一种三嗪类抗球虫药物复合分子印迹聚合物的制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种三嗪类抗球虫药物复合分子印迹聚合物的制备方法和应用，属于分子印迹技术领域，该方法以地克珠利DIC为模板分子I，妥曲珠利TOL为模板分子II，四氢呋喃为致孔剂、甲基丙烯酸MAA为功能单体，季戊四醇三丙烯酸酯PETA为交联剂、偶氮二异丁腈AIBN为引发剂，制备获得DIC和TOL复合分子印迹聚合物，再将该印迹聚合物与硅藻土等质量混合，获得一种能够对DIC和TOL均有良好识别能力的固相萃取柱填料，克服了现有技术中分子印迹技术只能应用于单一目标化合物的固相萃取柱制备，而不能同时用于多种化合物分离的固相萃取柱制备的技术问题。

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种分子印迹聚合物的制备方法，尤其涉及的是一种三嗪类抗球虫药物复合分子印迹聚合物的制备方法和应用 

背景技术

地克珠利(DIC)以及妥曲珠利(TOL)皆属于三嗪类抗球虫药物，其中DIC化学名为氯嗪苯乙氰，具有高效低毒的特点，除可有效杀灭球虫外，还具有残留抗球虫能力，是目前市售抗球虫药物中成本最低、效果最好的药物之一。TOL化学名为甲苯三嗪酮，是一种广谱抗球虫药且毒性较低。在动物饲养中如不正确使用会造成药物残留，从而影响土壤环境、动植物的生长发育，进而通过食物链影响人类身体健康。 

分子印迹技术(Molecular Imprinting Techniqe，MIT)是近年来出现的制备具有识别功能的聚合物材料的新技术，可获得在空间结构和结合位点上与某一分子完全匹配的分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymers，MIPs)。这一技术已经应用于单一目标化合物的固相萃取柱制备，但是同时用于多种化合物分离的分子印迹固相萃取柱制备方法少见报道。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种三嗪类抗球虫药物复合分子印迹聚合物的制备方法和应用，以提供一种可同时分离DIC和TOL两种化合物的分子印迹固相萃取技术。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

一种三嗪类抗球虫药物复合分子印迹聚合物的制备方法，包括以下步骤： 

(1)以地克珠利DIC为模板分子I，妥曲珠利TOL为模板分子II，四氢呋喃为致孔剂，其中，以每20mL致孔剂计，加入质量不大于0.204g的DIC和质量不大于0.213g的TOL于致孔剂中进行溶解，再加入0.084～0.588mL的功能单体甲基丙烯酸MAA，于室温下超声振荡30min进行反应，使模板分子I和II与功能单体充分结合，然后加入2.53～10.12mL的交联剂季戊四醇三丙烯酸酯PETA和0.123g的引发剂偶氮二异丁腈AIBN，混匀，超声震荡15min，最后在氮气保护下置60℃中加热16h，得到白色固体聚合物； 

(2)将步骤(1)的白色固体聚合物粉碎，获得聚合物粉末，用洗脱剂洗脱聚合物粉末中的模板分子I和II，再置于60℃下干燥，得到以DIC和TOL为虚拟模板的印迹聚合物DIC&TOL MIPs。 

所述步骤(1)中，模板分子I、模板分子II、功能单体、交联剂与引发剂的摩尔比为 0.5：0.5：4：20：3。 

所述步骤(2)中，洗脱剂为体积比为8：2或7：3的乙腈/水溶液，或体积比为7：2：1或6.5：2：1.5或6：3：1的乙腈/水/乙酸溶液，或体积比为8：2或7：3的甲醇/水溶液，进一步优选地，所述洗脱剂为体积比为6：3：1的乙腈/水/乙酸溶液。 

本发明还提供了一种固相萃取柱填料，所述填料由上述方法制备获得的印迹聚合物DIC&TOL MIPs和硅藻土按照质量比为1：1混合组成，用于固相萃取柱的制备。 

本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种三嗪类抗球虫药物复合分子印迹聚合物的制备方法和应用，以两种三嗪类抗球虫药物DIC和TOL为复合模板分子，制备获得复合分子印迹聚合物，再将该印迹聚合物与硅藻土等质量混合，获得一种能够对DIC和TOL均有良好识别能力的固相萃取柱填料；本发明中，致孔剂、功能单体、交联剂和引发剂的特异性选择是关键，克服了现有技术中分子印迹技术只能应用于单一目标化合物的固相萃取柱制备，而不能同时用于多种化合物分离的固相萃取柱制备的技术问题。 

附图说明

图1为非分子印迹聚合物NMIPs的红外光谱图； 

图2为DIC&TOL MIPs的红外光谱图； 

图3为NMIPs的扫描电镜SEM图； 

图4为洗脱剂洗脱前聚合物粉末的扫描电镜SEM图； 

图5为洗脱剂洗脱后DIC&TOL MIPs的扫描电镜SEM图； 

图6为添加DIC&TOL混合标准液的鸡饲料样品经DIC&TOL MISPE柱吸附前后的色谱曲线图。 

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。 

实施例1 

(1)分别比较甲醇、乙腈、N，N-二甲基酰胺、四氢呋喃，考察不同溶剂对DIC、TOL和MAA的溶解效果，结果显示，DIC和MAA不溶于甲醇，难溶于乙腈，微溶于N，N-二甲基酰胺和四氢呋喃，而TOL不溶于水，可溶于上述四种溶剂，在四氢呋喃中最易溶，因此，可选择四氢呋喃作为制备DIC和TOL复合分子印迹聚合物的致孔剂。本实施例中，称取0.204g的DIC(0.5mmol)和0.213g的TOL(0.5mmol)溶于20mL的四氢呋喃中，获得复合模板分子的四氢呋喃溶液。 

(2)比较功能单体MAA与模板分子I和II用量之比的影响：在步骤(1)的复合模板分 子的四氢呋喃溶液中添加功能单体MAA，其中，DIC和TOL等摩尔比混合，为复合模板分子，考察功能单体与复合模板分子的摩尔比为1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1时功能单体和复合模板分子之间的相互作用。在复合模板分子的四氢呋喃溶液中，复合模板分子与功能单体充分结合，用紫外可见分光光度计于240nm处测定复合模板分子的四氢呋喃溶液中剩余复合模板分子的吸光度值分别为0.556，0.466，0.390，0.247，0.245，0.243和0.234。 

从吸光度值可看出，当随着功能单体量的增加，吸光度不断下降，说明复合模板分子与功能单体相互作用形成主客体复合物的程度越来越充分，当功能单体与模板分子的摩尔比由4：1再增多时，吸光度变化不再明显，说明此时复合模板分子与功能单体已经作用充分，而多余的功能单体会发生自身缔合，形成非特异性的结合位点，使得吸附传质阻力增加，不利于制备印迹聚合物，所以功能单体与复合模板分子的摩尔比4：1时最佳，因此，选择DIC，TOL与功能单体的摩尔比为0.5：0.5：4作为复合模板分子与功能模板之间的最佳配比。 

因此，本实施例中，在上述步骤(1)的复合模板分子的四氢呋喃溶液中加入0.344mL(4mmol)的功能单体MAA，于室温超声震荡30min，使DIC和TOL与功能单体充分结合，获得DIC-TOL-MAA主客体复合物。 

(3)比较交联剂PETA用量的影响：将PETA与复合模板分子按照摩尔比为10：1、20：1、30：1、40：1添加入步骤(1)的DIC-TOL-MAA主客体复合物中，同时每1mmol复合模板分子中加入0.123g的引发剂AIBN，混匀，超声震荡15min，最后在氮气保护下置60℃水浴中加热16h，得到白色固体聚合物，将白色固体聚合物粉碎，得到聚合物粉末，用质量比为7：3的乙腈/水溶液洗脱聚合物粉末中的DIC和TOL，再置于60℃下干燥，获得DIC和TOL复合分子印迹聚合物DIC&TOL MIPs。 

分析上述四组不同比例下的DIC&TOL MIPs对DIC和TOL的结合程度：分别称取20mg上述四组不同比例下制备的DIC&TOL MIPs各2份，每份中分别加入1.0mmol/L的DIC标准溶液和1.0mmol/L的TOL标准溶液各2mL，震荡吸附1.5h后，测定标准溶液中剩余DIC或TOL的含量，计算印迹聚合物的吸附量，具体结果如下表1所示： 

表1：不同用量的交联剂对复合分子印迹聚合物的吸附程度的影响 

从表1中可知，随着交联剂PETA用量的增加，DIC&TOL MIPs对TOL的吸附量的变化较 大，对DIC的吸附量的变化较小，当PETA与复合模板分子的摩尔比为20：1时，无论是对DIC还是TOL，其吸附量都达到最大，因此，选择PETA与复合模板分子的摩尔比为20：1，即模板分子I、模板分子II和PETA的摩尔比为0.5：0.5：20为最佳配比。 

经测定不同配比的复合模板分子、功能单体、交联剂对印迹聚合物吸附性的影响，最终确立了模板分子I、模板分子II、功能单体和交联剂的摩尔比为0.5：0.5：4：20为最佳配比。 

(4)对比不同洗脱剂对复合模板分子的洗脱效果的影响：将步骤(2)的DIC-TOL-MAA主客体复合物中加入PETA和AIBN，其中每1mmol的复合模板分子中加入20mmol的PETA和0.123g的AIBN，混匀，超声震荡15min，最后在氮气保护下置60℃水浴中加热16h，得到白色固体聚合物，将白色固体聚合物粉碎，得到聚合物粉末； 

对比甲醇/水(8/2，指体积比，下同)、甲醇/水(7/3)、甲醇/水/乙酸(7/2/1)、乙腈/水(8/2)、乙腈/水(7/3)、乙腈/水/乙酸(7/2/1)、乙腈/水/乙酸(6.5/2/1.5)、乙腈/水/乙酸(6/3/1)八种溶液对聚合物粉末中模板分子I和II的去除效果，结果表明，甲醇/水(8/2)、甲醇/水(7/3)、乙腈/水(8/2)、乙腈/水(7/3)、乙腈/水/乙酸(6.5/2/1.5)去除模板分子DIC的能力依次提高，但去除TOL的能力皆较差；乙腈/水/乙酸(7/2/1)、甲醇/水/乙酸(7/2/1)、乙腈/水/乙酸(6/3/1)去除模板分子TOL的能力较好，并以乙腈/水/乙酸(6/3/1)为最好，所以本实施例中选择乙腈/水/乙酸(6/3/1)作为除去模板的洗脱剂，获得DIC和TOL复合分子印迹聚合物。 

称取聚合物粉末1.5g于索氏提取器中，在索氏提取器的圆底烧瓶中加入200mL的乙腈/水/乙酸(6/3/1)，93℃水浴使之回流洗脱，每3h取索氏提取器中液体以及圆底烧瓶中溶液，用紫外分光光度计于240nm处检测，直至索氏提取器中DIC和TOL分子全部转移到圆底烧瓶中为止，结果表明，24h后索氏提取器中的模板分子DIC和TOL已完全转移到圆底烧瓶中。回收索氏提取器中的去除模板分子的聚合物粉末，置于60℃烘箱中干燥，得到DIC和TOL复合分子印迹聚合物DIC&TOL MIPs。 

(5)非分子印迹聚合物NMIPs与分子印迹聚合物MIPs的结果比较： 

以KBr为底样，使用傅里叶红外光谱检测上述步骤(4)获得的DIC&TOL MIPs及其非分子印迹聚合物NMIPs的红外光谱，在波数范围4000～400cm^-1内测定，得到如图1和2所示的红外谱图，图中可以看出DIC&TOL MIPs较其NMIPs在2515cm^-1附近出现铵盐中-NH⁺的伸缩振动峰；665cm^-1附近出现卤化物-C-Cl-的伸缩振动峰，联系模板分子的化学结构式，这2个峰的出现说明了DIC&TOL MIPs与复合模板分子作用位点发生在氮氢键以及卤代烃位置。此外，对比DIC&TOL MIPs和其NMIPs红外光谱图，发现图形大体走向一致，只是部分几个伸缩振动 峰值整体迁移，证明DIC&TOL MIPs达到了复合模板的全部去除。 

使用S-4800型扫描电子显微镜观察DIC&TOL MIPs和其NMIPs的表观形态，得到如图3～5所示的电镜结构图，结果表明，洗脱前聚合物粉末和NMIPs表面孔穴较少，质地较为紧密；而洗脱后的DIC&TOL MIPs表面粗糙，孔穴较大较多，质地疏松。分析此三者的电镜图可以看出，表面粗糙的聚合物所具有大量的孔穴为复合模板分子被洗脱后所留下，这种孔穴有利于底物分子与分子印迹聚合物的结合，从而使该分子印迹聚合物有较高的负载量且对底物有较高识别性。 

采用Scatchard分析法测定了DIC&TOL MIPs和NMIPs对底物分子的结合量，结果表明，DIC&TOL MIPs对底物分子的结合量明显地大于NMIPs对底物分子的结合量，说明印迹过程中模板分子在DIC&TOL MIPs中留下的结合位点决定了DIC&TOL MIPs对模板分子高的亲和性和特异识别性。 

(6)比较质量比1：2、2：3、1：1、2：1的DIC&TOL MIPs和硅藻土的装填效果：比较样品溶液通过分子印迹固相萃取柱(MISPE)的速率以及对模板分子的吸附效果，结果见表2： 

表2：分子印迹聚合物固相萃取柱制备条件的选择 

由表2可以看出，当DIC&TOL MIPs与硅藻土比例为2:1时MISPE柱对DIC的吸附效果较佳，比例为1:1时MISPE柱对TOL的吸附效果较佳。考虑到比例为2:1时溶剂及样品过柱速率过慢，配比为1:2和2:3时虽然样品过柱速率较快但吸附量较低，最终确定聚合物与硅藻土的配比为1:1。 

DIC和TOL复合分子固相萃取柱的制备：称取60mg的DIC&TOL MIPs及60mg的硅藻土，装入3mL空的固相萃取小柱(SPE)中，用筛板压紧，继续轻敲小柱，直至筛板与聚合物结合紧密为止。 

实施例2 

(1)称取不大于0.204g的模板分子I地克珠利(DIC)和不大于0.213g的模板分子II妥曲珠利(TOL)溶解于20mL的四氢呋喃中，加入0.336mL的功能单体甲基丙烯酸MAA，于室温下超声振荡30min，使模板分子I和II与功能单体充分结合；然后加入5.06mL的交联剂PETA；再加入0.123g的偶氮二异丁腈AIBN，混合均匀，超声振荡15min，在N₂保护下置 60℃水浴中加热16h，得到白色固体聚合物； 

(2)将步骤(1)的白色固体聚合物粉碎，研磨过200目筛，用体积比为6:3:1的乙腈/水/乙酸溶液洗脱聚合物中的模板分子(DIC&TOL)，收集产物于烘箱中60℃干燥，得到以DIC和TOL为复合模板的分子印迹聚合物(DIC&TOL MIPs)。 

(3)称取60mg步骤(2)的DIC&TOL MIPs及60mg的硅藻土，配成固相萃取柱填料，在3mL固相萃取小柱空管中自下而上依次装入筛板和填料，敲实并使表面平齐，上面再加入一层筛板，装填高度约为0.5cm，制成DIC&TOL MISPE柱。DIC&TOL MISPE柱先用2mL甲醇和3mL水进行活化，再取1mL的DIC标准溶液或TOL标准溶液过柱，用5mL正己烷淋洗，弃淋洗液，然后用5mL的乙腈/水/乙酸(体积比为6:3:1)溶液进行洗脱，收集洗脱液，用旋转蒸发仪吹干，用1mL的体积百分比为60％的乙腈/水溶液溶解，过0.22μm微孔滤膜后制得上HPLC检测液。 

(4)准确称取5.000g(精确到0.001g)经粉碎后的空白鸡饲料样品，置于50mL离心管中，并加入10mL四氢呋喃和40mL甲醇，超声30min，再以5000r/min离心15min，取离心管中上清液25mL，于50℃旋转蒸发，后加入1mL甲醇溶解，得到样品提取液，过滤样品提取液，获得的滤液中加入不同浓度梯度的DIC&TOL混合标准液，然后倒入经过活化后的DIC&TOLMISPE柱进行吸附，经淋洗、洗脱后收集洗脱液，使用旋转蒸发仪蒸干后用60％乙腈水溶解定容至10.0mL，过0.22μm微孔滤膜，滤液供HPLC检测，其HPLC检测结果如图6所示，其中，上部曲线为添加DIC&TOL混合标准液的鸡饲料样品的吸附前的色谱曲线图，下部曲线为添加DIC&TOL混合标准液的鸡饲料样品的吸附后的色谱曲线图。 

(5)由图6可知，将粉碎后的鸡饲料样品用DIC&TOL MISPE柱进化后，经HPLC检测，取得了良好的进化效果。 

为了验证鸡饲料中三嗪类药物添加量监控前处理方法的准确性进行了加标回收实验，分别向空白鸡饲料样品中添加2mg/L、5mg/L和10mg/L的DIC&TOL混合标准液，按本实施例的步骤(4)的方法进行提取和净化，然后用HPLC进行检测，每个添加组水平重复测定6次(n＝6)，结果见表3： 

表3：DIC和TOL在饲料中的添加回收率及精密度检测 

从表3可以看出，经DIC&TOL MISPE柱处理后，DIC在饲料中的回收率为88.8％～96.6％，RSD<8.9％；TOL在饲料中的回收率为70.9％～77.5％，RSD<7.0％，符合药物残留分析要求。