一种用于美白祛斑的秋茄叶总黄酮纳米乳及其凝胶

摘要

本发明涉及一种用于美白祛斑的秋茄叶总黄酮纳米乳及其凝胶，所述纳米乳由如下重量份的组分组成：秋茄叶总黄酮0.3~0.65份，油相2.5~5份，乳化剂1.4~6份，助乳化剂1.4~6份，水40~160份，秋茄叶总黄酮纳米乳的平均粒径小于等于100nm；所述凝胶由如下重量百分比的组分组成：凝胶骨架材料0.2%～0.8%，甘油2%～8%，余量为本发明的秋茄叶总黄酮纳米乳。本发明的秋茄叶总黄酮纳米乳及其凝胶，首次采用高纯度的秋茄叶总黄酮为活性成分，同时具有抑制黑色素生成、抑制酪氨酸酶活性、抗氧化和抗紫外能力，可不需再添加其他成分就可起到良好的美白祛斑作用，秋茄叶总黄酮纳米乳及其凝胶稳定性好，进行离心、高温、低温试验，均不分层。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于美白祛斑的秋茄叶总黄酮纳米乳及其凝胶，属于化妆品及其制备技术领域。

背景技术

皮肤黑色素沉着是一种常见的多发性皮肤疾病。包括黄褐斑、老年斑、雀斑等，引起皮肤黑色素沉着的原因主要为人体内分泌失调，新陈代谢功能减弱等，其次日晒、紫外线辐射、睡眠不足会加重色素沉着。皮肤外用美白祛斑成分主要从以下几个途径发挥作用：抑制酪氨酸酶合成及活性，还原皮肤色素，化学剥脱，减少外源性因素如紫外线、氧自由基等对黑色素形成生理过程的负面影响。目前美白祛斑的化妆品多为分别具有以上功效的成分组合，如已授权的中国发明专利ZL 200910037765.1的公开了一种三联整合皮肤外用祛斑功效纳米乳及其制备方法，详细描述了多种功效成分配合起到祛斑作用。

然而，目前市场上的化妆品中的美白祛斑成分多为化学合成的成分，对人体皮肤有一定的刺激性，安全性也存在一定的问题。因此近年来，人们对化妆品的质量和安全越来越重视，以天然植物提取物为主要成分的化妆品安全高效，成为化妆品开发的趋势。秋茄（Kandelia candel）为红树科秋茄属植物，本属只有一种，即为秋茄，为红树植物分类中的真红树植物，秋茄中的化学成分主要有黄酮类、鞣质类、甾醇类、脂肪酸和多糖等，本申请的发明人从秋茄叶里提取分离到高纯度的秋茄叶总黄酮（≥60%），经试验研究表明秋茄叶总黄酮同时具备较好的抑制黑色素生成、抑制酪氨酸酶活性、抗氧化和抗紫外能力。此外，秋茄叶总黄酮的活性及应用尚无文献报道，仅在申请号为200610122710.7的中国发明专利中公开了一种含牡蛎壳粉的海洋药物美容防晒霜，的背景技术里提到红树林提取物黄酮类化合物具有很强的紫外吸收能力，但是该专利里以及经查阅文献，没有查到任何相关试验报道，更无秋茄总黄酮抑制黑色素生成、抑制酪氨酸酶活性及用于美白祛斑化妆品的报道。秋茄叶活性黄酮用于美白祛斑化妆品的发明，为海洋红树植物秋茄的开发利用及深加工奠定了基础。

皮肤表皮由角质层、颗粒层、棘层、基底层组成，黄褐斑及其他色素沉着虽然是表现在颜面上，但黑色素是沉着在基底层，因此美白祛斑活性成分要穿过严密的重重屏障才能到达基底层发挥作用。化妆品传统的剂型如普通乳液、乳膏剂、霜剂、面膜等，由于采用的是传统技术，不能保证活性成分能有效地到达基底层，并持续地发挥作用。而且天然植物提取物粉末在化妆品里常以混悬物的形式存在，不能有效地溶解分散，大大限制了其穿透皮肤的能力。纳米乳是由水、油、表面活性剂和助表面活性剂等自发形成，粒径为10～100nm的热力学稳定、各向同性，透明或半透明的均相分散体系，容易通过生物膜，透皮性能好，能在皮肤内形成有效成分的贮库，实现靶向、缓释的作用。例如专利号为ZL200910037765.1的中国发明授权专利中也提及了外用祛斑化妆品制备为纳米乳，但该技术方案的不足之处在于：该专利用的都是可以溶在水相或油相的单体成分，天然植物提取物多为多种成分的混合物，特别是一定浓度的乙醇提取物，往往在水相和油相溶解度都不好，做成纳米乳难度较大。

发明内容

本发明的一个目的在于解决现有的不足，提供一种用于美白祛斑的秋茄叶总黄酮纳米乳。

本发明的另一个目的在于提供一种由上述纳米乳制成的凝胶。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 

一种用于美白祛斑的秋茄叶总黄酮纳米乳，由如下重量份的组分组成：秋茄叶总黄酮 0.3~0.65份，油相2.5~5份，乳化剂1.4~6份，助乳化剂1.4~6份，水40~160份，秋茄叶总黄酮纳米乳的平均粒径小于等于100nm。

作为优选，秋茄叶总黄酮纳米乳由以下重量份的组分组成：秋茄叶总黄酮0.4~0.6份，油相3.5~4.5份，乳化剂2~5.2份，助乳化剂2~5.2份，水40～100份。

作为优选，所述油相为肉豆蔻酸异丙酯；所述乳化剂为吐温-80和司盘-80的混合物；所述助乳化剂选自聚乙二醇400、1,2-丙二醇、甘油中的一种或几种。

作为优选的，所述乳化剂为质量比1.5:1~1.9:1的吐温-80与司盘-80的混合物，助乳化剂优选为聚乙二醇400。本申请的发明人比较了秋茄叶总黄酮在几种常用油相中的溶解度，大小顺序为肉豆蔻酸异丙酯>大豆油>辛葵酸三甘油酯>中链甘油三酯>油酸乙酯，因此优选肉豆蔻酸异丙酯为油相。此外，发明人筛选了1,2-丙二醇、甘油、聚乙二醇400、正丁醇、异丙醇等乳化剂，发现以聚乙二醇400为助乳化剂，与以吐温-80和司盘-80的混合物为乳化剂，搭配后制备的纳米乳效果最好。

更优选的，乳化剂为质量比1.7:1~1.8:1的吐温-80与司盘-80混合物。由于秋茄叶总黄酮的性质特殊，在水和油相的溶解度都不好，要形成透明澄清有乳光稳定的纳米乳，必须有合适的HLB值的乳化剂，在经过大量的试验筛选，乳化剂以吐温-80和司盘-80混合使用才能形成纳米乳，吐温-80和司盘-80的质量比如前所述。

作为优选，所述秋茄叶总黄酮为秋茄叶的提取物，其纯度大于等于60%，该秋茄叶总黄酮的提取与纯化方法如下：秋茄叶粗粉在70~80℃，用15倍体积分数为60%～70%的乙醇溶液提取2次，每次0.5 h，合并提取液，提取液浓缩到5～6mg/L，离心，取上清液，采用HPD722或HPD100或HPD826大孔吸附树脂柱纯化，以2~3BV/h的上样速度将6~7 BV的上清液加入大孔树脂柱，吸附30min，用一定体积的蒸馏水洗去水溶性杂质，再用体积分数35%～80%乙醇洗脱，洗脱流速为3～6BV/h，洗脱剂用量为4 BV树脂柱体积以上，收集洗脱液，洗脱液减压回收溶剂后，真空或冷冻干燥，粉碎，即得黄棕色秋茄叶总黄酮。

用于美白祛斑的秋茄叶总黄酮纳米乳的制备方法，所述制备方法如下：将配方量的乳化剂、助乳化剂置于容器中，磁力搅拌1~2min后加入配方量的油相，搅拌1~2min，然后加入配方量的秋茄叶总黄酮，搅拌5~8min，最后慢慢加入配方量的水，继续搅拌至混合物呈透明状，获得秋茄叶总黄酮纳米乳。

一种用于美白祛斑的秋茄叶总黄酮纳米乳凝胶，由如下重量百分比的组分组成：凝胶骨架材料0.2%～0.8%，甘油2%～8%，余量为如前所述的秋茄叶总黄酮纳米乳。

作为优选，用于美白祛斑的秋茄叶总黄酮纳米乳凝胶由如下重量百分比的组分组成：凝胶骨架材料为0.3%～0.6%，甘油3%～6%，余量为如前所述的秋茄叶总黄酮纳米乳。

作为优选，凝胶骨架材料选自卡波姆940。

作为优选，用于美白祛斑的秋茄叶总黄酮纳米乳凝胶经由如下方法制备而成：取凝胶骨架材料，加入甘油润湿，再加入秋茄叶总黄酮纳米乳，搅拌均匀后放置12 h，充分溶胀后，加入三乙醇胺调节pH到6.0~6.5，即得。

本发明通过对秋茄叶总黄酮进行活性实验研究，发现如下结果：

（1）秋茄叶总黄酮对B16小鼠黑色素瘤细胞黑素含量的影响

由附图1可见，秋茄叶总黄酮对B16黑色素瘤细胞具有明显地抑制黑色素合成作用，且随着浓度的增大，抑制率逐渐增大。

（2）秋茄叶总黄酮体外对酪氨酸酶抑制作用考察结果

由附图2可见，秋茄叶总黄酮对酪氨酸酶的抑制作用虽然不如抗坏血酸和曲酸，但也具有较强的抑制酪氨酸酶的活性。且随着浓度的增加，抑制率逐渐增大。

（3）抗氧化能力

①秋茄叶总黄酮对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·）自由基的清除能力

如附图3-1和3-2所示，秋茄叶总黄酮对DPPH·有明显的抑制作用，其清除率在0～50 μg/mL的浓度范围内上升明显。当浓度为50 μg/mL清除率达到平台。由结果可见，秋茄叶总黄酮50 μg/mL对DPPH·的清除能力相当于20 μg/mL抗坏血酸（Vc）。

②秋茄叶总黄酮总酚含量测定

以没食子酸为对照品制备总酚标准曲线，测定秋茄叶总黄酮中总酚含量，结果如下：

表1  秋茄叶总黄酮中总酚含量测定结果

从表1可见，秋茄叶总黄酮中总酚含量较高，多酚物质多具有较高的抗氧化活性，这也证明了秋茄叶总黄酮的抗氧化活性较好。

（4）抗紫外作用

采用体外SPF值测定法中的溶剂法来考察秋茄叶总黄酮抗紫外的性能。将秋茄叶总黄酮和阳性对照自然堂防晒霜溶解、稀释、过滤后测定290~400 nm的吸光度，计算SPF值。

表2  SPF值测定结果

秋茄浓度（μg/mL）SPF值自然堂防晒霜浓度(μg//mL)SPF值252.252326.04754.1834816.7412513.5546430.76

由表2可见，秋茄叶总黄酮具有较好的抗紫外活性。黄酮浓度越高，其SPF值也越大。

本发明提供的一种用于美白祛斑的秋茄叶总黄酮纳米乳及其凝胶，其有益效果是： 

（1）本发明的秋茄叶总黄酮纳米乳，首次采用高纯度的秋茄叶总黄酮为活性成分，同时具有抑制黑色素生成、抑制酪氨酸酶活性、抗氧化和抗紫外能力，可不需再添加其他成分就可起到良好的美白祛斑作用。

（2）秋茄叶总黄酮纳米乳及其凝胶稳定性好，进行离心、高温、低温试验，均不分层。

（3）秋茄叶总黄酮纳米乳及其凝胶的pH值为6.0~6.5，符合皮肤弱酸性的要求。

（4）形成的纳米级乳滴粒径在70～100nm，可有效地穿过皮肤表皮，并在皮肤中滞留，提高疗效。

（5）将纳米乳制成纳米乳凝胶，能提高微乳制剂的黏度，增加在皮肤上的黏附性，起到缓慢释放药物，提高疗效的作用，以卡波姆940制得的秋茄叶总黄酮纳米乳凝胶外观、稠度、稳定性等最为适宜，该纳米乳凝胶的pH值为6.0~6.5，符合皮肤外用制剂弱酸性的要求，进行离心、高温、低温试验，该纳米乳凝胶均不分层，说明制得的秋茄叶总黄酮纳米乳凝胶性质稳定。

（6）秋茄叶总黄酮纳米乳及凝胶家兔皮肤及眼刺激性试验结果均显示为阴性，表明其无皮肤及眼刺激性，使用安全。

附图说明

图1为不同浓度秋茄叶总黄酮对B16细胞黑色素合成抑制率折线图；

图2为秋茄叶总黄酮体外抑制酪氨酸酶的考察结果折线图；

图3-1为 Vc对DPPH·的清除能力折线图；

图3-2为秋茄叶总黄酮对DPPH·的清除能力折线图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

秋茄叶总黄酮含量测定采用NaNO₂-Al(NO₃)₃-NaOH法，具体操作为：用60%乙醇稀释和定容样品，加入0.6 mLNaNO₂溶液（5%）摇匀后立即加入0.6 mLAl(NO₃)₃溶液（10%），摇匀后放置6 min，加入6 mLNaOH溶液（1 mol/L）后立即在波长500 nm处测定吸光度。

实施例1：制备本发明所用的高纯度秋茄叶总黄酮

（1）提取：取秋茄叶粉碎成粗粉，取1000g，以体积分数60%的乙醇为提取剂，料液比1: 15（质量体积比），提取温度80 ℃，提取时间0.5 h，提取2次。

（2）分离纯化：以HPD722大孔吸附树脂对步骤（1）获得的秋茄叶总黄酮进行纯化，具体纯化工艺为：上样总黄酮浓度为5.0mg/mL，上样流速为3BV/h，上样量为6.5 BV树脂柱体积，吸附时间30 min，以3.5 BV水冲洗除杂，洗脱剂为体积分数50%的乙醇，洗脱流速为3BV/h，洗脱剂用量为4 BV树脂柱体积，收集乙醇液，减压回收溶剂，真空干燥，粉碎，得到黄棕色秋茄叶总黄酮粉末94.51g，总黄酮含量为77.58%。

实施例2：制备本发明所用的高纯度秋茄叶总黄酮

（1）提取：取秋茄叶粉碎成粗粉，取1000g，以体积分数70%的乙醇为提取剂，料液比1: 15（质量体积比），提取温度70℃，提取时间0.5 h，提取2次。

（2）分离纯化：以HPD100大孔吸附树脂对步骤（1）获得的秋茄叶总黄酮进行纯化，具体纯化工艺为：上样总黄酮浓度为6.0mg/mL，上样流速为2BV/h，上样量为6BV树脂柱体积，吸附时间30 min，以4BV水冲洗除杂，洗脱剂为体积分数80%的乙醇，洗脱流速为6BV/h，洗脱剂用量为4 BV树脂柱体积，收集乙醇液，减压回收溶剂，真空干燥，粉碎，得到黄棕色秋茄叶总黄酮粉末93.2g，总黄酮含量为72.5%。

实施例3：制备本发明所用的高纯度秋茄叶总黄酮

（1）提取：取秋茄叶粉碎成粗粉，取1000g，以体积分数65%的乙醇为提取剂，料液比1: 15（质量体积比），提取温度78℃，提取时间0.5 h，提取2次。

（2）分离纯化：以HPD826大孔吸附树脂对步骤（1）获得的秋茄叶总黄酮进行纯化，具体纯化工艺为：上样总黄酮浓度为4.0mg/mL，上样流速为3BV/h，上样量为7BV树脂柱体积，吸附时间30 min，以3BV水冲洗除杂，洗脱剂为体积分数35%的乙醇，洗脱流速为3BV/h，洗脱剂用量为4 BV树脂柱体积，收集乙醇液，减压回收溶剂，真空干燥，粉碎，得到黄棕色秋茄叶总黄酮粉末90.51g，总黄酮含量为70.1%。

实施例4：制备用于美白祛斑的秋茄叶总黄酮纳米乳

称取吐温-80 8.4g，司盘-80 5.6g，聚乙二醇400 21g于玻璃烧杯中，磁力搅拌1～2min，加入肉豆蔻酸异丙酯 25g，搅拌1～2min，然后加入实施例1制得的秋茄叶总黄酮（总黄酮含量为77. 58 %）3g，搅拌5～8min，慢慢加入配方量的水400g，继续搅拌至秋茄叶总黄酮纳米乳呈透明状，其平均粒径为99.5 nm。

实施例5：制备用于美白祛斑的秋茄叶总黄酮纳米乳

称取吐温-80 39.31g，司盘-80 20.69g，聚乙二醇400 60g于玻璃烧杯中，磁力搅拌1～2min，加入肉豆蔻酸异丙酯 50g，搅拌1～2min，然后加入实施例1制得的秋茄叶总黄酮（总黄酮含量为77. 58 %）6.5g，搅拌5～8min，慢慢加入配方量的水1600 g，继续搅拌至秋茄叶总黄酮纳米乳呈透明状，其平均粒径为89.7 nm。

实施例6：制备用于美白祛斑的秋茄叶总黄酮纳米乳

称取吐温-80 12.6g，司盘-80 7.4g，聚乙二醇400 14g于玻璃烧杯中，磁力搅拌1～2min，加入肉豆蔻酸异丙酯 25g，搅拌1～2min，然后加入实施例1制得的秋茄叶总黄酮（总黄酮含量为77. 58 %）4g，搅拌5～8min，慢慢加入配方量的水1000 g，继续搅拌至秋茄叶总黄酮纳米乳呈透明状，其平均粒径为85.7 nm。

实施例7：制备用于美白祛斑的秋茄叶总黄酮纳米乳

称取吐温-80 28.64g，司盘-80 16.36g，聚乙二醇400 45g于玻璃烧杯中，磁力搅拌1～2min，加入肉豆蔻酸异丙酯 40g，搅拌1～2min，然后加入实施例1制得的秋茄叶总黄酮（总黄酮含量为77. 58 %）5g，搅拌5～8min，慢慢加入配方量的水800 g，继续搅拌至秋茄叶总黄酮纳米乳呈透明状，其平均粒径为81.6 nm。

上述秋茄叶总黄酮纳米乳稳定性考察结果：实施例4～7的秋茄叶总黄酮纳米乳均以 4000 r/min速度离心5 min，未见分层、沉淀、浑浊等现象，秋茄叶总黄酮纳米乳溶液均保持澄清透明，都能被水无限稀释，说明秋茄叶总黄酮纳米乳为O/W型且性状良好，pH值为6.0，符合皮肤外用制剂弱酸性的特点。

实施例8：制备用于美白祛斑的秋茄叶总黄酮纳米乳的凝胶

取卡波姆940 0.2g，加入2g甘油润湿，加入按实施例4制备的秋茄叶总黄酮纳米乳97.8g，搅拌均匀后，放置12 h，待充分溶胀后，加入三乙醇胺调节pH，即得到秋茄叶总黄酮纳米乳凝胶，所述秋茄叶总黄酮纳米乳凝胶加水稀释后测得的pH值为6.0。

实施例9：制备用于美白祛斑的秋茄叶总黄酮纳米乳的凝胶

取卡波姆9400.8g，加入8g甘油润湿，加入按实施例5制备的秋茄叶总黄酮纳米乳91.2g，搅拌均匀后，放置12 h，待充分溶胀后，加入三乙醇胺调节pH，即得到秋茄叶总黄酮纳米乳凝胶，所述秋茄叶总黄酮纳米乳凝胶加水稀释后测得的pH值为6.5。

实施例10：制备用于美白祛斑的秋茄叶总黄酮纳米乳的凝胶

取卡波姆940 0.3g，加入6g甘油润湿，加入按实施例6制备的秋茄叶总黄酮纳米乳93.7g，搅拌均匀后，放置12 h，待充分溶胀后，加入三乙醇胺调节pH，即得到秋茄叶总黄酮纳米乳凝胶，所述秋茄叶总黄酮纳米乳凝胶加水稀释后测得的pH值为6.3。

实施例11：制备用于美白祛斑的秋茄叶总黄酮纳米乳的凝胶

取卡波姆940 0.4g，加入4g甘油润湿，加入按实施例7制备秋茄叶总黄酮纳米乳95.6g，搅拌均匀后，放置12 h，待充分溶胀后，加入三乙醇胺调节pH，即得到秋茄叶总黄酮纳米乳凝胶，所述秋茄叶总黄酮纳米乳凝胶加水稀释后测得的pH值为6.3。

实施例8至11的纳米乳凝胶进行以下稳定性考察考察：

①离心试验：称取纳米乳凝胶5 g，置于10 ml离心管中，4000 rpm离心30 min，观察凝胶剂的外观和涂展性变化。

②耐寒试验：取纳米乳凝胶适量，置于称量瓶中密封，放入-20 ℃冰箱中，24 h后取出，恢复室温，观察外观、涂展性和pH值的变化。

③耐热试验：取纳米乳凝胶适量，置于称量瓶中密封，放入60 ℃烘箱中，24 h后取出，恢复室温，观察外观、涂展性和pH值的变化。

结果，实施例8～11的秋茄叶总黄酮纳米乳凝胶经离心、高温、低温试验，均不分层，性状和涂展性都未发生变化。

验证例1

实施例5和7的秋茄叶总黄酮纳米乳和实施例9和11的秋茄叶总黄酮纳米乳凝胶进行透皮研究实验：

1、实验步骤：

（1）鼠皮制备：取健康雄性小白鼠(20 g左右)，用剪刀仔细剪去腹部皮肤上的毛，拉颈处死，剥离腹部皮肤。将剥离下来的皮肤平铺于玻璃板上，角质层向下，用单背刀片小心剔除皮下脂肪和粘连物，然后用生理盐水反复冲洗干净，剪成适当的大小，并检查皮肤的完整性。每次实验前，检查鼠皮的完整性，不得有任何破损。

（2）体外透皮试验：采用改良Franz扩散池，将处理好的小鼠腹部皮肤固定在供给池和接受池之间，角质层面向上，有效透皮面积为3.14 cm2。接收液为生理盐水，体积10.4 mL。加样后分别于1、2、4、6、8、10、12、24 h取样1 mL，用生理盐水补足，样品用NaNO₂-Al(NO₃)₃-NaOH络合法测定总黄酮含量。

2、实验结论

实施例5的秋茄叶总黄酮纳米乳在6 h透过的样品测到微量黄酮含量，实施例7的秋茄叶总黄酮纳米乳在8 h透过的样品测到微量黄酮含量，实施例9的秋茄叶总黄酮纳米乳凝胶在1~12 h内取的样品经显色都没有黄酮含量，实施例11的秋茄叶总黄酮纳米乳凝胶在1~16 h内取的样品经显色都没有黄酮含量，说明在此期间药物没有或者是极少量地透过皮肤，因而采用紫外分光光度法无法检测到；所以由此判断，秋茄叶总黄酮纳米乳和纳米乳凝胶在皮肤滞留时间较长，且纳米乳凝胶粘着性强，在皮肤中的滞留时间更长。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。