一组用于铜绿假单胞菌多重耐药基因检测的液态芯片引物和探针

摘要

本发明公开了一组用于铜绿假单胞菌多重耐药基因检测的液态芯片引物和探针，所述8个耐药基因的引物序列为：包括OPRD2、TEM、OXA10、AAC3、AAC6、VIM、VEB、IMP。本发明提供的是引物和探针的组合之间无交叉反应，所述的引物和探针组合用于液态芯片，可以同时检测铜绿假单胞菌多重耐药基因。

说明书

技术领域

本发明涉及一组用于铜绿假单胞菌多重耐药基因检测的液态芯片引物及其探针，属于生物检测技术领域。 

背景技术

2010年，随着“超级细菌”这一名词频繁地见诸报端，细菌多重耐药、抗生素的合理使用重返人们视线。超级细菌其实并非新事物，它不是一个细菌的名称，而是一类细菌的名称，这一类细菌的共性是对几乎所有的抗生素都有强劲的耐药性，它们一直存在并且随着人类滥用抗生素而进化出强大耐药性。细菌耐药性，尤其是多重耐药性(multidrugresistance，MDR)已经成为非常严重的医疗问题及社会问题。 

细菌耐药机理十分复杂，在抗生素的压力选择下，临床细菌耐药状况的日益恶化。细菌耐药性的检测与监测对于正确的目标性抗感染治疗以及监测细菌耐药性变迁和耐药菌感染的流行病学调查，制定防控细菌耐药性增加的措施至关重要。然而，目前临床实验室多采用耐药表型的检测方法，其检测周期长时效性差、检测通量低、影响因素多是最主要的问题，不能满足目前临床抗感染治疗和医院感染控制的要求。 

液态芯片(又称流式荧光技术、液相芯片、悬浮阵列等)是在后基因组时代发展起来的新一代标准化开放式高通量技术平台，它有机地整合了编码微球、激光技术、应用流体学、最新的高速数字信号处理器和计算机运算法则，具有高通量、高速度、低成本、灵敏度高、重复性好、线性范围广等优点，可广泛应用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、受体和配体识别分析等研究，也是是目前唯一得到权威机构和医学界共同认可用于临床诊断的生物芯片平台。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：利用液态芯片技术，提供一组使铜绿假单胞菌的8种耐药基因的PCR产物能在一个杂交条件下完成特异性杂交的引物组和探针。 

本发明所述铜绿假单胞菌8个多重耐药基因包括OPRD2、TEM、OXA10、AAC3、AAC6、VIM、VEB、IMP。 

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是： 

本发明提供的一组用于铜绿假单胞菌多重耐药基因检测的液态芯片引物，所述8个耐药基因的引物序列为： 

一组用于铜绿假单胞菌多重耐药基因检测的液态芯片探针，所述8个耐药基因的探针序列为： 

耐药基因 探针序列 OXA10 Ox-PF：NH2-TTTTTTTTTTGATTTGTTGAAATACGGGAAC TEM Te-PR：NH2-TTTTTTTTTTCGAAGAACGTTTTCCAATG OPRD2 OP-PF1：NH2-TTTTTTTTCCAGCGGCGAAGACCGGA VIM VI-PF：NH2-TTTTTTTACGTCCCGTCTGCGA VEB VE-PF1：NH2-TTTTTTGAGATAGATAAAGGGAATCTTTCTT AAC6 aac6-PF3：NH2-TTTCAAGCGTTTTAGCGCAAG AAC3 aac3-PF3：NH2-TTTTTTTTTTGCGGGATCGAACGGCA IMP IMP-PF1：NH2-TTTTTTCCGTTAACTTCTTCAAACGAAGT

本发明的有益效果： 

本发明提供的是一个引物和探针的组合，这8组引物和探针之间无交叉反应，形成一个多重引物组合，不能将其单独分开。所述的引物和探针组合用于液态芯片，可以同时检测铜绿假 单胞菌多重耐药基因。 

具体实施方式

实施例1 

一组用于铜绿假单胞菌多重耐药基因检测的液态芯片引物，所述8个耐药基因的引物序列为： 

一组用于铜绿假单胞菌多重耐药基因检测的液态芯片探针，所述8个耐药基因的探针序列为： 

耐药基因 探针序列 OXA10 Ox-PF：NH2-TTTTTTTTTTGATTTGTTGAAATACGGGAAC TEM Te-PR：NH2-TTTTTTTTTTCGAAGAACGTTTTCCAATG OPRD2 OP-PF1：NH2-TTTTTTTTCCAGCGGCGAAGACCGGA VIM VI-PF：NH2-TTTTTTTACGTCCCGTCTGCGA VEB VE-PF1：NH2-TTTTTTGAGATAGATAAAGGGAATCTTTCTT

AAC6 aac6-PF3：NH2-TTTCAAGCGTTTTAGCGCAAG AAC3 aac3-PF3：NH2-TTTTTTTTTTGCGGGATCGAACGGCA IMP IMP-PF1：NH2-TTTTTTCCGTTAACTTCTTCAAACGAAGT

实施例2特异性验证： 

1.分别取OPRD2、TEM、OXA10、AAC3、AAC6、VIM、VEB、IMP耐药的铜绿假单胞菌培养液，提取DNA。利用上述的引物配制多重PCR反应体系(40ul)： 

2.配制的反应体系按下述程序扩增： 

a)第一阶段：95℃，10min，1个循环。 

b)第二阶段：95℃，30sec；56℃，30sec；72℃，30sec；40个循环。 

c)第三阶段：72℃，10分钟，1个循环。 

3.扩增后的PCR产物利用Luminex流式分析仪进行分析，步骤如下： 

a.根据PCR反应的管数，用剪刀剪取相应大小的微孔杂交板。打开Luminex仪器预热，并将仪器上微孔板适配铜板的温度设定在48℃。 

b.将微球杂交液试剂瓶置于涡旋仪上振荡30秒，使微球充分混悬在溶液中。并在每一个杂交孔中加入22μl； 

c.每个样本吸取PCR扩增产物3μl，并依次加入到相应的上述杂交孔中，并抽吸几次加以混匀； 

d.剪取相应大小的封板纸，将微孔杂交板覆盖封口。请用指压封口数次，确保封严，以防在高温变性和杂交时溶液蒸发； 

e.将杂交板置于金属恒温浴(可以用PCR仪代替)，把仪器的盖子压紧已封口的杂交板，以防封板膜在加热后张开，导致液体蒸发。变性和杂交过程运行如下程序： 

95℃ 5分钟  变性 

48℃ 30分钟 杂交 

f.小心将封板纸撕下，每孔加入荧光素SA-PE 75μl，并抽吸几次加以混匀。加完后将封板纸重新粘好，继续在48℃下孵育15分钟； 

g.将微孔杂交板快速转移至预热好的Luminex流式分析仪上进行阅读，得到检测结果。 

4.OPRD2、TEM、OXA10、AAC3、AAC6、VIM、VEB、IMP耐药铜绿假单胞菌杂交检测结果如下表，结果表明设计的引物和检测探针具有良好的特异性。 

实施例3灵敏度验证 

分别取OPRD2、TEM、OXA10、AAC3、AAC6、VIM、VEB、IMP耐药的铜绿假单胞菌培养液，菌落计数后，统一稀释到1000/ml，然后梯度稀释并提取DNA，按实施例2中的步骤进行检测分析，结果如下表，表明设计的引物和检测探针均能检出125/ml的菌。 

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