以粘蛋白1和生存素为靶点的肿瘤DNA疫苗及病毒载体疫苗

摘要

本发明涉及肿瘤DNA疫苗和病毒载体疫苗领域。具体地说，本发明涉及重组DNA载体VR-S8和VR-MS、重组腺病毒Ad-S8和Ad-MS及重组痘病毒MVA-MS疫苗，以及DNA疫苗和病毒载体疫苗以及病毒载体疫苗之间免疫方式的优化组合在制备抗肿瘤疫苗中的用途。

说明书

本申请为分案申请，其原申请的申请日为2009年12月4日，申请号 为200910252427.X，名称为“以粘蛋白1和生存素为靶点的肿瘤DNA疫苗 及病毒载体疫苗”。

技术领域

本发明涉及肿瘤DNA疫苗和病毒载体疫苗领域。具体地说，本 发明涉及重组DNA载体VR-S8和VR-MS、重组腺病毒Ad-S8和 Ad-MS及重组痘病毒MVA-MS疫苗，以及DNA疫苗和病毒载体疫苗 以及病毒载体疫苗之间免疫方式的优化组合在制备抗肿瘤疫苗中的用 途。

背景技术

生存素(Survivin)是抑制凋亡蛋白(IAP)家族成员，具有抗凋 亡和调控细胞分裂的双重功能，广泛表达于各种胚胎组织和癌细胞 中，但在正常终末分化细胞中不表达。这些特点使生存素成为肿瘤发 生，发展和治疗等领域中的一个新靶点。

目前的研究表明生存素在肿瘤基因治疗中具有潜在价值：它的肿 瘤特异性表达，及其与预后不良、药物抗性和病人生存期缩短等呈正 相关。针对生存素及其突变体等进行的肿瘤免疫治疗已成为人们关注 的热点。目前国内外策略有(参见Li,F.et al.,2006；Li,F.,2003； Altieri,D.C.,2008)：(1)利用生存素启动子的肿瘤特异性表达进行的 肿瘤靶向基因治疗；(2)针对生存素本身的治疗策略：a)生存素的反 义或全长的cDNA或反义核苷酸表达载体策略，比较适合生存素的功 能研究和前临床研究，但用全长的生存素可能有潜在的危险；b)生 存素功能阴性突变体(dominant negative mutant，DNM)策略，主要 是SurvT34A和SurvC84A，但此方案可能不适用于直接的癌症治 疗；c)生存素核酶方案，即用生存素mRNA特异性核酶剪切生存素 mRNA以降低生存素的表达，此方案也是一种有效的研究工具，但不 适用于癌症临床治疗；d)生存素RNAi技术，目前的研究表明： RNAi能有效的使哺乳动物基因表达沉默，可用于基因功能研究，但 昂贵的费用限制其临床应用；e)用小分子有机物或小肽抑制生存素 的表达或干扰其功能；f)用生存素特异性表位的免疫治疗，这是一 个很吸引人的领域，但只用生存素的小肽，免疫原性可能不高。

因为生存素具有抗凋亡的功能，如果用其全长来设计疫苗可能存 在安全隐患，根据国内外策略的优点和弊端拟采用生存素抗凋亡功能 缺失剪切体来设计疫苗，在保证其抗凋亡功能缺失的情况下尽量保存 长度以提高免疫原性。因此本发明采用生存素的抗凋亡功能缺失剪切 体来设计疫苗。生存素在体内是以二聚体形式起作用的，它N-端第 6、第7和第10位的三个氨基酸是形成二聚体的关键氨基酸(参见Shi, Y.et al.,2000)；生存素的第5位至第14位氨基酸是HLA-A2的特异 性抗原表位(参见Andersen,M.H.et al.,2001)，基于这两点本发明 首次设计了剪切体S8(即切去生存素N-端7个氨基酸)，希望可以破 环它的二聚体结构，从而使其缺失抗凋亡的功能。因此以S8为靶点 来设计疫苗可能会提高疫苗的安全性。

粘蛋白1(MUC1)是粘蛋白家族成员，是跨膜糖蛋白，存在于正 常腺管上皮细胞及其来源的肿瘤细胞表面，由多肽核心和侧枝糖链构 成。其核心肽胞外段含有数目不等的串联重复区(VNTR)。正常组 织中MUC1分布于腺管上皮细胞分泌极，与免疫细胞相对隔离，糖基 化丰富；而在肿瘤组织，其广泛分布并异常丰富地表达于细胞表面， 糖基化不完全，因此暴露出正常情况下隐蔽的表位，成为免疫细胞攻 击的靶点，并且表达增强，可达正常细胞的100倍以上，因此MUC1 是较理想的抗肿瘤靶分子。

MUC1 VNTR中的PDTRP序列是B细胞及T细胞共同识别的表 位，可与MUC1特异性抗体及细胞毒性T淋巴细胞(CTL)相结合， 故称这个最具免疫原性的部位为免疫显性结构域，因此，目前大部分 利用MUC1研究免疫治疗的都是集中在VNTR区域(参见Singh,R.et  al.,2007；Persson,J.et al.,2006；Xing,P.X.et al.,1992；Tang,C.K.et  al.,2008；Tang,C.K.et al.,2008)。从发现MUC1到现在已用其进行 了很多的疫苗研究工作，并有一些疫苗已经进入人类临床研究阶段， 但大多数都是传统的多肽类、蛋白类或树突状细胞(DC)类疫苗，这 些疫苗大多都存在免疫原性差或制备困难等问题；进入临床的基因疫 苗主要是重组痘病毒疫苗，虽然没有检测到毒性，但直接用重组痘病 毒疫苗初免-加强还是存在较大的安全隐患，而且产生的临床效果也 不是很理想；DNA载体疫苗由于免疫原性较弱目前还基本处于临床 前研究阶段。

本发明发明人的前期研究表明增加VNTR的数目可在一定程度上 增强MUC1的免疫效果(参见Zhang S et al.,2008)，如33个拷贝的 MUC1 VNTR串联重复序列引起的免疫应答明显强于2个拷贝的 MUC1 VNTR串联重复序列引起的免疫应答，因此本发明选用含有33 个的串联重复序列MUC1 VNTR作为抗原来设计疫苗，并将其与S8 融合表达来构建融合表达疫苗以增强疫苗免疫的广谱性和有效性，目 前将生存素和MUC1 VNTR联合应用进行肿瘤治疗还未见报导。

发明内容

本发明提供了一种DNA片段S8，所述S8片段的序列为SEQ ID  NO:8。

本发明提供了一种重组质粒VR-S8，其中所述重组质粒的骨架载 体为如图1A的VR1012，在所述VR1012的多克隆位点中所述的S8 片段。优选地，所插入的S8片段位于VR1012的多克隆位点SalI和 BamHI之间。

本发明提供了一种SEQ ID NO:9所示的DNA片段MS，所述序列 MS包含一个含有33个拷贝的MUC1 VNTR的DNA片段33M和所述 的S8片段。

本发明提供了一种重组质粒VR-MS，其特征在于所述重组质粒 的骨架载体为VR1012，在所述VR1012的多克隆位点中插入了所述 的MS片段。优选地，所插入的MS片段位于VR1012的多克隆位点 SalI和BamHI之间。

本发明提供了一种重组腺病毒Ad-S8，其特征在于在腺病毒中插 入了所述的S8片段。优选地，所述重组腺病毒的骨架载体为 pBHGloxΔE1,3Cre，所插入的S8片段位于所述重组腺病毒的多克隆 位点EcoRI和BglII之间

本发明提供了一种重组腺病毒Ad-MS，其特征在于在腺病毒中插 入了所述的MS片段。优选地，所述重组腺病毒的骨架载体为 pBHGloxΔE1,3Cre，所插入的MS片段位于所述重组腺病毒的多克隆 位点BglII处。

本发明提供了一种重组改良安卡拉痘苗病毒MVA-MS，其特征在 于在所述重组改良安卡拉痘苗病毒中插入了所述的MS片段。优选 地，所插入的MS片段位于所述重组改良安卡拉痘苗病毒的多克隆位 点SalI和KpnI之间。

本发明提供了所述的S8片段或所述的MS片段在制备用于进行抗 肿瘤免疫的蛋白疫苗、DNA疫苗、病毒载体疫苗或树突状细胞疫苗 中的用途。

在一个优选的实施方案中，上述疫苗中包含免疫佐剂和/或化疗 药物，其中所述免疫佐剂选自细胞因子白介素2(IL-2)、细胞因子粒 -巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)和非甲基化的CpG基序免疫刺激 DNA序列，其中所述化疗药物选自卡铂、顺铂、奥沙利铂和紫杉 醇。

本发明首先以S8为靶点进行肿瘤基因疫苗的研究，分别构建 DNA载体疫苗(VR-S8)和腺病毒载体疫苗(Ad-S8)，采用DNA初 免-重组腺病毒加强免疫(DNA prime-rAd boost)免疫策略，同时采 用表达白细胞介素2(IL2)的质粒(VR-IL2)作为免疫佐剂，通过免 疫小鼠检测S8基因疫苗的免疫原性及抗肿瘤活性，结果表明：小鼠 可产生针对S8的特异性抗体(见图4)和CTL(见图5)；该疫苗具 有一定的抗肿瘤活性，在预防性实验中，与PBS组比较， VR-S8/VR-IL2/Ad-S8疫苗免疫组模型小鼠肿瘤生长抑制率为 68.54％，生存期延长了35.6％(见图6)。在治疗性实验中，与PBS 组比较，VR-S8/VR-IL2/Ad-S8疫苗免疫组模型中小鼠肿瘤生长受到 了明显的抑制(抑制率为23.42％)，但并没有明显延长模型小鼠的生 存期(见图7)。

本发明采用生存素和MUC1为靶点设计融合表达基因疫苗。由于 MUC1基因的多态性决定了不同个体间VNTR数目的不同，最常见的 为含有30-90个连续重复序列，根据自行构建MUC1 VNTR基因的特 点选择以33个重复区序列(简称为33M，该序列含有33个VNTR的 串联重复序列，每个重复序列之间有6个由于构建引入的酶切位点的 碱基序列，)来构建MUC1 DNA载体疫苗(VR-33M)，同时构建33M 与S8融合表达的DNA载体疫苗(VR-MS)。通过免疫模型小鼠检测 融合表达基因疫苗的免疫效果和抗肿瘤活性与二者单独表达的疫苗相 比是否有明显的提高，结果表明生存素和MUC1融合表达基因疫苗的 免疫效果明显强于二者单独表达的疫苗的免疫效果，例如：在对肿瘤 的预防性研究中，融合表达疫苗免疫组与生存素疫苗单独免疫组相比 抑瘤率提高了134％，生存期延长了166％；与MUC1单独免疫组比 较，抑瘤率提高了25％，生存期延长了73％(见图12)。为了进一 步加强MS疫苗的免疫效果又构建了其病毒载体疫苗(Ad-MS和 MVA-MS)，采用DNA初免-重组腺病毒加强免疫的免疫策略，同时 采用表达IL2的质粒作为免疫佐剂，通过免疫模型小鼠检测融合表达 基因疫苗的免疫效果和抗肿瘤活性，结果表明DNA初免-重组腺病毒 加强的免疫策略能明显抑制模型小鼠肿瘤的生长，并有效延长小鼠的 生存期；IL2也显示出了明显的佐剂增强作用(见图13)。

附图说明

图1.DNA载体及重组DNA载体疫苗图谱。A为VR1012载体图 谱；B为重组质粒VR-S8图谱；C为重组质粒VR-33M图谱；D为重 组质粒VR-MS图谱。

图2.重组腺病毒载体图谱及制备流程。A为AdMax^TM腺病毒载 体及重组病毒制备流程；B为穿梭载体pDC316图谱；C为重组穿梭 载体pDC316-S8图谱；D为重组穿梭载体pDC316-MS图谱。

图3.MVA重组原理及相关载体图谱。A为MVA重组示意图；B 为穿梭载体pSC11图谱；C为重组穿梭载体pSC11-MS图谱，MS结 构基因表达框架重组到MVA的TK基因中，基因表达的启动子采用 P7.5。

图4.小鼠免疫血清抗S8抗体的检测。C57/BL小鼠经PBS(2)、 VR-IL2(3)、VR-S8(4)，VR-S8/VR-IL2(5)，VR-S8/VR-IL2/Ad-S8 (6)免疫后，以小鼠的血清作为一抗，以表达S8的COS-7细胞裂解 上清作为检测小鼠血清的抗原，以S8单克隆抗体作为阳性对照(1)， 进行蛋白质印迹(Western-blot)检测的结果。

图5.以不同形式S8基因疫苗免疫后，小鼠脾淋巴细胞的特异性 CTL杀伤活性检测。从被免疫小鼠脾细胞中分离的淋巴细胞为效应细 胞，并用特异性抗原肽(H-2d限制性)标记的小鼠肺癌细胞株B16作 为靶细胞，采用非放射性LDH释放法检测免疫鼠的CTL应答。

图6.不同形式S8基因疫苗对MS_f⁺B16(购自ATCC)肿瘤细胞 体内生长的免疫预防作用。C57BL/6小鼠经PBS对照组、VR-IL2、 VR-S8、VR-S8/VR-IL2以及VR-S8/VR-IL2/Ad-S8在经隔周免疫四次 后一周，接种MS_f⁺B16肿瘤细胞，测量肿瘤大小(A)至26天，生存 情况观察至肿瘤接种后50天(B)。

图7.不同形式S8基因疫苗对MS_f⁺B16肿瘤细胞体内生长的免疫 治疗作用。在给C57BL/6小鼠皮下接种MS_f⁺B16肿瘤细胞后，分别 给予PBS对照组、卡铂(Carboplatin)、VR-S8/VR-IL2/Ad-S8和 VR-S8/VR-IL2/Ad-S8/卡铂疫苗，测量肿瘤大小(A)至27天，生存 情况观察至肿瘤接种后50天(B)。

图8.小鼠免疫血清抗S8、33M及MS抗体的检测。C57/BL小鼠 经PBS(1)、VR-S8(2)、VR-33M(3)、VR-MS(4)免疫后，以 小鼠的血清作为一抗，以表达MS的COS-7细胞裂解物作为抗原，进 行蛋白质印迹检测的结果。

图9.MS疫苗与单独表达生存素和MUC1的疫苗诱导小鼠产生特 异性CTL杀伤活性的比较。从被免疫小鼠脾细胞中分离的淋巴细胞 为效应细胞，并用生存素(A)和MUC1(B)特异性抗原肽(H-2d 限制性)标记的小鼠肺癌细胞B16作为靶细胞，采用非放射性LDH 释放法检测免疫鼠的CTL应答。

图10.小鼠免疫血清抗MS抗体的检测。C57/BL小鼠经PBS (1)、VR-IL2(2)、VR-MS(3)、VR-MS/VR-IL2(4)、 VR-MS/VR-IL2/Ad-MS(5)免疫后，以小鼠的血清作为一抗，以表达 MS的COS-7细胞裂解物作为抗原，进行蛋白质印迹检测的结果。

图11.基于MS基因疫苗不同形式免疫后，小鼠脾淋巴细胞的特 异性CTL杀伤活性检测。从被免疫小鼠脾细胞中分离的淋巴细胞为 效应细胞，并用生存素(A)和MUC1(B)特异性抗原肽(H-2d限 制性)标记的小鼠肺癌细胞B16作为靶细胞，采用非放射性LDH释 放法检测免疫鼠的CTL应答。

图12.MS疫苗与单独表达生存素和MUC1的疫苗对模型小鼠免 疫预防效果比较。C57BL/6小鼠经PBS对照组、VR-S8、VR-33M以 及VR-MS在经隔周免疫三次后一周，接种MS_f⁺B16肿瘤细胞，测量 肿瘤大小(A)至26天，生存情况观察至肿瘤接种后50天(B)。

图13.不同形式MS基因疫苗对MS_f⁺B16肿瘤细胞体内生长的免 疫治疗作用。在给C57BL/6小鼠皮下接种MS_f⁺B16肿瘤细胞后，分 别给予PBS对照组、卡铂、VR-MS/VR-IL2/Ad-MS、 VR-MS/VR-IL2/MVA-MS以及VR-MS/VR-IL2/Ad-MS/卡铂组，测量 肿瘤大小(A)至27天，生存情况观察至肿瘤接种后50天(B)。

具体实施方式

一.上述片段33M和S8的制备方法和条件

1.33M的制备

MUC1VNTR为一个含有60个碱基的重复片段，GenBank号为 NM_002456(SEQ ID NO:1)。根据一个VNTR的碱基序列设计了两 对引物，采用重叠延伸PCR技术(SOE PCR)合成1个VNTR(1m) 重复区片段，然后利用限制性内切酶SalI和XhoI酶切产生相同粘性 末端的特性，依次进行连接，构建33M基因片段。具体方法如下：

1)重叠延伸PCR技术

PCR反应条件为：95℃20s、55℃20s、72℃30s，进行30 个循环，利用引物P1(SEQ ID NO:2)和P2(SEQ ID NO:3)扩增 出无ATG的1拷贝MUC1VNTR(简写为m)，以P2和P3(SEQ ID NO: 4)为引物扩增出含ATG的1拷贝MUC1VNTR(简写为Am)片段。

2)pGEM-T-33M的构建、酶切鉴定及序列分析

将上述PCR产物m和Am分别和pGEM-T-easy(Promega公司) 载体进行连接，分别获得含有所述m和Am片段的pGEM-T-m和 pGEM-T-Am两个质粒，然后利用限制性内切酶SalI和XhoI酶切产 生相同粘性末端的特性，依次进行连接获得含有所述33M片段的 pGEM-T-33M质粒，经SalI和XhoI酶切鉴定后进行序列分析，测序 结果正确。具体过程即先将pGEM-T-m用SalI和XhoI双酶切得目的 片断m，然后再将其插入pGEM-T-m的XhoI位点，即得到 pGEM-T-2m。然后再将pGEM-T-2m用SalI和XhoI双酶切得目的片 断2m，然后再将其插入pGEM-T-2m的XhoI位点，即得到 pGEM-T-4m，同理得pGEM-T-32m，然后再将pGEM-T-Am用SalI 和XhoI双酶切得目的片断Am，然后再将其插入pGEM-T-32m的SalI 位点，即得到了质粒pGEM-T-33m。

2.S8的制备

生存素，GenBank号为NM_001168，根据生存素的序列设计了 两对引物，采用RT-PCR技术从293细胞的总RNA中扩增出了S8的 基因片段，序列为SEQ NO:8所示的碱基序列。具体方法如下：

1)RT-PCR技术

采用TRIzol RNA提取试剂盒(Gibco公司)提取293细胞的总 RNA，采用Super-Script反转录酶试剂盒(Gibco公司)从中获得293细 胞的cDNA，然后以其为模板，以P4(SEQ ID NO:5)和P5(SEQ ID  NO:6)为引物进行PCR(反应条件为：95℃30s、55℃30s、 72℃1min，进行30个循环)扩增生存素cDNA。

2)pGEM-T-S8的构建、酶切鉴定及序列分析

将生存素cDNA的PCR产物与pGEM-T-easy载体进行连接得到 含有生存素cDNA的pGEM-T-Surv质粒。经序列分析证实正确后， 以pGEM-T-Surv为模板，以P6(SEQ ID NO:7)和P5为引物通过 PCR扩增S8片段(SEQ ID NO:8)，正向引物P6引入EcoRI、XbaI 和SalI的酶切位点，反向引物P5引入了BamHI的酶切位点。将S8 PCR产物连入pGEM-T-easy载体获得含有所述S8片段的pGEM-T-S8 质粒，经SalI和BamHI酶切鉴定后进行序列分析，测序结果正确。

二.重组疫苗的获得方法及相应的条件

1.DNA载体疫苗

1)VR-33M的构建

VR1012载体(VR1012是Vical公司开发的经美国FDA正式批准 的可以用于人体基因疫苗临床试验的载体，已经完成的临床试验表明 其在人体的应用是安全的，该载体的构建过程参见文献(Human Gene  Therapy 1996，7：1205-1217))含有CMV启动子，卡那霉素抗性基 因，内含子A和BGH PolyA翻译终止信号等常规部件组成，共 4913bp，图谱见图1A。

将上述制得的pGEM-T-33M质粒经SalI/XhoI双酶切后用胶回收 试剂盒(北京天根生化科技有限公司)回收33M基因片段，将真核表 达载体VR1012载体经SalI单酶切后用胶回收试剂盒(北京天根生化 科技有限公司)回收载体片段，利用经SalI和XhoI酶切后具有相同 粘性末端这一性质将所回收的目的基因片段和载体片段，以T4 DNA 连接酶，在16℃下连接3h。用所得连接产物转化感受态大肠杆菌 Top10(invitrogen公司),涂布卡那霉素抗性的LB平板，并于37℃ 下培养过夜，挑选阳性菌落于5mlLB培养基中37℃下培养16h， 1,2000rpm离心收获菌体，用质粒提取试剂盒(北京天根生化科技有 限公司)提取质粒，用SalI/BamHI进行双酶切和测序鉴定，结果正 确，即得到了重组质粒VR-33M，图谱见图1C。

2)VR-S8的构建

将pGEM-T-S8和真核表达载体VR1012载体分别经SalI/BamHI 双酶切，用胶回收试剂盒(北京天根生化科技有限公司)回收目的基 因片段S8和VR1012载体片段，用T₄DNA连接酶，16℃连接3h。用 所得连接产物转化感受态大肠杆菌Top10(invitrogen公司)，涂布卡 那霉素抗性的LB平板，并于37℃下培养过夜，挑选阳性菌落于 5mlLB培养基中37℃下培养16h，1,2000rpm离心收获菌体，用质粒 提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取质粒，用SalI/BamHI 进行双酶切和测序鉴定，结果正确，即得到了重组质粒VR-33M，图 谱见图1B。

3)VR-MS的构建

将pGEM-T-33M经SalI/XhoI双酶切后回收目的基因片段33M， 将VR-S8载体经SalI单酶切后回收载体片段，利用经SalI和XhoI酶 切后具有相同粘性末端这一性质将回收目的基因片段和载体片段用 T₄DNA连接酶，16℃连接3h。获得VR-33M-S8，简称VR-MS质粒， 用SalI/BamHI进行双酶切和测序鉴定，结果正确，即得到了重组质 粒VR-MS，图谱见图1D。

MS序列为如SEQ ID NO:9所示的碱基序列。

2.重组腺病毒疫苗(Ad-S8、Ad-MS)的获得

腺病毒是一种无外壳的双链DNA病毒，基因组长约36kb，衣壳 呈规则的20面体结构，直径约80-110nm。腺病毒基因组的两端各有 一段100bp的反向末端重复序列(ITR)，是复制的起始位点。在左 端ITR的3′侧有一段长约300bp的包装信号(ψ)介导腺病毒基因 组包装入病毒衣壳。对腺病毒而言，只有包括两端的ITR和包装信号 (ψ)的约0.5kb的序列是顺式作用元件，即必须由腺病毒载体自身 携带，而其他的30余种蛋白都可以通过辅助病毒(或细胞)反式补 足。

本实验中采用的腺病毒系统是AdMax^TM Adenovirus载体系统 (Microbix公司)，该系统是位点特异性重组系统，位点特异性重组 是发生在两条DNA链特异位点上的重组，重组的发生需一段同源序 列即特异性位点和位点特异性的蛋白因子即重组酶参与催化。重组酶 只能催化特异性位点间的重组,不能催化其它任何两条同源或非同源 序列之间的重组,因而重组具有特异性和高度保守性。据此，位点特 异性重组又称保守重组，该重组过程不需RecA酶参与。目前应用较 多的有Cre/loxP、FLP/FRT和BP/attBP系统，其中Cre、FLP和BP 均为特异性重组酶，属重组酶λ整合酶家族，它们催化的反应类型、 靶位点及重组机制十分相似，loxP、FRT和attBP为特异性位点，也 有相似的结构。AdMaxTM Adenovirus载体应用的是Cre/loxP系统， Cre基因表达产物为343个氨基酸的单聚体蛋白，分子量为38kDa， 它是位点特异性重组发生所需的特异性重组酶,其识别位点被称为 loxP(locus of crossing-over P1)，为一段34bp的DNA序列，由两个 13bp的反向重复序列和一个8bp的不对称间隔序列(又称为核心序列) 组成5′-ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3′。loxP 位点碱基重排后形成十字形的结构，核心序列形成一单链环，它为 Cre重组酶切割的底物，也是DNA识别与重组的位点，对称的13bp 反向重复序列是Cre重组酶结合的序列。

AdMaxTM Adenovirus载体系统是由穿梭载体和骨架载体 (pBHGloxΔE1,3Cre)构成，各含有一个同向排列的LoxP位点，其 中骨架载体还含有由CMV启动子调控的Cre基因。将穿梭载体与骨 架载体共转染包装细胞株293，骨架载体所携带的Cre基因开始表 达，介导两个LoxP位点之间的重组，剪切掉骨架载体上的细菌内复 制元件、抗性基因以及Cre基因，同时完成目的基因的插入。由于骨 架载体虽然携带有大部分的腺病毒基因组DNA却缺少形成有感染能 力腺病毒颗粒所必需的包装信号(ψ)，而穿梭载体则含有ψ，因此只 有在两个载体之间发生了重组，才能完成腺病毒生活周期，形成有感 染能力的重组腺病毒颗粒；另外，骨架载体缺失E1基因，因此需要 转染组成型表达E1蛋白的293细胞。将骨架载体和穿梭载体(本研究 选用的穿梭载体为pDC316，图谱见图2B)共转染293细胞，利用293 细胞中的E1蛋白，10左右天就可以产生出含有外源基因的重组腺病 毒噬斑(见图2A)，挑取噬斑，进行PCR(反应条件为：95℃30s、 53℃30s、72℃1min，进行30个循环)鉴定，选取正确的克隆进 行大量扩增、纯化和滴度测定。

1)穿梭重组质粒pDC316-S8和pDC316-MS的获得

将pGEM-T-S8用EcoRI/BamHI双酶切后回收得到S8目的片段， 将pDC316用EcoRI/BglП双酶切后回收作为载体，利用BamHI和 BglП具有相同粘性末端的性质，将回收目的基因片段和载体片段用 T₄DNA连接酶，16℃连接3h。用所得连接产物转化感受态大肠杆菌 Top10(Invitrogen公司)，涂布卡那霉素抗性的LB平板，并于37℃ 下培养过夜，挑选阳性菌落于5mlLB培养基中37℃下培养16h， 1,2000rpm离心收获菌体，用质粒提取试剂盒(北京天根生化科技有 限公司)提取质粒，用EcoRI/BglП进行双酶切和测序鉴定，结果正 确，即得到了重组质粒pDC316-S8(图谱见图2C)质粒。将VR-MS 用BglП单酶切后回收得到MS目的片段，将pDC316用BglП单酶切 后回收作为载体，将回收目的基因片段和载体片段进行连接，经双酶 切和测序鉴定结果正确，即获得pDC316-MS(图谱见图2D)质粒。

2)Ad-S8和Ad-MS重组病毒的获得

将pBHGloxΔE1,3Cre和pDC316-S8或pDC316-MS共转染293 细胞后，经过筛选、扩增、纯化后，获得分别含有S8和MS片段的重 组腺病毒Ad-S8或Ad-MS。

3.重组MVA疫苗(MVA-MS)的获得

改良安卡拉痘苗(MVA，Modified Vaccinia Ankara)具有安全性 高、外源基因容量大等优点使其得以广泛应用于肿瘤免疫治疗中。 MVA含有胸苷激酶基因(TK)(参见图3A)；pSC11(参见图3B) 是它的穿梭质粒，具有多克隆酶切位点可以插入外源基因、具有胸苷 激酶的左臂和右臂(TKL、TKR)可以与MVA进行同源重组，同时 含有lacZ基因，可以用于重组MVA(rMVA)的蓝斑筛选。所述MVA 系统(含穿梭质粒pSC 11)购自ATCC。

1)穿梭重组质粒pSC11-MS的获得

将VR-MS和pSC11经SalI/KpnI双酶切后回收，将回收目的基因 片段MS和pSC11载体片段用T₄DNA连接酶，16℃连接3h。用所得 连接产物转化感受态大肠杆菌Top10(invitrogen公司)，涂布卡那霉 素抗性的LB平板，并于37℃下培养过夜，挑选阳性菌落于5mlLB培 养基中37℃下培养16h，12000rpm离心收获菌体，用质粒提取试剂 盒(北京天根生化科技有限公司)提取质粒，用SalI/KpnI进行双酶 切和测序鉴定，结果正确，即得到了重组质粒pSC11-MS(见图3C)。

2)MVA-MS重组病毒的获得

首先以滴度0.05pfu/cell的MVA感染tk-ts13细胞(购自ATCC， ATCC号为CRL-1632^TM，是不含有TK基因的BHK-21的突变株)。 感染2小时后，利用Lipofection2000(INVITROGEN)的方法将 pSC11-MS转染到感染了MVA的tk-ts13细胞中。MVA在tk-ts13细 胞内复制的过程中，由于pSC11-MS具有与MVA的TK基因同源的 TKL和TKR，所以有一定比例的MVA病毒与pSC11-MS发生重组， 结果MS和LacZ阅读框架被重组到MVA病毒基因组中。形成如图3C 所示的MVA-MS重组病毒。

以上被感染细胞培养三天后，收集细胞，裂解细胞，超声波处 理，2000rpm离心10min除去细胞残渣保留上清。取一定量上清，作 为种毒，在6孔板中将病毒依次稀释成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6， 感染tk-ts13细胞2h。将等体积的在45℃下预温的2％低熔点琼脂糖 和2×DMEM-10/BrdU(BrdU，5-溴脲嘧啶，可被TK磷酸化，磷酸 化的BrdU可掺入到野生型MVA中，产生致死性突变，从而可以使野 生型MVA逐渐减少)培养基混匀，每孔加入3ml培养基，在室温下 凝固，在37℃下于含5％CO₂的培养箱中培养48h。铺上层选择性培 养基，成分比下层琼脂多了1/120体积的4％X-gal。培养过夜，挑选 蓝色单斑，反复冻融三次裂解释放病毒，进行下一轮的筛选，步骤相 同，如此进行6轮以上筛选，最后直至得到只含重组病毒MVA-MS的 克隆株。

三.疫苗免疫效果

1.S8疫苗免疫效果

1.1S8疫苗的免疫原性

本部分实验从体液免疫和细胞免疫两个方面探讨生存素DNA疫 苗和重组腺病毒疫苗，以及其与IL-2质粒共免疫诱导小鼠的免疫应 答。实验将C57/BL/6小鼠按表1进行分组，1组在第0、2、4、6周 注射PBS；2-4组在第0、2、4、6周注射VR-S8疫苗及VR-IL2佐 剂；5组在第0、2、4周注射VR-S8DNA疫苗及VR-IL2佐剂，在第 6周注射重组腺病毒疫苗。考察生存素DNA单独免疫的免疫效果、 IL-2质粒的佐剂效果，以及重组腺病毒的免疫增强作用。

表1 S8疫苗免疫原性

1.1.1体液免疫—抗体的蛋白质印迹检测

末次免疫后1周，对小鼠进行尾静脉取血，将所分离血清用于特 异性抗体检测。收取表达S8的COS-7细胞的裂解上清，经 SDS-PAGE分离后，转移至硝酸纤维素膜上，作为检测小鼠血清的抗 原。从各实验组中取1∶20稀释(稀释液为PBS配制的1％的牛奶) 的免疫血清作为第一抗体，以生存素单克隆抗体作为阳性对照，以用 碱性磷酸酶标记的马抗鼠IgG(immuno research公司)作为第二抗 体，经蛋白质印迹法检测各免疫血清生存素抗体的特异性。

结果如图4所示，PBS(泳道2)组和IL2(泳道3)组未染出条 带，而其他实验组检测结果均呈阳性，表明C57/BL/6小鼠在经生存 素基因疫苗免疫后，其血清中产生了抗生存素抗原的特异性抗体。S8 单独免疫产生的抗体滴度较弱，加入IL-2后产生的抗体滴度有所增 强，重组腺病毒Ad-S8加强免疫后抗体滴度明显增强。

1.1.2细胞免疫—细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性

末次免疫后两周处死小鼠，取脾并分离淋巴细胞。以从被免疫小 鼠脾细胞中分离的淋巴细胞为效应细胞，并以用生存素特异性抗原肽 (S_88-96)标记的B16细胞(购自ADCC)，按一定比例混合上述效应 细胞和靶细胞，采用非放射性的乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测试剂 盒Cyto Tox96(Promega)检测淋巴细胞对靶细胞的杀伤情况，用来 表征所述疫苗在小鼠体内诱导的特异性CTL反应强度。

本发明根据SYFPEITHI算法(www.syf-peithi.de)预测生存素的 H-2D^b MHCI限制性表位肽，选择与H-2D^b MHCI的结合常数值较高 的抗原肽(S_88-96)作为抗原肽进行上述实验。

实验结果如图5所示，由图5可以看出，与PBS对照组相比， VR-IL2组未检测到生存素特异性CTL(p＞0.05)；VR-S8组只有在 效靶比为100∶1时可检测到CTL应答，但没有统计学意义； VR-S8/VR-IL2联合免疫组在效靶比为100∶1和33∶1时均检测到了 特异性CTL应答(p＜0.05)，比VR-S8单独免疫组的CTL应答有所 提高但没有统计学意义(p＞0.05)；VR-S8/VR-IL2/Ad-S8组在注射 了三针DNA疫苗后又注射了一针重组腺病毒疫苗Ad-S8加强免疫， 结果在效靶比为100∶1、33∶1和10∶1时均检测到了特异性CTL应 答(p＜0.01)，与VR-S8/VR-IL2组比较CTL应答也明显提高(p＜ 0.05)。

由上述体液免疫和细胞免疫结果可以看出单独应用VR-S8基因疫 苗可以诱导小鼠产生针对生存素的特异性抗体和CTL免疫应答。免 疫佐剂VR-IL2质粒与VR-S8DNA疫苗共注射后，诱导小鼠产生的特 异体液免疫和细胞免疫反应都有所增强，表明VR-IL2可增强VR-S8 基因疫苗的免疫应答，起到了免疫佐剂的作用；重组腺病毒疫苗在三 针DNA疫苗免疫后进行加强免疫可明显提高VR-S8/VR-IL2联合免疫 组的抗体滴度和CTL应答水平，起到了加强免疫的作用。

1.2S8疫苗的肿瘤保护性

1.2.1预防性

根据前面的结果可知生存素基因疫苗能够诱导小鼠产生特异性体 液免疫和细胞免疫，本节采用生存素的DNA疫苗和重组腺病毒疫苗 及IL2进行模型小鼠肿瘤的预防实验，以考察生存素基因疫苗是否可 以在小鼠体内诱导产生保护性抗肿瘤免疫应答，以及VR-IL2质粒佐 剂及prime-boost免疫方式是否能够促进这一保护作用。

表2 生存素疫苗预防效果

将C57BL/6小鼠按表3随机分为五组(15只/组)。第1、2、3、 4组分别在0、2、4、6周免疫DNA疫苗；第5组在0、2、4周免疫 DNA疫苗在第6周注射重组腺病毒疫苗加强免疫。所有小鼠均在末次 免疫一周后于小鼠右侧背下部皮下接种MS_f⁺B16肿瘤细胞，考察成 瘤时间和肿瘤大小的变化，另外五组同时观察小鼠存活率的变化。实 验分组及免疫时间如表4所示。

1.2.1.1肿瘤生长的抑制作用

实验结果表明，与PBS免疫组相比，VR-S8、VR-S8/VR-IL2和 VR-S8/VR-IL2/Ad-S8免疫组的模型小鼠肿瘤生长明显减慢，并随着 IL2佐剂的加入和重组腺病毒Ad-S8的加强依次减慢。图6A为预防实 验各组肿瘤体积变化情况，由图可以看出：VR-IL2免疫组与PBS对 照组比较，肿瘤生长无明显变化；VR-S8免疫组与PBS组比较，小鼠 肿瘤的生长缓慢，二者有显著差异(在接种肿瘤后23至26天，p <0.05)；与VR-S8单独免疫组比较，VR-S8/VR-IL2共免疫组肿瘤生 长明显缓慢(在接种肿瘤后20至26天，p<0.05)；与VR-S8/VR-IL2 共免疫组相比，VR-S8/VR-IL2/Ad-S8组肿瘤生长明显减慢(在接种肿 瘤后20至23天，p<0.05；24至26天，p<0.01)。

1.2.1.2模型小鼠生命延长情况

PBS组平均生存期为33.92±1.36天，至接种肿瘤细胞后40天时 小鼠全部死亡，VR-IL2组平均生存35.40±1.70天，至接种肿瘤细胞 后48天小鼠全部死亡，与PBS组无明显区别；VR-S8组平均生存 37.47±1.60天，至接种肿瘤细胞后50天，有6.7％的小鼠存活，生命 延长率为10.5％，但与PBS组比较没有明显差别；而VR-S8/VR-IL2 组平均生存39.67±1.70天，至观察期有6.7％的小鼠存活，生命延长 率为17％，与PBS组比较，生命明显延长(p<0.05)，但与VR-S8 组比较没有明显差异；而VR-S8/VR-IL2/Ad-S8组平均生存46.01± 1.60天，至观察期仍有53.3％的小鼠存活，生命延长率为35.6％，与 其他组比较，生命明显延长(p<0.01)，见图6B。

从上述预防性实验结果可以看出，VR-S8疫苗能明显抑制模型小 鼠肿瘤的生长，但不能有效延长模型小鼠生存期；但加入IL2佐剂 (VR-S8/VR-IL2免疫组)后，不但能显著抑制模型小鼠肿瘤的生长还 能有效提高模型小鼠的生存期，因此VR-IL2起到了免疫佐剂的效 果；VR-S8/VR-IL2免疫三次后，用重组腺病毒加强免疫 (VR-S8/VR-IL2/Ad-S8免疫组)后能非常显著的抑制模型小鼠肿瘤的 生长并十分显著的延长模型小鼠的生存期，说明初免-加强免疫策略 能明显增强疫苗的免疫效果。

1.2.2治疗性

根据模型鼠预防实验的结果，S8DNA疫苗在IL-2佐剂辅助下， 用重组腺病毒疫苗Ad-S8加强免疫能十分有效地发挥抗肿瘤保护作 用，因此在模型小鼠肿瘤的治疗实验中，选择VR-S8和VR-IL2共免 疫三针后用重组腺病毒Ad-S8加强免疫，考察VR-S8/VR-IL2/Ad-S8 基因疫苗对模型小鼠体内肿瘤生长的抑制作用和对荷瘤鼠生命的延长 作用。同时，以化疗药物卡铂做阳性对照，通过 VR-S8/VR-IL2/Ad-S8疫苗和卡铂给药联合应用的方式，来探讨二者 在模型小鼠肿瘤的治疗中是否有协同作用。

表3 生存素疫苗治疗效果

(注：表3中的卡铂的给药时间为第1、6、11、16天)

将C57BL/6小鼠按表3随机分为VR-S8/VR-IL2/Ad-S8、VR-S8/ VR-IL2/Ad-S8与卡铂联合作用组(VR-S8/VR-IL2/Ad-S8/Carb)、卡 铂阳性对照组(卡铂)及对照组(PBS)，每组15只。在第0天于小 鼠右侧背下部靠近尾根部约0.7cm处皮下接种MS_f⁺B16肿瘤细胞，第 1、8、15天分别给予基因疫苗及PBS，给药方式为肌肉注射；卡铂的 给药时间为第1、6、11、16天，给药方式为腹腔注射。从第10天左 右开始观察肿瘤的生长和大小的变化，另外四组同时观察小鼠存活率 的变化。抑瘤率组实验小鼠在第28天左右对照组小鼠开始死亡，处 死全部小鼠，剥离肿瘤，测量瘤重，计算抑瘤率；生存期组实验小鼠 观察小鼠的生存情况，直至小鼠全部死亡，时间约为50天。

1.2.2.1肿瘤生长的抑制作用

图7A为治疗实验各组肿瘤体积变化情况。与PBS对照组比较， VR-S8/VR-IL2/Ad-S8、卡铂及VR-S8/VR-IL2/Ad-S8/卡铂组肿瘤生长 明显减慢，在接种肿瘤后21至27天，均为p<0.05)； VR-S8/VR-IL2/Ad-S8与卡铂联合应用组与二者单独应用组比较，肿 瘤生长速度明显减慢(在接种肿瘤后21至27天，均为p<0.05)，结 果表明卡铂与疫苗联合应用能明显提高疫苗对荷瘤鼠肿瘤生长的抑制 作用。

1.2.2.2模型小鼠生命延长情况

PBS组平均生存期为31.21天，至接种肿瘤细胞后38天时小鼠全 部死亡；VR-S8/VR-IL2/Ad-S8组平均生存33.64天，至接种肿瘤细胞 后44天时小鼠全部死亡，与PBS组比较没有明显差别；卡铂组平均 生存天数分别为35.29，至观察期时有7.1％的小鼠存活，生命延长率 为13.07％，与对照组比较小鼠生命均明显延长(均为p<0.05)； VR-S8/VR-IL2/Ad-S8与卡铂联合应用组平均生存天数为39.29天，至 观察期时有21.4％的小鼠存活，生命延长率为25.89％，与对照组比 较小鼠生命均明显延长(均为p<0.01)；卡铂与疫苗联合应用组与疫 苗单独应用组比较，小鼠生命明显延长，表明卡铂能明显提高疫苗对 荷瘤鼠生存期的延长作用，如图7B。

2.MS免疫效果

2.1 MS疫苗的免疫原性

2.1.1 MS疫苗与生存素疫苗和MUC1疫苗的免疫效果的比较

本部分实验从体液免疫和细胞免疫两个方面探讨生存素与MUC1 融合基因疫苗的免疫原性与单独表达二者的疫苗相比是否有明显增 强。实验将C57/BL/6小鼠按表4进行分组，每组5只，第一组在0， 2，4周分别给与PBS，第2，3，4组在0，2，4周分别免疫相应的 DNA疫苗，所有小鼠在第6周拉颈处死、取脾做CTL。考察生存素与 MUC1融合基因疫苗免疫效果是否强于单独应用二者的免疫效果。

表4 MS疫苗与生存素疫苗和MUC1疫苗的免疫效果的比较

2.1.1.1体液免疫—抗体的蛋白质印迹检测

末次免疫后1周，对小鼠进行尾静脉取血，分离血清用于特异性 抗体检测。收取表达MS的COS-7细胞的裂解上清，经SDS-PAGE分 离后，转移至硝酸纤维素膜上，作为检测小鼠血清的抗原。从各实验 组中取1∶20稀释(稀释液为PBS配制的1％的牛奶)的免疫血清作 为第一抗体。用碱性磷酸酶标记的马抗鼠IgG(immuno research公 司)作为第二抗体，经蛋白质印迹法检测各免疫组小鼠血清中生存素 和MUC1特异性抗体的滴度。

如图8所示，为各组免疫小鼠产生抗体的情况，由图可见VR-S8 (泳道2)、VR-33M(泳道3)和VR-MS(泳道4)组小鼠均产生了 抗生存素和MUC1的特异性抗体，其中VR-33M组产生的抗体滴度最 强，VR-MS组产生的抗体滴度弱于VR-33M组产生的抗体滴度。这 是未预料到的结果，推测其原因可能是MUC1本身为跨膜蛋白且主要 部分在胞外，因此可产生的抗体滴度较高；而生存素为胞内蛋白，生 存素与MUC1融合以后可能会阻碍MUC1向细胞膜转运，延长所述融 合蛋白在胞内的滞留时间，可能会提高蛋白酶对其水解的机率，从而 降低所述融合蛋白(MS)在体内的稳定性，使其被迅速降解，进而使 抗体滴度下降。但这一过程可能会为细胞免疫途径提供大量的可与 MHC分子结合的小肽，进而促进细胞免疫应答。

2.1.1.2细胞免疫—细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性

以从被免疫小鼠脾细胞中分离的淋巴细胞为效应细胞，并以用生 存素或MUC1特异性抗原肽标记的B16细胞，按一定比例混合上述效 应细胞和靶细胞，采用非放射性的乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测试 剂盒Cyto Tox96(Promega)测定靶细胞B16被裂解的比例，用来表 征该疫苗在小鼠体内诱导的特异性CTL反应强度。结果如图9所示。

图9为表4对应的各个免疫组(VR-S8、VR-33M和VR-MS)小 鼠产生生存素和MUC1特异性CTL的情况。A图是以用生存素特异 的CTL限制性表位肽孵育的B16细胞作为靶细胞，检测以不同的疫 苗诱导小鼠产生生存素特异性CTL的情况。由图可以看出，与PBS 对照组相比，VR-S8组未检测到生存素特异性CTL(p＞0.05)； VR-MS组检测到生存素特异性CTL(p＜0.05)，但与VR-S8组相比 无统计学意义上的差异；而VR-33M组未检测到CTL应答，说明产 生的CTL为生存素特异性的。

B图是以用MUC1特异的CTL限制性表位肽孵育的B16细胞作 为靶细胞，检测以不同的疫苗诱导小鼠产生MUC1特异性CTL的情 况。由图可以看出，与PBS对照组相比，VR-33M和VR-MS组均产 生了MUC1特异性的CTL(p＜0.05)，且VR-MS组产生的CTL应 答水平，略高于VR-33M组产生的应答水平，但无统计学意义上的差 异；而VR-S8组未检测到CTL应答，说明产生的CTL为MUC1特异 性的。

可见，VR-33M、VR-MS基因疫苗均能诱导小鼠产生特异的CTL 免疫应答。

2.1.2初免-加强免疫(Prime-boost)免疫策略和IL2佐剂对MS 疫苗的免疫增强作用

本部分实验采用DNA初免-重组腺病毒加强免疫的免疫策略，及 IL2免疫佐剂从体液免疫和细胞免疫两个方面探讨生存素与MUC1融 合基因疫苗诱导小鼠产生免疫应答的情况，考察prime-boost免疫策 略对疫苗免疫效果的增强作用和IL2质粒的佐剂效果。

表5 初免-加强免疫免疫策略和IL2佐剂对MS疫苗的免疫增强作 用

将C57/BL/6小鼠按表五进行分组，每组5只，第1、2、3组分别 在第0、2、4、6周注射DNA疫苗，第4、5组分别在第0、2、4周注 射DNA疫苗，第6周注射重组腺病毒疫苗，第8周处死所有小鼠，取 脾，检测生存素与MUC1特异性CTL。

2.1.2.1体液免疫—抗体的蛋白质印迹检测

末次免疫后1周，对小鼠进行尾静脉取血，分离血清用于特异性 抗体检测。收取表达MS的COS-7细胞的裂解上清，经SDS-PAGE分 离后，转移至硝酸纤维素膜上，作为检测小鼠血清的抗原。从各实验 组中取1∶20稀释(稀释液为PBS配制的1％的牛奶)的免疫血清作 为第一抗体。以用碱性磷酸酶标记的马抗鼠IgG(immuno research公 司)作为第二抗体，经蛋白质印迹法检测各免疫组小鼠血清中生存素 和MUC1特异性抗体的滴度。

图10为表5对应的各个免疫组小鼠血清中生存素和MUC1特异 性抗体的产生情况。由图10可见，经PBS(泳道1)和IL2(泳道2) 免疫的小鼠未产生生存素和MUC1特异性抗体，而VR-MS(泳道3)、 VR-MS/Ad-MS(泳道4)和VR-MS/IL2/Ad-MS(泳道5)免疫的小鼠 均产生了生存素和MUC1特异性抗体，而且抗体滴度依次增强，表明 重组腺病毒Ad-MS和IL2均起到了增强免疫效果的作用。

2.1.2.2细胞免疫——细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性

本发明以从被免疫小鼠脾细胞中分离的淋巴细胞为效应细胞，并 以用生存素或MUC1特异性抗原肽标记的B16细胞或稳定表达细胞系 MS_f⁺B16(购自ATCC)作为靶细胞，检测小鼠体内产生特异性CTL 应答情况。结果如图11所示。

图11为表5对应的各个免疫组(PBS、VR-IL2、VR-MS、 VR-MS/Ad-MS和VR-MS/VR-IL2/Ad-MS)小鼠产生生存素和MUC1 特异性CTL的情况。A图是以用生存素特异的CTL限制性表位肽孵 育的B16细胞作为靶细胞，检测不同的疫苗诱导小鼠产生生存素特异 性CTL的情况。由图可以看出，与PBS对照组相比，VR-MS、 VR-MS/Ad-MS和VR-MS/VR-IL2/Ad-MS组均检测到了生存素特异性 CTL(p＜0.05)，产生的CTL应答水平依次升高，且均有统计学意 义(依次为p＜0.05)；而VR-IL2组未检测到CTL应答，说明产生 的CTL为生存素特异性的。

B图是以用MUC1特异的CTL限制性表位肽孵育的B16细胞作 为靶细胞，检测不同的疫苗诱导小鼠产生MUC1特异性CTL的情 况。由图可以看出与PBS对照组相比，VR-MS、VR-MS/Ad-MS、 VR-MS/VR-IL2/Ad-MS组均产生了MUC1特异性的CTL(p＜0.05)， 产生的CTL应答水平依次升高，且均有统计学意义(依次为p＜ 0.05)；而VR-IL2组未检测到CTL应答，说明产生的CTL为MUC1 特异性的。

综上所述，VR-MS、VR-MS/Ad-MS、VR-MS/VR-IL2/Ad-MS基 因疫苗均能诱导小鼠产生针对生存素或MUC1特异的CTL免疫应 答，且产生的CTL水平依次明显升高，说明DNA初免-重组腺病毒加 强免疫的免疫策略能明显增强疫苗的免疫效果；IL2也起到了免疫佐 剂的增强作用。

2.2MS疫苗对模型小鼠的保护作用

2.2.1预防性作用

采用DNA疫苗VR-S8、VR-33M和VR-MS进行模型肿瘤的预防 实验，考察生存素和MUC1融合表达疫苗对小鼠肿瘤的保护力较单独 表达二者的疫苗的保护力是否有明显提高。

将C57BL/6小鼠分为四组(10只/组)。PBS、VR-S8、VR-33M 和VR-MS组分别在0、2、4、6周免疫DNA疫苗及PBS，所有小鼠 均在末次免疫一周后于小鼠右腿外侧接种MS_f⁺B16肿瘤细胞，考察 成瘤时间和肿瘤大小的变化，另外四组观察小鼠存活率的变化。实验 分组及免疫时间如下：

表6 MS疫苗对模型小鼠肿瘤的预防性

2.2.1.1肿瘤生长的抑制作用

图12A为预防实验中各组肿瘤体积变化情况。VR-S8、VR-33M 免疫组与PBS对照组相比，小鼠肿瘤的生长缓慢，有显著性差异(从 接种肿瘤后22天开始，p<0.05)；而VR-MS免疫组与PBS对照组相 比，小鼠肿瘤的生长明显减慢，有非常显著性差异(从接种肿瘤后20 天开始，p<0.05，22天开始,p<0.01)；VR-MS免疫组与VR-S8单独 免疫组相比，肿瘤体积明显减小(在接种肿瘤后22开始，p<0.05，24 天开始，p<0.01)，但与VR-33M组比较无显著差异。

2.2.1.2小鼠的生存情况

PBS组平均生存期为31.6天，至接种肿瘤细胞后38天时小鼠全 部死亡；VR-S8组平均生存35.7天，至接种肿瘤细胞后45天小鼠全 部死亡，与PBS组无明显区别；VR-33M组平均生存37.89天，至接 种肿瘤细胞后50天，有11.1％的小鼠存活，与PBS组比较有明显差 别(p<0.05)；而VR-MS组平均生存42.5天，至观察期结束仍有 37.5％的小鼠存活，生命延长率为34.49％(p<0.01)，与VR-S8组和 VR-33M组比较，生命明显延长(p<0.05)。见图12B。

从上述预防性实验结果可以看出，VR-MS疫苗对模型小鼠肿瘤 的生长抑制作用和对模型小鼠生命延长情况明显强于VR-S8疫苗；与 VR-33M疫苗相比，尽管在肿瘤生长抑制方面没有明显提高，但能明 显延长模型小鼠生命。目前对肿瘤疫苗的评价已经开始倾向于对肿瘤 患者生命的延长及生活质量的提高，用肿瘤缩小甚至消失作为实体瘤 治疗评价标准早已成为人们的思维定式。而当被照搬到肿瘤疫苗评价 时，人们却发现它并不能反映疫苗的真实疗效。因为有些肿瘤疫苗虽 然有效延长了患者生命，提高了生活质量，肿瘤体积却未必明显缩 小。因此，我们认为VR-MS疫苗对肿瘤的保护力有明显提高。

2.2.2治疗性作用

根据前面的实验结果可知IL2佐剂能明显提高疫苗的免疫效果及 对小鼠肿瘤的保护力；DNA初免-重组腺病毒加强免疫的免疫策略能 显著增强DNA疫苗的免疫效果和对小鼠肿瘤的保护力；生存素和 MUC1融合表达疫苗的免疫效果和肿瘤保护力较单独使用二者时明显 提高。因此本节根据上述结论，在模型小鼠肿瘤的治疗实验中，选择 用VR-MS和VR-IL2共免疫三针后用重组腺病毒Ad-MS加强免疫， 考察VR-MS/VR-IL2/Ad-MS基因疫苗对模型小鼠体内肿瘤生长的抑 制作用和对荷瘤鼠生命的延长作用。同时，以化疗药物卡铂做阳性对 照，通过VR-MS/VR-IL2/Ad-MS免疫和卡铂给药联合应用的方式， 来探讨二者在模型小鼠肿瘤的治疗中是否有协同作用。同时为了考察 MVA-MS的免疫加强效果，在实验中又设计了 VR-MS/VR-IL2/MVA-MS免疫组，进而比较Ad-MS和MVA-MS免疫 加强效果的强弱。

将C57BL/6小鼠按表7随机分为VR-MS/VR-IL2/Ad-MS、 VR-MS/VR-IL2/MVA-MS、VR-MS/VR-IL2/Ad-MS与卡铂联合作用 组(MS/IL2/Ad-MS/卡铂)、卡铂阳性对照组及对照组(PBS)，每 组15只。在第0天于小鼠右侧背下部皮下接种MS_f⁺B16肿瘤细胞， 在第1、8、15天分别给予基因疫苗及PBS，给药方式为肌肉注射； 卡铂的给药时间为第1、6、11、16天，给药方式为腹腔注射。从第 10天左右开始观察肿瘤的生长和大小的变化，另外四组同时观察小鼠 存活率的变化。抑瘤率组实验小鼠在第28天左右对照组小鼠开始死 亡，处死全部小鼠，剥离肿瘤，测量瘤重，计算抑瘤率；生存期组实 验小鼠观察小鼠的生存情况，直至小鼠全部死亡，时间约为50天。

表7 MS疫苗对模型小鼠肿瘤的治疗性(抑瘤率实验)

(注：表7中的卡铂的给药时间为第1、6、11、16天)

2.2.2.1肿瘤生长的抑制作用

图13A为治疗实验各组肿瘤体积变化情况。与PBS对照组比较， VR-MS/VR-IL2/Ad-MS、VR-MS/VR-IL2/MVA-MS、卡铂及 VR-MS/VR-IL2/Ad-MS/卡铂组均能明显抑制肿瘤的生长(在接种肿瘤 后21至27天，均为p<0.05)；VR-MS/VR-IL2/Ad-MS与卡铂联合应 用组与单独应用二者的组比较，肿瘤生长速度略有减慢，但没有统计 学意义，二者联合应用未能起到协同或累加的效果；VR-MS/VR-IL2/ Ad-MS组与VR-MS/VR-IL2/MVA-MS组比较没有明显差别。

2.2.2.2小鼠的生存情况

PBS组平均生存期为31.21天，至接种肿瘤细胞后38天时小鼠全 部死亡，VR-MS/VR-IL2/MVA-MS和VR-MS/VR-IL2/Ad-MS组平均 生存分别为34.21和35.28天，与PBS组比较没有明显差别；卡铂组 平均生存天数为35.29，至观察期时有7.1％的小鼠存活，生命延长率 分别为13.07％，与对照组比较，小鼠生命均明显延长(p<0.05)； VR-MS/VR-IL2/Ad-MS与卡铂联合应用组平均生存天数为38.36，至 观察期时有28.6％的小鼠存活，生命延长率为22.91％，与对照组比 较小鼠生命均明显延长(均为p<0.01)，与二者单独表达疫苗的应用 组比较小鼠生命明显延长(p<0.05)；VR-MS/VR-IL2/Ad-MS组与 VR-MS/VR-IL2/MVA-MS组相比没有明显差异，如图13B所示。

从上述治疗性实验结果可以看出，VR-MS/VR-IL2/Ad-MS、 VR-MS/VR-IL2/MVA-MS能明显抑制模型小鼠肿瘤的生长但不能有效 延长模型小鼠的生存期；VR-MS/VR-IL2/Ad-MS疫苗与卡铂联合应 用不但能显著抑制模型小鼠肿瘤的生长还能有效延长模型小鼠的生存 期；疫苗与卡铂联合免疫与二者单独应用相比，虽然在抑制肿瘤生长 方面没有体现出明显的优势，但能显著延长模型小鼠的生存期。传统 的肿瘤疫苗评价标准倾向于肿瘤体积的缩小，但肿瘤治疗的临床实践 证明有些肿瘤疫苗可以有效延长患者生命，提高生活质量，但未必能 明显减小肿瘤体积。因此，我们认为卡铂与疫苗联合应用与二者单独 应用相比对模型鼠肿瘤的保护力有明显提高。

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