鸡肉中妥曲珠利、妥曲珠利砜残留冻干粉标准样品的制法

摘要

本发明属于兽药残留检测的动物源基体标准样品技术领域，公开了一种鸡肉中妥曲珠利、妥曲珠利砜残留冻干粉标准样品的制备方法，该方法以妥曲珠利对鸡进行养殖添加，经代谢后控制时间使鸡体内含有妥曲珠利及代谢物妥曲珠利砜，将鸡宰杀，取胸部肌肉去皮沥血，加维生素C溶液匀浆制成肉糜，真空冷冻干燥，粉碎过筛，在厌氧工作站中充氮气包装，封口后再用铝箔袋将聚乙烯瓶进行真空封装，制备得到冻干粉标准样品。得到的样品可以在常温下运输，保质期长，目标物和基体结合情形与真实检测样品一致，可用于相关检测分析的质量控制，样品均匀稳定、运输方便、使用可靠、产品具有显著的经济价值和市场竞争力。

说明书

技术领域

本发明属于兽药残留检测的动物源基体标准样品技术领域，具体涉及一种鸡肉中妥曲珠利、妥曲珠利砜残留冻干粉标准样品的制备方法。 

背景技术

妥曲珠利，中文名称：甲基三嗪酮，百球清，英文名称： Toltrazuil，CAS 编号： 69004-03-1，分子式： C₁₈H₁₄F₃N₃O₄S，属三嗪酮化合物，具有广谱抗球虫活性，广泛用于鸡球虫病。妥曲珠利砜，中文名称: 帕托珠利，帕那珠利，英文名称: Toltrazuril sulfone ，Ponazuril，CAS号: 69004-04-2，分子式: C₁₈H₁₄F₃N₃O₆S。 

家禽内服妥曲珠利，约有50%以上药物吸收，吸收后药物主要汇集于肝脏、肾脏，迅速被代谢成妥曲珠利砜和妥曲珠利亚砜。妥曲珠利在仔鸡可食用组织中残留时间很长，停药24天后在胸肌中仍能测出残留药物，因此，美国至20世纪末仍未批准该产品上市。 

在食品安全检测体系中，文字标准和实物标准互为补充。基于近年来国际权威机构对食品安全检测标准样品越来越重视，与真实样品接近的实物标准样品将是以后发展的一个非常重要的方向。目前我国的文字标准相对完善，但实物标准特别是食品安全检测实物标样还很匮乏。 

动物基体兽药标准样品对实验室兽药残留检测质量控制体系有着极其重要的作用，是评价检测标准方法精密度和准确度的实物标准，是保证实验室检测质量，评价检测能力的科学、权威证据。以鸡肉为基体的妥曲珠利和妥曲珠利砜标准样品的研制可以在该类兽药残留检测中对方法的重复性、重现性和准确度进行检测确认，确保检测结果的准确性。 

发明内容

本发明是向动物体内饲喂一种药物，经动物体代谢，获得含有两种药物残留：原药及代谢物，即妥曲珠利及其代谢物妥曲珠利砜同时存在的实物标准样品。 

本发明的目的是提供一种鸡肉中妥曲珠利及其代谢物妥曲珠利砜残留冻干粉标准样品的制备方法，通过添加妥曲珠利养殖肉鸡，控制养殖时间，获得样品材料，并制备成一种均匀性好、稳定性好、易保存且目标物和基体结合情形与真实检测样品一致的标准样品；该标准样品可用于妥曲珠利、妥曲珠利砜等类药物残留检测质量控制、检测方法评价、检测能力评价。 

本发明鸡肉中妥曲珠利及其代谢物妥曲珠利砜残留冻干粉标准样品的制备方法： 

1、采用妥曲珠利对鸡进行养殖添加，经代谢后控制时间使鸡体内含有妥曲珠利及代谢物妥曲珠利砜，且两种药物浓度保持在同一数量级；

2、将鸡宰杀，取胸部肌肉去皮沥血，加维生素C溶液匀浆制成肉糜，真空冷冻干燥，粉碎过筛，在厌氧工作站中充氮气包装，封口后再用铝箔袋将聚乙烯瓶进行真空封装，制备得到冻干粉标准样品。

本发明的显著优点是：模拟养殖条件下对肉鸡添加妥曲珠利后选择适当时机，将肉鸡宰杀，取肌肉部分加维生素C溶液匀浆制成肉糜，冷冻干燥，粉碎过筛，充氮气封装、均匀性检验、稳定性研究和协同定值检测，获得预期含量的目标物结合状态与实际检测样品一致的含妥曲珠利及代谢物妥曲珠利砜的鸡肉阳性材料，采用搅碎和匀化介质相结合的工艺可以保证材料的均匀性，基质中加入维生素C、冷冻干燥、充氮气封装，可以保证样品中药物不降解、不被氧化。本发明的产品可以在常温下运输，保质期长，目标物和基体结合情形与真实检测样品一致，可用于相关检测分析的质量控制，样品均匀稳定、运输方便、使用可靠、产品具有显著的经济价值和市场竞争力。 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。 

实施例1，一种鸡肉中妥曲珠利及其代谢物妥曲珠利砜残留冻干粉标准样品的制备方法，本实施例以控制目标含量水平20-100ug/kg为例，其具体步骤如下： 

（1）实验动物的选择：市购肉鸡，要求个体大小均一、均重约2.5 kg，先确认肉鸡未被饲喂过妥曲珠利，随机取样，检测确认为阴性样品后进行喂养。正常饲养5天后，剔除受伤不健康的鸡。

（2）药物饲养：将妥曲珠利药粉准确称量0.2mg，装入胶囊中，每只鸡每天喂1颗胶囊，连喂2天，第2天停药后10小时宰杀，取胸肌肉检测，此时妥曲珠利及其代谢物妥曲珠利砜在鸡体内浓度相差不大，均为10-20 ug/kg之间。妥曲珠利砜在鸡体内代谢很快，时间掌握不准，两种药物的浓度上就会有很大差异，达不到预期理想的浓度。从标准样品在实验室应用的角度来看，两种药物的水平最好是控制在同一数量级，才更具实用性，因此药物的添加量和时间的控制至关重要。 

（3）搅碎匀浆：将鸡肉混合搅匀，每5 kg搅碎鸡肉中加1 kg维生素C溶液（浓度为500mg/kg）混匀制成肉糜。维生素C溶液具有抗氧化作用，有利于样品的长期保存。 

（4）冷冻干燥：将肉浆放入真空冷冻干燥机内冷冻干燥，冷冻干燥条件：-70℃速冻成厚度不超过2cm的冻块，置于真空干燥仓中，快速升温至60℃，保持48小时，直至冻块干燥。 

（5）粉碎均质:将冷冻干燥后的肉糜用粉碎机粉碎、混匀。 

（6）过筛：匀质后的鸡粉过0.5 mm孔筛，弃去筛余粗粉； 

（7）包装： 将厌氧工作站内灭菌、氮气浓度调整到99%备用。先将包装瓶放入无菌室用紫外灯灭菌，在无菌室内将干粉准确称量到瓶中，每个瓶内鸡肉粉重量5±0.5g，扣上盖子不拧，将所有装好干粉样品的包装瓶分批移入厌氧工作站中，重新将厌氧工作站氮气浓度调整至99%，在厌氧工作站内拧紧包装瓶的盖子，完成充氮包装取出。再用铝箔袋将包装瓶进行真空封装。得到含有妥曲珠利及其代谢物妥曲珠利砜的鸡肉基质冻干粉标准样品。

所制备的标准样品经均匀性检验、稳定性检验、协同定值实验及不确定度合成后，获得最终成品。 

本产品最终定值妥曲珠利：64.52±0.89ug/kg，其代谢物妥曲珠利砜：84.65±0.99ug/kg，，最终包装数为779瓶，每瓶约5±0.5g，室温保存。 

以下是本发明的具体实施实验和效果数据，以进一步说明本发明，但是本发明不仅限于此。 

1、均匀性检验 

采用单因素方差分析进行均匀性检验，随机抽取15 个样品，每个样品平行测定3次，所有的样品以随机次序在重复性条件下测试，按照上述检测方法对样品进行均匀性检测。标准样品的特性应当均匀，即在规定的细分范围内保证其特性不变。在均匀性检验过程中，一般需同时考察组间均匀性及组内均匀性，用方差分析法通过对两者的比较来判断各组测量值之间有无系统性差异，如果两者的比小于统计检验的临界值，则认为样品是均匀的。

称取1g样品，加4.0ml水还原60min以上，按SN/T 2318-2009《动物源食品中地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利亚砜和妥曲珠利砜残留量的检测 高效液相色谱-质谱 质谱法》方法进行检测，结果如下： 

（1）妥曲珠利均匀性检验数据（ug/kg）

 （2）妥曲珠利均匀性检验方差分析结果

 经检验，F值=2.025< F_0.05（14，30）=2.037,表明样品间无显著性差异，样品是均匀、良好的。

（3）妥曲珠利砜均匀性检验数据（ug/kg） 

 （4）妥曲珠利砜均匀性检验方差分析结果

经检验，F值=1.331< F_0.05（14，30）=2.037,表明样品间无显著性差异，样品是均匀、良好的。

2、稳定性研究 

稳定性是标准样品研制的关键，本发明采用加速实验来考察标准样品的稳定性。标准样品稳定性研究的基本模型是   ，用线性拟合模型评估标准样品的稳定性，以x代表时间，y代表标准样品中目标药物的含量，斜率b₁用下式计算：  

截距可用下式计算： 

直线上每点的标准偏差公式： 

与斜率相关的不确定度S_(b)：

当 ，表明标准样品是稳定的。

取本标准样品正式包装，在温度为50±2℃、相对湿度为75±5%的条件下放置6个月进行加速实验，分别于每月末取3个样品，每个样品平行测定2次，用SN/T 2318-2009方法进行检测，观测其变化。检测数据如下： 

(5)妥曲珠利稳定性加速实验数据（ug/kg）

 经计算b₁=-0.052,S_(b)=0.0242，，结论为稳定。

(6)妥曲珠利砜稳定性加速实验数据（ug/kg） 

经计算，斜率b₁=0.05157，斜率的不确定度S_(b)=0.0486，结论为稳定。

3、定值 

以8个试验室协作检测作为定值方式，按SN/T 2318-2009《动物源食品中地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利亚砜和妥曲珠利砜残留量的检测 高效液相色谱-质谱 质谱法》方法进行定值检测，每个实验室发3个样品，每个样品平行检测2次，以总平均值为定值结果。

（7）各实验室妥曲珠利定值数据如下: 

汇总各实验室数据，将所有的数据按大小顺序排列，进行夏皮罗-威克尔检验，公式为

          经计算W=0.975,当n=48时，p＝0.947，W>P，表明在显著性水平a＝0.05上不拒绝零假设。将每个实验室的数据先用Grubb's 法进行检验，无异常值；再将每个实验室的平均值组成一组数据，用Grubb's 法进行双侧情形检验，确定各实验室数据无异常值；将所有数据进行下一步统计，用Cochran 检验以确定8个实验室中没有随机误差太大的实验室，公式如下：

                          

式中： 为各实验室测定结果的标准偏差；为中的最大值。

经检验 ，C=0.205<C(0.05，8，5)，各实验室间的测量属于等精度测量，且测量的数据结果符合正态分布，计算标准样品中妥曲珠利总平均值： =64.52ug/kg。 

（8）各实验室妥曲珠利砜定值数据如下: 

经计算W=0.958,当n=48时，p＝0.947，W>P，表明在显著性水平a＝0.05上不拒绝零假设。将每个实验室的数据先用Grubb's 法进行检验，无异常值；再将每个实验室的平均值组成一组数据，用Grubb's 法进行双侧情形检验，确定各实验室数据无异常值；将所有数据进行下一步统计，用Cochran 检验以确定8个实验室中没有随机误差太大的实验室，经检验 ，C=0.344<C(0.05，8，5)，各实验室间的测量属于等精度测量，且测量的数据结果符合正态分布，计算总平均值为妥曲珠利砜标准样品的定值结果：==84.65ug/kg。

本标准样品的不确定度来源主要有以下几个方面：标准样品的不均匀性引入的不确定度，标准样品的不稳定性引入的不确定度以及标准样品定值过程中引入的不确定度，公式为：

设置信水平为P=95%，包含因子k=2，妥曲珠利的合成不确定度为0.89 ug/kg：

由均匀性引入的不确定度

由稳定性引入的不确定度为                                                  

由定值引入的不确定度

设置信水平为P=95%，包含因子k=2，妥曲珠利砜的合成不确定度为0.99 ug/kg：

由均匀性引入的不确定度

由稳定性引入的不确定度为

由定值引入的不确定度

标准样品中妥曲珠利最终定值结果为64.52±0.89ug/kg，妥曲珠利砜最终定值结果为84.65±0.99ug/kg。