叶酸-环糊精偶联物、药物递送载体、制备方法及用途

摘要

本发明属于医药化工领域，涉及一种叶酸-环糊精偶联物、叶酸-环糊精-富勒烯药物递送载体、制备方法及用途。具体地，所述叶酸-环糊精偶联物，由叶酸的羧基和环糊精的羟基连接形成，具体可通过叶酸的γ羧基和γ环糊精的6位羟基连接形成。本发明还涉及该偶联物包埋富勒烯C

说明书

技术领域

本发明属于医药化工领域，涉及一种叶酸-环糊精偶联物、偶联物 包埋富勒烯形成的药物递送载体、药物组合物、制备方法及用途。

背景技术

药物活性成分往往由于无法有效到达病灶部位或过量作用于正常 细胞和组织，而无法实现治疗目的或产生毒副作用。例如比较典型的 有铂类药物，其广泛用于卵巢癌、小细胞肺癌、睾丸癌、头颈部鳞癌、 子宫颈癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、胸膜间皮瘤、黑色素瘤及子宫内 膜癌的化疗治疗。但是铂类药物的靶向性差，一般药物剂量无法达到 治疗效果，过多剂量又会导致药物大量作用于正常细胞和组织，造成 化疗后人体骨髓抑制作、胃肠道反应、肾毒性、神经毒性等不良反应， 因而限制了铂类化疗药物的使用。

为减轻药物活性成分靶向性差所产生的副作用，药物递送载体应 运而生，其作用主要是承载药物活性成分，将活性成分输送至血液或 组织细胞内以治疗疾病。例如，在癌症的化疗治疗中，递送载体将化 疗药物输送至癌细胞内，使药物活性成分与癌细胞内DNA相互作用， 对肿瘤产生抑制作用。目前常用的铂类化疗药物递送载体包括脂质体、 胶束、纳米囊、聚合物-铂偶联物和碳纳米管等。

目前尚需一种新的靶向性强且具有缓控释效果的药物递送载体。

发明内容

本发明的发明人经大量实验后，创造出了一种新型的叶酸-环糊精 偶联物，并利用其制备出了靶向性强的药物递送载体和药物。

本发明一方面提供了一种叶酸-环糊精偶联物，由叶酸的羧基和环 糊精的羟基连接形成。

本发明的一个实施方式中，所述环糊精为γ环糊精。

本发明的一个实施方式中，叶酸-环糊精偶联物中叶酸与γ环糊精 的摩尔比为8:1。

本发明的一个实施方式中，所述叶酸-γ环糊精偶联物由叶酸的γ羧 基和γ环糊精的6位羟基连接形成，结构如下式，其中，构成γ环糊精的 8个单元相同，每个单元的6位羟基均与一叶酸分子的γ羧基相连接，

本发明再一方面提供了一种药物递送载体，其包含所述叶酸-环糊 精偶联物以及富勒烯；具体地，所述药物递送载体由所述叶酸-环糊精 偶联物包埋富勒烯形成。

本发明的一个实施方式中，所述富勒烯为C₆₀。

本发明的一个实施方式中，所述叶酸-环糊精偶联物与富勒烯的摩 尔比为1:1。

本发明另一方面提供了一种药物组合物(药物递送系统)，包括所 述的药物递送载体和能够被富勒烯吸附的药物活性成分。

本发明的一个实施方式中，所述药物递送载体和药物活性成分的重 量比为(1:1)-(10:1)，优选为5:1。

本发明的一个实施方式中，所述药物活性成分为铂类药物活性成分； 进一步地，所述铂类药物活性成分为铂类药物和/或铂类前药；优选，所 述铂类药物包括Pt(NH₃)₂Cl₂(顺铂，相对分子质量300.05)、 C₆H₁₂N₂O₄Pt(卡铂，相对分子质量371.3)、C₈H₁₄N₂O₄Pt(奥沙利 铂，相对分子质量397.29)、C₂H₈N₂O₃Pt(奈达铂，相对分子质量 303.18)、C₉H₁₈N₂O₃Pt(乐铂，相对分子质量397.33)和 C₁₀H₂₂Cl₂N₂O₄Pt(赛特铂，相对分子质量500.28)中的一种或多种； 优选，所述铂类前药包括葡萄醛酸-铂和/或硫代-铂，结构式如下：

本发明还提供了所述叶酸-环糊精偶联物的制备方法，包括下述步 骤：(1)将叶酸、环糊精与溶剂避光混合，以1-(3-二甲氨基丙基)-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺为活化剂避光条件下反应直 至结束；优选地，还包括步骤：(2)对步骤(1)中的产物进行透析、 干燥。

本发明的一个实施方式中，选自如下的1)－5)项中的任意一项或 者多项：

1)所述环糊精为γ环糊精；

2)所述γ环糊精、叶酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐 酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的投料摩尔比为1:8:(2-10):(2-10)，优 选为1:8:4:4；

3)所述溶剂为二甲基亚砜、氢氧化钠水溶液或碳酸钠水溶液；优 选为二甲基亚砜；

4)所述透析依次以磷酸盐缓冲液和二次蒸馏水作介质进行；

5)所述干燥为冷冻干燥。

本发明还给出了药物递送载体的制备方法：

方法一、将叶酸-环糊精偶联物与富勒烯C₆₀在甲醇中避光搅拌24h， 以16000r/min速度离心5min，收集沉淀物，用甲醇清洗3-5次，氮气吹 干，将沉淀物用20mL双蒸水溶解，再以5000r/min离心2min，去除残余 的C₆₀碎片，最后将产物冷冻干燥。

方法二、将叶酸-环糊精偶联物与富勒烯C₆₀在甲醇中避光研磨3h， 收集研磨产物，氮气吹干，将沉淀物用20mL双蒸水溶解，再以5000r/min 离心2min，去除残余的C₆₀碎片，4℃避光保存。

具体地，所述偶联物为叶酸-γ环糊精偶联物；具体地，所述偶联物 与富勒烯C₆₀的投料摩尔比为(1:1)-(5:1)，优选为1.5:1。

本发明又一方面提供了所述药物组合物的制备方法，包括下述步 骤：将所述的叶酸-环糊精偶联物与预吸附体在甲醇中避光混合，经分离、 清洗、干燥，得到药物组合物；其中，所述预吸附体通过如下步骤制得： 将富勒烯、药物活性成分与溶剂避光混合，经透析、干燥形成预吸附体； 具体地，所述溶剂为5％(w/w)葡萄糖注射液或0.9％(w/w)氯化钠注 射液。

本发明的一个实施方式中，选自如下的(1)－(7)项中的任意一 项或者多项：

(1)药物活性成分和富勒烯的投料重量比为(1:10)–(1:1)，优选为 1:4；

(2)叶酸-环糊精偶联物与预吸附体的投料重量比为(1:1)-(5:1)， 优选为1.5:1；

(3)所述富勒烯为C₆₀；

(4)所述混合独立地为搅拌或研磨；

(5)所述分离为离心分离；

(6)所述清洗采用甲醇或二次蒸馏水；

(7)所述干燥为冷冻干燥或氮气吹干。

本发明还给出了所述叶酸-环糊精偶联物、所述药物递送载体或所述 药物组合物在制备抗肿瘤或抗癌症药物中的用途；具体地，所述肿瘤是 叶酸受体高表达的肿瘤，所述叶酸受体高表达是指叶酸受体在肿瘤细胞 表面的表达量显著高于正常组织细胞；具体地，所述抗肿瘤药物是抑制 肿瘤细胞增殖和/或抑制肿瘤球体积增大和/或促进肿瘤球瓦解的药物； 具体地，所述肿瘤为淋巴癌、宫颈癌、乳腺癌、口腔表皮癌、胃癌、 肺癌、鼻咽癌、食道癌、膀胱癌、睾丸癌、卵巢癌、前列腺癌、骨 肉瘤、慢性粒细胞白血病癌、黑色素瘤以及头颈癌中至少一种；具 体地，所述肿瘤细胞为淋巴癌细胞、宫颈癌细胞、乳腺癌细胞、口 腔表皮癌细胞、胃癌细胞、肺癌细胞、鼻咽癌细胞、食道癌细胞、 膀胱癌细胞、睾丸癌细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、骨肉瘤细 胞、慢性髓原白血病细胞、黑色素瘤以及头颈癌细胞中至少一种； 优选，所述宫颈癌细胞为人源宫颈癌细胞HeLa或人源宫颈癌细胞 HeLa-229；优选所述乳腺癌细胞为人源乳腺癌MCF-7细胞；优选所 述口腔表皮癌细胞为人源口腔表皮样癌细胞KB细胞。

本发明的包埋指偶联物中γ环糊精具有空穴结构，其空穴可以利用 分子间作用力将一些分子(如富勒烯)包入其中，所形成的物质也被 称为超分子化合物。

发明的有益效果

(1)本发明所述叶酸-环糊精偶联物中，叶酸的羧基与γ环糊精 的羟基偶联，利于叶酸与肿瘤细胞表面的叶酸受体相互作用，提高了偶 联物对于肿瘤细胞的靶向性，且偶联物具有高亲水性。

(2)本发明所述药物递送载体中，富勒烯通过离域电子能够吸附 药物活性成分，细胞内酸性环境使富勒烯吸附的药物活性成分容易在 细胞内释放出来。环糊精内部疏水腔易于与富勒烯相适配，同时环糊 精使递送载体具有良好的外部亲水性。

附图说明

图1：本发明的药物组合物(药物递送系统)合成路线示意图。

图2：本发明药物物化检测中γ环糊精的红外吸收光谱。

图3：本发明药物物化检测中叶酸的红外吸收光谱。

图4：本发明药物物化检测中叶酸-γ环糊精偶联物的红外吸收光 谱。

图5：本发明药物物化检测中药物递送系统1的药物释放曲线。

图6：本发明药物物化检测中药物递送系统1的原子力显微镜图。

图7：本发明药物物化检测中药物递送系统1动态光散射的强度- 粒径曲线图。

图8：本发明体外细胞评测中药物递送系统1和卡铂对HeLa细 胞的抑制率曲线图。

图9：本发明体外细胞评测中HeLa细胞对叶酸-γ环糊精-C₆₀-FITC、γ环糊精-C₆₀-FITC、FITC和对照组的摄取量曲线图。

图10：本发明体外细胞评测中未经药物递送系统1处理的HeLa 细胞二维原子力显微镜图。

图11：本发明体外细胞评测中未经药物递送系统1处理的HeLa 细胞三维原子力显微镜图。

图12：本发明体外细胞评测中经药物递送系统1处理后的HeLa 细胞二维原子力显微镜图。

图13：本发明体外细胞评测中经药物递送系统1处理后的HeLa 细胞三维原子力显微镜图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领 域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限 定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造 商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通 过市购获得的常规产品。

(一)药物制备

制备例1：

(1)原料：

富勒烯C₆₀：购自濮阳市永新富勒烯科技有限公司，纯度≥98％。

叶酸：购自Sigma公司，纯度≥97％，Lot：081M1546V。

γ环糊精：购自Adamas Reagent公司，纯度≥98％，Lot：P1064982。

卡铂：购自北京偶合科技有限公司，纯度≥98％，批号：120330。

1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐：购自Adamas Reagent 公司，纯度≥97％，Lot：P1064982。

N-羟基丁二酰亚胺：购自国药集团化学试剂有限公司，纯度≥97％， 批号：F20101019。

5％(w/w)葡萄糖注射液：购自石家庄四药集团，批号：110505702。

(2)制备过程：药物组合物(药物递送系统)合成路线如图1所 示。

a)叶酸-γ环糊精偶联物的合成：合成路线如下。

                                                              将 8摩尔份数叶酸和1摩尔份数γ环糊精在二甲基亚砜中避光搅拌24h， 加入4摩尔份1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4摩尔份N- 羟基丁二酰亚胺作活化剂进行反应。反应结束后用截留分子量为500的 透析袋透析，先用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)作介质透析48h，再以二次 蒸馏水(双蒸水)作介质透析24h，以除去未反应原料和副产物，最后 冷冻干燥。

b)富勒烯C₆₀吸附卡铂：

将4重量份的富勒烯与1重量份的卡铂在5％葡萄糖注射液中避光 搅拌24h，用截留分子量为500的透析袋透析，以5％葡萄糖注射液为 介质透析24h，以去除未被吸附的卡铂，最后冷冻干燥，形成预吸附体。

c)叶酸-γ环糊精偶联物包埋预吸附体：

将1.5重量份的叶酸-γ环糊精偶联物和1重量份的预吸附体在甲醇 (分析纯，≥99.5％)中避光搅拌24h，以16000r/min速度离心5min， 收集沉淀物，用甲醇(分析纯，≥99.5％)清洗3-5次，氮气吹干，再加 入20mL双蒸水搅拌，以5000r/min速度离心2min，去除残余C₆₀碎片， 最后将沉淀物冷冻干燥，得到药物递送系统1。

制备例2：

将1.5重量份的叶酸-γ环糊精偶联物和1重量份的预吸附体在甲醇 (分析纯，≥99.5％)中避光研磨3h，收集研磨产物，氮气吹干，加入 20mL双蒸水搅拌，再以5000r/min离心2min，以去除残余C₆₀碎片， 4℃下避光保存。其它均与实施例1相同，得到药物递送系统2。

本发明包括但不限于使用以上述实施例中的卡铂(C₆H₁₂N₂O₄Pt) 作为药物活性成分，顺铂(Pt(NH₃)₂Cl₂)、奥沙利铂(C₈H₁₄N₂O₄Pt)、 奈达铂(C₂H₈N₂O₃Pt)、乐铂(C₉H₁₈N₂O₃Pt)、赛特铂(C₁₀H₂₂C_l2N₂O₄Pt) 及铂类前药和其他种类的药物活性成分均可用作制备本发明药物。其 中，铂类前药包括但不限于葡萄醛酸-铂和/或硫代-铂。本发明所要保护 的药物包括但不限于抗肿瘤或抗癌类药物。

(二)药物物化检测

(1)红外检测：

分别称取2mg的叶酸、γ环糊精和制备例1中的叶酸-γ环糊精偶联 物进行溴化钾压片，采用布鲁克红外光谱仪测定上述各物质的红外吸收 光谱，如图2-4所示。

谱图表明：叶酸-γ环糊精偶联物在官能团区(4000～1300cm^-1)和 指纹区(1300～400cm^-1)出现的特征吸收峰有3424～3330.4cm^-1的羟基 吸收峰，2929～2851cm^-1的CH₂、CH伸缩振动吸收峰，1626.5～ 1575.5cm^-1苯环骨架的振动吸收峰，1157.6～1069cm^-1酯基中C-O-C的 伸缩振动峰。相对于γ环糊精在3700～3000cm^-1的宽吸收峰，叶酸-γ 环糊精的羟基吸收峰变窄，说明γ环糊精上的羟基因与叶酸中的羧基反 应而消耗，数量减少所以吸收峰变窄。叶酸-γ环糊精偶联物中出现了叶 酸的苯环、CH₂、CH的伸缩振动峰以及反应位点酯基的伸缩振动峰说 明叶酸已与γ环糊精发生偶联。

不拘于理论的限制，叶酸的α羧基反应活性低并且α羧基易于被叶 酸受体高表达细胞所摄取，而叶酸γ羧基反应活性较α羧基高，容易作 为接枝位点与其它化合物发生偶联。γ环糊精中羟基的反应活性顺序为 6位>>2位>3位，除6位外其他位置的羟基均为惰性。

(2)载药量及药物释放曲线检测：

a)配制浓度分别为0.64、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6、32、64、112μg/ml 的卡铂溶液，采用尤尼克2800紫外分光光度计在波长229nm处测定各 溶液中卡铂的吸光度，以质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标建立线性 关系y＝0.0105x+0.0082，R²＝0.9984。

b)将1mg制备例1中的药物递送系统1溶解在5ml、5％葡萄糖 注射液中，以40kHz频率超声处理2h使药物中卡铂解吸附，用尤 尼克2800紫外分光光度计在波长229nm处测定溶液中卡铂的吸光度， 根据a)中质量浓度—吸光度线性关系计算出溶液中卡铂的质量浓 度，按照下式计算载药量为20％(w/w)。

载药量(％)＝溶液中卡铂质量/药物递送系统质量×100％

其中，溶液中卡铂质量＝溶液卡铂质量浓度×溶液体积。

c)将1mg药物递送系统1溶于5ml、5％葡萄糖注射液中，装入 截留分子量为500的透析袋内，将装有药物液体的透析袋放入广口 瓶同时加入35mL磷酸盐缓冲液(pH＝5.3)作为透析外液，广口瓶在 37℃以100r/min恒温振荡一段时间，分别在20min、40min、2h、 4h、8h、12h和24h时间点处取3mL透析外液，同时向瓶内补充 3mL磷酸盐缓冲液(pH＝5.3)，用尤尼克2800紫外分光光度计在波长 229nm处测定各次取样溶液中卡铂的吸光度，根据质量浓度—吸光度 线性关系计算出各取样溶液中卡铂质量浓度。最后打开透析袋将药 物液体完全释放到透析外液中，采用相同方法计算完全释放时溶液 中卡铂质量浓度，按照下式计算药物释放率，并以药物释放率为纵 坐标，时间为横坐标绘制药物释放曲线，如图5所示。

其中，

某时间点释放量＝某时间点取样溶液中卡铂质量浓度×取样体 积；

完全释放量＝完全释放时溶液中卡铂质量浓度×取样体积。

结果表明，在磷酸盐缓冲介质中，药物释放率在最初2小时内低于 45％，说明无突释效应。在2-10小时时间段，药物释放率缓慢上扬， 在30％～60％范围内变化，说明药物呈缓慢释放状态。24小时时， 药物释放量达到70％以上。可以看出本发明的药物递送载体具有良 好的缓控释效果。

(3)观察形态特征：

a)将少量药物递送系统1用双蒸水溶解，40kHz超声分散30 分钟，将其滴于新鲜云母表面，在室温下干燥，采用德国JPK  Nanowizard原子力显微镜进行形态学观察，采用轻敲模式扫描， 如图6所示。

b)将少量药物递送系统1用双蒸水溶解，40KHz超声分散30 分钟，采用马尔文动态光散射仪测定粒径，结果如图7所示。

结果表明：本发明的药物呈单分散态，原子力显微镜及动态光 散射所测粒径分布值均在190～200nm范围内。并且，采用同样的 方法检测药物2后发现，药物递送系统1和2无显著差异。

(三)体外细胞评测

(1)使用材料和药物：

人宫颈癌HeLa细胞，购自中国医学科学院协和医科大学药物研究 所。

人宫颈癌HeLa细胞的培养基为叶酸缺乏型RPMI-1640细胞培养 基、胎牛血清、青霉素和链霉素，配比为叶酸缺乏型RPMI-1640细胞培 养基：胎牛血清：青霉素：链霉素＝1ml：0.1ml：100U：100μg。

阴性对照：5％葡萄糖注射液。

制备例1制得的药物递送系统1。

(2)对人宫颈癌细胞HeLa的抑制作用：

以叶酸受体高表达的人宫颈癌HeLa细胞为研究对象，采用四甲基偶 氮唑盐(3-(4,5-dimcthylthioazol-2-yl)-2,5-diphenyl-terazolium  bromide,MTT)法测定药物递送系统1对肿瘤细胞的抑制率。

MTT法：将处于对数生长期的HeLa细胞消化重悬，以1×10⁴细胞 /孔接种于96孔板中(每孔含100μL细胞悬液)，将96孔板放入恒温 培养箱中培养24小时(37℃，5％(v/v)CO₂)。再将阴性对照试 样以及1μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、80μg/mL的药物 递送系统1和卡铂溶液试样分别加入孔板孔内，每一试样重复6个 孔，每孔加入80μL，之后继续培养48小时。然后向各孔内加入20μL 浓度为5mg/mL的MTT，37℃温育4小时后，吸弃孔中溶液并向各 孔中加入150μL二甲基亚砜，37℃下摇振15分钟，待孔中蓝紫色结 晶完全溶解后，采用酶标仪在490nm处测定各孔的吸光度值。实验 重复三次取平均值。抑制率计算公式如下，结果如图8所示。

抑制率(％)＝(阴性对照吸光度值-药物递送系统或卡铂吸光 度值)/阴性对照吸光度值×100％

结果表明：对于HeLa细胞，1、10、25、50、80μg/mL的卡 铂和药物递送系统1溶液对HeLa细胞增殖的抑制率分别为 18％±1％、32％±7％、53％±2％、65％±2％、66％±4％和19％±3％、 40％±7％、71％±3％、80％±2％、82％±1％。浓度在25μg/mL以上 时，卡铂和药物递送系统1对HeLa细胞都具有明显的抑制效应， 但是两者具有显著性差异。a代表药物递送系统1(叶酸-γ环糊精 -C₆₀-卡铂)与卡铂相比较，p<0.05；M±SD，n＝3。

(3)对人宫颈癌细胞HeLa凋亡作用的统计：

以叶酸受体高表达的人宫颈癌HeLa细胞为研究对象，采用流式细 胞仪测定药物递送系统1和卡铂对肿瘤细胞凋亡的影响。

具体方法为：将处于对数生长期的HeLa细胞消化重悬接种于6 孔板中(每孔含500μL细胞悬液)，放入恒温培养箱中培养24小时 (37℃，5％(v/v)CO₂)。再向孔板内加入药物递送系统1和卡铂 使孔内药物终浓度为50μg/mL，继续培养48小时。测试前将每孔内 细胞均用磷酸盐缓冲液漂洗并消化重悬于500μL缓冲液中，所得样 品内细胞数达到2×10⁶细胞/mL，再加入5μLAnnexin V-FITC和 5μLPI(Annexin-V-Fluos Staining kit,Sigma Aldrich,USA)避光反 应15分钟后上机测试，实验重复三次取平均值，结果如表1所示。

表1

注：*代表药物递送系统1与阴性对照(5％葡萄糖)相比较，p<0.05；+代表药物递 送系统1与卡铂相比较，p<0.05；M±SD，n＝3。

结果表明：药物浓度为50μg/mL的药物递送系统1和卡铂均可 引起明显的细胞凋亡。总凋亡率分别为：阴性对照(11.0％)、卡 铂(70.4％)、药物递送系统1(91.5％)，药物递送系统1与卡铂 相比具有显著性诱导细胞早期凋亡的作用。

(4)人宫颈癌细胞HeLa的摄取

a)测定异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC) 的标准曲线：准确称取3mgFITC用10mL二甲基亚砜(DMSO)配 制成300μg/mL的储备液，分别取500μL、100μL、50μL、30μL和10μL 的储备液定容至10mL，得到FITC浓度分别为15μg/mL、3μg/mL、 1.5μg/mL、0.9μg/mL和0.3μg/mL的标准样品，在495nm处测定各浓 度标准样品的紫外吸光度值，以FITC浓度为纵坐标、吸光度为横坐 标绘制得到标准曲线。

b)FITC标记药物：用DMSO溶解FITC得到两份标记溶液， 叶酸-γ环糊精-C₆₀(制备方法见发明内容部分方法一，其中，偶联 物与富勒烯C₆₀的投料摩尔比为1.5:1)和γ环糊精-C₆₀(除了不使用 叶酸，制备方法与叶酸-γ环糊精-C₆₀相同)分别与两份标记溶液混 合在避光条件下搅拌4小时，离心收集沉淀后用磷酸盐缓冲溶液漂 洗，得到FITC标记的两种药物递送载体。

c)载体吸附FITC量的测定：将1mgFITC标记的两种药物递送 载体分别溶于5ml的DMSO中，以40kHz频率超声30min处理使 FITC解吸附，在495nm波长处测定溶液的紫外吸光度值，根据标 准曲线得到溶液FITC浓度值，按照下式计算叶酸-γ环糊精-C₆₀和γ 环糊精-C₆₀的FITC吸附量。

FITC吸附量＝溶液FITC浓度值×溶液体积

d)将HeLa细胞接种于6孔板中，2×10⁵个细胞/孔，当细胞密度 达到70％时，分别向不同孔加入FITC标记的叶酸-γ环糊精-C₆₀、γ 环糊精-C₆₀、FITC和人宫颈癌HeLa细胞培养基(作为对照)，37℃ 温育4小时后采用磷酸盐缓冲液冲洗细胞2～3遍，用300μL磷酸盐缓 冲液混悬上机测试。

流式细胞仪测定结果如图9所示，其中a为对照，b为γ环糊精-C₆₀-FITC，c为FITC，d为叶酸-γ环糊精-C₆₀-FITC。HeLa细胞对叶 酸-γ环糊精-C₆₀-FITC、γ环糊精-C₆₀-FITC、FITC的摄取量为：叶酸 -γ环糊精-C₆₀-FITC>FITC>γ环糊精-C₆₀-FITC。这说明HeLa细胞的 大量叶酸受体，能够增加HeLa细胞对叶酸-γ环糊精-C₆₀的摄取，从 而在使用叶酸-γ环糊精-C₆₀-铂类药物即本发明的药物递送系统时， 进一步提高了药物的靶向性。

(5)对人宫颈癌细胞HeLa的形态影响

将HeLa细胞接种于含有盖玻片的6孔板中培养。待细胞贴壁后， 向一部分孔内加入药物浓度为25μg/mL的药物递送系统1共温育24小 时，之后用4％多聚甲醛固定所有孔内细胞30分钟，使用磷酸盐缓 冲液冲洗细胞后室温下干燥，采用原子力显微镜进行观察。测试模 式：轻敲，扫描速度：0.5-1Hz，图像处理与分析软件：SPM Version  3.3.25。

结果如图10-13所示，未经药物处理的HeLa细胞具有正常的肿瘤 细胞形态，包括完整的包膜、细胞核和细胞质、可见的细胞骨架纤 维和片状伪足。而经叶酸-γ环糊精-C₆₀-卡铂处理后，细胞形态发生明 显变化，表面更为粗糙，细胞皱缩，细胞表面出现大量孔洞，伪足 消失，说明叶酸-γ环糊精-C₆₀-卡铂改变了HeLa细胞的原有结构，破 坏肿瘤细胞结构，促进其凋亡，体现其对肿瘤细胞的杀伤作用

本发明提供的药物递送载体可以将铂类等化疗药物靶向递送到肿 瘤细胞中，减少了化疗药在正常组织中的累积，解决了化疗药物缺少主 动靶向性的问题，而且减少化疗药进入正常组织中，达到降低毒性的 作用，为临床治疗提供了一种有效途径。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人 员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修 改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围 由所附权利要求及其任何等同物给出。