细胞，下室为50ng/ml的CXCL12溶液。迁移24h后收集下室细胞溶液， 离心后计数并统计结果。

如图27所示，在没有加入趋化因子CXCL12时，U937细胞的迁移率较低。 下室加入CXCL12后，细胞表现出较强的向下室迁移的能力。当C3多肽浓度分 别为0.1μM、1μM、10μM时，相对于CXCL12组，U937细胞的迁移率分别为 85±15.3%,90±2.2%，73±12.3%。

实施例28：多肽分子对MS-5细胞诱导U937细胞迁移的抑制作用实验

以U937细胞作为研究白血病细胞的模型。U937细胞用钙黄绿素染色10 min后，用培养基溶液洗一遍，之后与10μM C3多肽在无血清培养基溶液中孵 育1h，加到小室中，每室15万个细胞，下室为用8μg/ml的丝裂霉素处理2h 后静置过夜的MS-5细胞，每孔10万个。孵育6h后收集下室细胞溶液，离心 后在激发光488nm、吸收光514nm处检测细胞溶液的荧光值。

如图28所示，与对照相比，MS-5细胞会诱导更多的U937细胞迁移至下 室，而C3多肽预处理的U937细胞对MS-5的响应能力显著降低，细胞迁移率 降至79±10.9%。

实施例29：多肽分子对MS-5细胞诱导U937细胞粘附到MS-5上的抑制 作用实验

以U937细胞作为研究白血病细胞的模型。24孔板中每孔预先接种10万 个MS-5细胞，静置过夜。U937细胞用钙黄绿素染色10min后与0.1-10μM的 C3多肽溶液在无血清培养基中孵育2h，以每孔50万细胞数目加到铺有MS-5 细胞的24孔板中。孵育1h后收集上清液中未粘附的细胞，离心浓缩后在激发 光488nm、吸收光514nm处检测细胞溶液的荧光值并计算得出粘附率。而粘附 到MS-5细胞上的U937细胞在荧光显微镜下拍照。

结果如图29所示，与对照相比，经C3多肽预处理的U937细胞对基质细胞 的粘附能力明显减小，且随多肽浓度的增加，粘附率逐渐降低。当多肽浓度为 0.1μM、1μM、10μM时，U937细胞的粘附率分别为0.87±0.09,0.67±0.15或 0.37±0.08。

上述实验显示：本发明所述多肽具有增强肿瘤细胞对抗肿瘤药物敏感性及 抑制肿瘤细胞迁移的能力，可以用作治疗或辅助性治疗肿瘤（尤其是白血病和 乳腺癌）的药物。

本领域技术人员将会理解：尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描 述，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改 变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等 同物给出。