环介导等温扩增法检测B群链球菌的引物组及试剂盒

摘要

本发明公开了一种环介导等温扩增法检测B群链球菌的引物组及试剂盒，该引物组包括一对特异性内引物和一对特异性外引物，该试剂盒中包括若干个内含18μL反应液的反应管、1管内含10μL GBS DNA的阳性对照管、1管内含100μL无菌超纯水的阴性对照管，本试剂盒针对GBS基因中高度保守、特异的cAMP基因设计引物，采用环介导等温扩增技术(LAMP)进行扩增并检测，DNA提取过程简单，不需要任何化学试剂，只需要沸水浴10min后离心即可，避免引入化学试剂对后续核酸扩增的影响，而且对仪器设备及操作要求低，简化了操作过程，降低了检测成本。

说明书

技术领域

本发明涉及一种环介导等温扩增法检测B群链球菌的引物组及试剂盒。

背景技术

B群链球菌(Group B Streptococcus，GBS)，又称无乳链球菌，兼性厌氧，革兰阳性链 球菌，正常寄居于阴道和肠道，属于条件致病菌。GBS感染引起肺炎、泌尿系统感染、软组 织感染、败血症等。GBS可引起新生儿、孕妇和老年人感染，是新生儿败血症和脑膜炎最常 见的病原菌，以新生儿感染率最高。成年人的B链球菌群感染多发生于机体抵抗力低下时。 GBS寄居于母亲泌尿道和胃肠道的黏膜，孕妇带菌率4％～40％不等，可能在生产过程中传递 给他们的孩子。20世纪70年代，GBS感染成为导致新生儿早期死亡的主要原因，死亡率高 达50％。GBS感染的新生儿，幸存者中30％-50％有严重的神经系统后遗症，包括脑瘫、脑积 水、发育障碍、智力障碍、听力或智力受损。GBS除了会造成新生儿感染外，怀孕妇女感染 GBS会出现早产，早期破水、羊膜腔炎，产后子宫发炎，甚至流产、死产。GBS是围产期女 性泌尿生殖道感染和新生儿期重症肺炎、败血症和脑膜炎的常见病原菌。新生儿的GBS感染 具有发病迅速、病死率高的特点，是新生儿的主要死亡原因，已引起世界范围内广大学者的 深切关注。对孕妇进行GBS筛查可及早发现感染，及时治疗，有效控制GBS的危害。

细菌培养是检测GBS的标准方法，但此菌营养要求较高，培养鉴定耗时较长，至少2d， 且阳性率较低，给门诊就医患者带来不便，尤其不能满足孕检筛查的需要。如何在感染早期 快速、准确、灵敏的检测GBS是临床诊断关注的要点。

发明内容

本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种环介导等温扩增法检测B群链球菌的引 物组及试剂盒。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种环介导等温扩增法检测B群链球菌的引物组，包括，特异性外引物F3：其核苷酸序 列如SEQ ID NO：1所示；特异性外引物B3：其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；特异性 内引物FIP：其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；特异性内引物BIP：其核苷酸序列如SEQ  ID NO：4所示。

一种环介导等温扩增法检测B群链球菌的试剂盒，包括装有18μL反应液的反应管，装 有10μL GBS DNA的阳性对照管，装有100μL无菌超纯水的阴性对照管，所述反应液内含 反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、显色液、外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP； 所述反应缓冲液各组分的浓度如下：400mM的Tris-Hcl，pH8.8；20mM的氯化钾；20mM的 硫酸铵；16mM的硫酸镁和0.2％Tween₂₀、1.6M的甜菜碱、2.8mM×4种dNTP；Bst DNA 聚合酶的活性含量为：160单位/18μL；显色液为：锰离子鳌和型钙黄绿素，0.001μmol/18μL； F3：4pmol/18μL，B3：4pmol/18μL；FIP：32pmol/18μL，BIP：32pmol/18μL。

所述试剂盒中装有18μL反应液的反应管为8个，装有10μL GBS DNA的阳性对照管1 个，装有100μL无菌超纯水的阴性对照DNA管1个。

所述试剂盒内还含20个适配1-10μl移液器的Tip头。

上述试剂盒的使用方法：将2μL待检DNA加入反应管内，混匀，同时设阴性对照和阳 性对照，阳性对照中加入GBS DNA，阴性对照中加入无菌超纯水，将反应管置水浴锅中进行 扩增，扩增条件为：60-65℃水浴恒温反应30-40min，观察颜色变化。

本发明的有益效果：

1.本试剂盒针对GBS基因中高度保守、特异的cAMP基因设计引物，采用环介导等温扩 增技术(LAMP)进行扩增并检测。因为扩增效率高，特异性好，对DNA质量和数量要求不 高，DNA提取过程简单，不需要任何化学试剂，只需要沸水浴10min后离心即可，避免引 入化学试剂对后续核酸扩增的影响，而且对仪器设备及操作要求低，简化了操作过程，降低 了检测成本；

2.针对GBS基因中高度保守、特异的cAMP基因中的6个片段，自行设计并优选出特异 性高、反应迅速、包含有4条引物的引物组，使得反应可在30-40min内完成；

3.将每个反应所需试剂预先混合并置于反应管中，检测时只需要在反应管中加入样本 DNA即可进行反应，避免因多次加样带来的污染及误差，对操作人员要求低；而且试剂盒中 包含取样所需移液器头(Tip头)，不需要另外准备耗材，进一步降低污染，提高检测的精确 度和便捷度；

4.与文献报道的反应体系不同：反应液包括2×反应缓冲液(200mMTris-Hcl，pH8.8；100mM 氯化钾；100mM硫酸铵；20mM硫酸镁和1％TritonX-100、甜菜碱、dNTP、超纯水)、BstDNA 聚合酶、引物组、荧光染料。反应液采用Tris-HCl缓冲体系，更加稳定；提高了甜菜碱的浓 度(1.6M)，更好的保护Bst DNA聚合酶的活性，提高反应效率；降低引物浓度，提高了反 应的特异性，降低假阳性；

5.用于结果判断的染料采用钙黄绿素，反应效率高，特异性好，只能检测到LAMP反应 而对常规PCR反应无效，避免因核酸扩增中的微弱PCR反应带来的假阳性；

6.染料预先加到反应液，反应结束后不需要再打开反应管，避免了因形成气溶胶产生的 DNA污染，有效保护反应环境，避免后续检测中的假阳性；

7.反应快速，40min内即可完成；设置结果判断的时间范围为30-40min，因为40min以 后可能产生假阳性，所以40min以后的结果不予判读，确保了检测结果的准确性。

8.与同类试剂盒相比，本试剂盒更加方便、快捷、特异、精确，对仪器设备和操作人员 要求低，不具有高级实验室的基层医院也可以开展，而且病人当天就可拿结果，节约时间和 费用，为治疗争取宝贵时间。

9.整个检测过程在恒温下完成，不需要复杂的变温设备；扩增效率更高，是一般PCR扩 增效率的10-100倍；耗时更少，一般PCR扩增需要花费2-3h，而LAMP扩增只需要0.5-1 h即可完成；结果可目视，容易判断，无需电泳，节约时间，避免污染。

附图说明

图1为LAMP法目视鉴定GBS结果，其中，1号管为阴性对照，2号管为阳性对照，3 号管为检测管；

图2为LAMP法目视检测试剂盒灵敏性结果，其中，1-6号管中加入的为倍比稀释的DNA， 浓度依次为100、10、1、0.1、0.01、0.001ng/μl，1-5号为阳性，6号为阴性；

图3LAMP法目视检测试剂盒特异性结果，1-8管依次为：B群链球菌质控菌，B群链球 菌临床分离株，A群链球菌，F群链球菌，星座链球菌，草绿色链球菌，肺炎链球菌，粪肠 球菌，1、2号管为阳性，其它均为阴性；

图4LAMP法目视检测临床样本结果，其中1，2，3为阳性，4-20为阴性。。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。

1.DNA提取

(1)培养细菌的DNA提取：用移菌环刮取固体平板上的菌落，置于含0.2ml无菌双蒸 水的EP管中，沸水浴8-10min，8000-12000rpm离心2-5min，取上清转移至新的EP管中， 即为样本DNA，可直接用于LAMP反应。

(2)临床液体样本的DNA提取：液体样本10000-12000rpm离心5min，除去部分上清 液，留取下部分沉淀，沉淀与蒸馏水1：1混合后置沸水中水浴8-10min后，8000-12000rpm 离心2-5min，取上清转移至新的EP管中，即为样本DNA，可直接用于LAMP反应。

(3)临床固体样本的DNA提取：固体样本置于1倍体积蒸馏水中，沸水浴8-10min， 8000-12000rpm离心2-5min，取上清转移至新的EP管中，即为样本DNA，可直接用于LAMP 反应。

(4)咽拭子等样本的DNA提取：将拭子置于1ml蒸馏水中，充分震荡，弃去拭子，按 照液体样本方法提取DNA。

2.引物设计及筛选

根据GBS的cAMP基因序列设计引物组，每组引物包括一对特异性内引物和一对特异性 外引物，根据反应时间及特异性对不同引物的反应进程和结果进行监测、筛选，确定反应快、 特异性高的最佳引物。最佳引物序列见表1。

GBS的cAMP基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

表1引物序列

3.LAMP反应体系

LAMP反应总体系为20μL，反应时加入18μL反应液，再加入2μL待检测DNA。同时 设阳性对照和阴性对照。

阳性对照为：反应时在反应液中加入含有GBS DNA的B群链球菌基因组DNA 2μL；

阴性对照为：反应时在反应液中加入超纯水2μL。

18μL反应液含有：反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、显色液、外引物F3、外引物B3、内 引物FIP、内引物BIP；

其中，反应缓冲液成分及含量见表2；

表2反应缓冲液成分及含量

Bst DNA聚合酶的活性含量为：160单位；

显色液为：锰离子鳌和型钙黄绿素，0.001μmol；

各引物的含量见表3；

表3各引物在20μL反应体系中的含量

4.试剂盒设置

每个试剂盒中应包含检测管和对照管，最少应设置3个LAMP反应管(阳性对照、阴性 对照和检测管)，本试剂盒设置10个LAMP反应管。试剂盒内含20个适配10-100μl移液器 的Tip头。

试剂盒内含：若干个反应管(内含18μL反应液)、1管阳性对照DNA(内含10μL GBS  DNA)、1管阴性对照DNA(内含100μL无菌超纯水)。

5.反应条件

将2μL待检DNA加入LAMP反应管的反应液内，混匀，同时设阴性对照和阳性对照， 阳性对照中加入GBS DNA，阴性对照中加入无菌超纯水。将LAMP反应管置水浴锅中进行 扩增，扩增条件为：60-65℃水浴恒温反应30-40min。

6.结果判定

在LAMP反应进行的过程中，随着大量DNA的合成，还产生一种副产物焦磷酸根离子， 焦磷酸根离子浓度与生成的DNA成正比。反应初期，显色液中的钙黄绿素与荧光淬灭剂锰离 子结合而不发荧光。由于焦磷酸根离子更易与锰离子结合从而释放了钙黄绿素。游离的钙黄 绿素可以自发荧光，在镁离子存在的条件下，这种荧光效果得到了加强。而且这种荧光在自 然光下可被裸眼观察到。扩增反应前，反应液为淡橙色，待检测样本DNA被扩增后反应液变 为绿色。因此从反应开始至结果判读均不需要打开反应管，可以有效避免因形成气溶胶而导 致的DNA污染及假阳性的产生。

所以，反应液变为绿色的为阳性结果；反应液不变色仍为淡橙色的为阴性结果，如图1 所示，2号管为阳性对照，3号管为检测管，反应至30-40后，取出离心管，裸眼观察结果，2、 3号管中的液体变为绿色，为阳性，1号管为阴性对照管，管中的液体仍保持淡橙色，为阴性。 若反应时间延长至40min以上，可能会出现假阳性，随反应时间继续延长，假阳性出现的几 率随之升高，所以结果判定以30-40min时为准。

7.敏感性检测

用微量分光光度计(购自美国Nanodrop公司，型号为ND-1000)检测样本DNA的浓度， 并将DNA的浓度调整为100ng/μl，用双蒸水对待检测DNA进行10倍梯度稀释，得到所需 要的不同浓度，即10、1、0.1、0.01、0.001ng/μl。按照5反应条件进行LAMP反应，检测出 现阳性反应的最低模板浓度。如图2所示，1-5号管浓度为100、10、1、0.1、0.01ng/μl，反 应结束后变为绿色，为阳性。6号管浓度为0.001ng/μl，反应结束后仍为淡橙色，为阴性。表 明本试剂盒最低可检测到0.01ng/μl的基因组DNA，本试剂盒敏感性很高。

8.特异性检测(与培养比较)

选择链球菌属的临床分离菌株B群链球菌、A群链球菌、星座链球菌、草绿色链球菌， 并加上肺双链球菌，金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌，按照上述提到的方法提取DNA，进行 LAMP扩增，并以GBS标准菌株为阳性对照。结果45分钟时，如图3所示，只有B群链球 菌标准菌株和临床菌株呈阳性，时间延长至1h其他菌株仍为阴性，表明本引物具有很高的 特异性。

9.临床样本应用检测

结合临床资料确定LAMP方法在临床应用中的敏感性和特异性。对临床采集20份疑似 GBS感染的标本，提取20份样品的DNA，用本发明方法建立的LAMP检测试剂盒和经典细 菌培养鉴定(采用哥伦比亚血平板培养过夜后，通过乳胶凝集实验或cAMP试验进行鉴定。) 结果进行比较。本试剂盒鉴定出阳性标本3份，与培养鉴定结果的相符率为100％。结果如图 4所示，1，2，3为阳性，4-20为阴性。采用本试剂盒检测，从取得样本到结果判定结束仅需 1h，而传统培养鉴定需要经过接种、培养、鉴定，24后才能出结果。相比之下，本试剂盒具 有快速、便捷、准确的特点，可操作性强的优点。

本实验针对GBS cAMP基因设计特异性引物，这4条引物针对靶序列上的6个不同区域 从而保证了LAMP反应的特异性和敏感性。综上所述，本实验建立的环介导等温扩增法快速 目视检测B群链球菌的的引物组及试剂盒具有高效快速、操作简单、特异性与敏感性高、结 果判断直接等优点，从样本处理到结果判断只需要1h，适合于各级医院检验科快速诊断和筛 查。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限 制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付 出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。