基于山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(2→1)-β-D-葡萄糖苷鉴别蜂花粉的方法

摘要

本发明涉及一种基于山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(2→1)-β-D-葡萄糖苷含量鉴别蜂花粉的方法，该方法包括以下步骤：标准贮备液和标准工作液的配制、蜂花粉的前处理方法和液相色谱-串联质谱法检测。本发明提供的方法检测的结果显示：标准曲线相关系数大于0.9990，添加回收率范围为73.1-98.4％，相对标准偏差小于6.1％，检测限为0.1μg/g，定量限为0.3μg/g。结果表明建立的提取方法和仪器分析方法是准确，稳定的，适合蜂花粉中山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(2→1)-β-D-葡萄糖苷的定性和定量分析。

说明书

技术领域

本发明涉及蜂花粉的鉴别方法，具体涉及一种基于山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(2→1)-β-D-葡萄糖苷含量鉴别蜂花粉的方法。 

背景技术

蜂花粉是蜜蜂从蜜源植物的雄蕊中采集的花粉，加上蜜蜂自身的腺上分泌物、唾液和花蜜形成的不规则扁圆形的团状物。 

蜂花粉含有多种氨基酸、维生素、矿物元素、不饱和脂肪酸、有机酸、蛋白质、脂类、碳水化合物，多酚类和黄酮类物质、多糖、酶类、核酸、激素等活性物质，具有丰富的营养价值。 

蜂花粉因其成分多样而富有多种活性功能，不仅对治疗贫血有特殊的疗效，对于治疗前列腺疾病也有较好的疗效；还具有抗癌、抗辐射、降血脂、防治心脑血管疾病的作用；此外，蜂花粉对于治疗习惯性便秘、胃肠病、肝病、神经衰弱均有功效；同时，蜂花粉对保护皮肤和美容有明显的作用，可除去多余的脂肪达到减肥美体的目的，其提取物还具有保湿、抗氧化、调理皮肤和头发的功效(孙丽萍，田文礼，朱晓丽等.蜂花粉功能食品的研究思路.中国养蜂，2006，57(10):39-40)。 

蜂花粉中各成分的含量如下：蛋白质20-25％、碳水化合物40-50％、脂肪5-10％、矿物质2-30％、木质素10-15％、未知物质10-15％，黄酮类物质是蜂花粉中重要的功效组分，也是保健食品中的有效成分。 

目前一些不法商家将价格较低的蜂花粉掺入价格较高的蜂花粉中赚取高额利润，但是由于大多数的蜂花粉颜色，味道非常相近，所 以很难对市场的蜂花粉进行鉴别。通常根据植物来源对蜂花粉进行分类，所以不同蜂花粉之间的营养成分和生物学功能均存在一定差异。 

已有的研究报道中鉴别花粉品种的方法为：感官检验，显微镜镜检，比色法、紫外分光光度法、高效液相色谱-大气压电离质谱法(LC-TSP-MS)、胶束毛细管电泳法(MECC)和高效液相色谱法(HPLC)。(以下内容摘录自蜂花粉中黄酮类化合物的检测及纯化方法的研究，该文献是中国农业科学院孙丽萍撰写的硕士论文，2005年10月公开)其中： 

感官检验主要通过眼看蜂花粉的颜色和品尝味道来鉴别种类，但是很多蜂花粉颜色差异比较小乃至肉眼很难分辨，不同的人观察后也会认为是不同的颜色；一些种类的蜂花粉均具有微甜的味道，很难通过品尝分辨其种类，所以该方法最大的缺点是鉴别能力的准确度低，容易受人为因素的影响； 

在电子显微镜下来源于不同植物的花粉大小和形状存在一定的差异，因此，可以通过显微镜下的轮廓图鉴定植物的种类，但是在显微镜下很多蜂花粉的形态非常接近，这容易造成鉴别方法主观性强，准确性低； 

比色法是在碱性溶液中加Al³⁺与3-羟基黄酮、5-羟基黄酮进行络合反应，利用颜色和含量关系进行比色测定的方法，该法用于组成单一的标准对照物时，结果准确，但当应用于组分复杂的植物试样时，比如花粉黄酮提取液，由于受到花色素、鞣酸及其它酚性成分等多种物质的干扰，而且底液常常出现浑浊现象，因此测定结果明显偏高，而且测定结果重现性不好。 

紫外分光光度法：是利用黄酮类化合物在紫外区有较强吸收，利用适当的对照品进行黄酮的测定。为了消除一些水溶性的强极性物质的干扰，将样品用聚酰胺进行了分离提纯，再采用紫外分光光度法测定，此为聚酰胺-紫外分光光度法。 

高效液相色谱法：一种方法是采用样品直接进样，梯度洗脱，高效液相色谱分析，测定样品所含黄酮苷类成分，但是由于黄酮苷类种类多，不可能一次分离，而且很多都没有标准对照物可对照，很难定量；另一种方法是通过测定水解苷元含量来计算黄酮苷的量，其测定原理是：蜂花粉黄酮主要成分是以黄酮苷形式存在，经酸水解后生成黄酮醇类化合物，其主要是槲皮素、异鼠李素和山奈酚三种成分，，用HPLC分离测定这三种苷元的含量，再用计算方式转换成相应蜂花粉黄酮苷的含量。 

利用薄层色谱法可分离分析蜂花粉中的维生素，由斑点的数目、形状、颜色、荧光及Rf值比较，从而鉴别蜂花粉种类(杨梦兰，李忠奇，王伟等.TLC法鉴别花粉种类，广东公安科技，2000，3：16-19)，但是该方法中使用了大量的具有挥发性的有毒有害试剂，如氯仿，冰醋酸，二氯甲烷和氨水等，而且根据Rf值和颜色鉴别也具有主观性强，准确性低等缺点。 

此外，采用傅里叶变换红外光谱(FTIR)结合二阶导数谱和热扰动下的二维相关红外光谱技术对6种不同花粉，即杏花花粉、油菜花粉、茶花花粉、西瓜花粉、荷花花粉和虞美人花粉，进行了快速无损的鉴别(吴杰，周群，吴黎明等.六种蜂花粉的红外光谱三级鉴别研究，光谱学与光谱分析，2010，30(2)：353-357)，但是该方法需要实验人员具有丰富的结构解析的经验，所以红外光谱法不适合普通检测人员对蜂花粉种类进行鉴别，而且该方法只能用于定性分析，不能定量分析。 

山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(2→1)-β-D-葡萄糖苷，如式Ⅰ所示 

山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(2→1)-β-D-葡萄糖苷是从具有保肝活性的混合组分中分离出的单一组分。 

目前，尚未见到山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(2→1)-β-D-葡萄糖苷在鉴别蜂花粉中的应用。 

发明内容

本发明的目的是利用无毒或毒性较小的试剂从不同种类的蜂花粉中提取特征活性组分，然后对其进行定性和定量分析，根据蜂花粉中特征性组分的含量差异来准确鉴别蜂花粉的种类。 

本发明提供的蜂花粉的鉴别方法，包括以下步骤：标准贮备液和标准工作液的配制、蜂花粉的前处理方法和液相色谱-串联质谱法检测。 

所述蜂花粉的前处理方法为超临界萃取法(Supercritical Fluid Extraction，SFE)，包括以下步骤：蜂花粉用夹带剂进行萃取； 

优选地，所述蜂花粉的前处理方法包括以下步骤：将粉碎过均匀的蜂花粉1.0-2.0g，设定的温度为45-50℃，压力为25-40MPa，夹带剂的流速为0.3-0.4mL/min，二氧化碳流速为2.0-6.0L/h，提取时间为3.5-4小时； 

所述夹带剂为浓度为75-80％的乙醇； 

所述蜂花粉的粒径范围是100-150μm。 

所述液相色谱-串联质谱法的条件为：流动相为0.1％的甲酸和乙腈溶液；C18色谱柱，柱温为30℃；流速为0.2mL/min；进样量为5.0μL； 雾化器温度：350℃,雾化器流速：6L/min,雾化器压力35psi,毛细管电压:3500V,鞘流气温度:350℃,鞘流气流速:9L/min,锥孔电压:1000V.。 

所述梯度洗脱见表： 

时间(分钟) A相(0.1％甲酸溶液) B相(乙腈) 0 90 10 1.5 90 10 6.0 80 20 9.0 80 20 9.1 90 10 15 90 10

具体方法包括以下步骤： 

1)标准贮备液(2.0mg/mL)的配制：准确称取标准物质山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(2→1)-β-D-葡萄糖苷50.0mg，置于25mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，充分摇匀，配制成2.0mg/mL的标准贮备液，备用； 

2)标准工作液的配制：取适量标准贮备液于10mL容量瓶中，用甲醇依次稀释定容，配制成以下系列标准工作液：1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL，100ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL，备用； 

3)蜂花粉样品前处理方法：称取粉碎均匀的蜂花粉样品12份，每份约1.0-2.0g装入萃取池中，设定的温度为45-50℃，压力为25-40MPa，夹带剂乙醇流速为0.3-0.4mL/min、提取时间为3.5-4小时。提取产物用乙醇定容到50mL，从容量瓶内吸取部分蜂花粉试样溶液用纯水稀释10倍，取1.0mL待分析； 

4)液相色谱-串联质谱条件：流动相为0.1％的甲酸和乙腈溶液；洗脱条件见表1；C18色谱柱，柱温为30℃；流速为0.2mL/min；进样量为5.0μL；雾化器温度：350℃，雾化器流速：6L/min，雾化器压力35psi，毛细管电压:3500V，鞘流气温度:350℃，鞘流气流速:9L/min，锥孔电压:1000V.标准物质山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(2→1)-β-D-葡萄糖苷的母离子为610.9，定量离子为449.0(碰撞能量为6v)， 定性离子为287.0(碰撞能量为15v)，驻留时间为100ms，传输电压为100v； 

表1 液相梯度洗脱表 

时间(分钟) A相(0.1％甲酸溶液) B相(乙腈) 0 90 10 1.5 90 10 6.0 80 20 9.0 80 20 9.1 90 10 15 90 10

5)测定方法：包括定性测定和定量测定。 

所述定性测定包括以下步骤：根据蜂花粉试样溶液中待测物质的含量，选择峰面积相近的标准工作液和样品溶液等体积参插进样。通过色谱保留时间与质谱选择离子共同定性。样品中待测物质与标准物质的保留时间相对偏差不大于1％，而且其选择离子的相对丰度的差异不大于10％。 

所述定量测定包括以下步骤：分别取适量蜂花粉试样溶液和相应浓度的标准工作液，作单点校准或多点校准，以色谱峰面积积分值定量。标准工作液及试样液中药物的响应值均应在仪器检测的线性范围内，试样液进样过程中应参插标准工作液，以便准确定量。 

本发明提供的方法具有以下优点： 

1、本发明的技术关键点在于： 

1)温度需控制在45-50℃范围内。温度增加，待分离的物质挥发性的增加并且提高花粉的扩散系数，这有利于待测物质的浸出。但另一方面又降低了二氧化碳的浓度，减少了二氧化碳的密度，从而导致二氧化碳溶解能力的降低，对提取不利。 

2)压力需控制在25-40MPa范围内。压力越大，提取效果越好，但在提取过程中，超过40MPa时，提取效率反而降低。 

3)夹带剂乙醇流速为0.3-0.4mL/min。增加夹带剂乙醇浓度，待测物的产率将会逐步提高，但是浓度过高增加了从萃取物中分离回收 夹带剂的难度，而且由于使用了夹带剂，使得一些萃取物中有夹带剂的残留。 

4)提取时间为3.5-4小时条件下，可获得最高的提取效率。提取时间越长，待测物质的提取效率越高，但4h后，待测物质提取率增幅减小。 

5)二氧化碳流速在2.0-6.0L/h条件下可获得最大的提取效率。增大CO2流量可以明显降低蜂花粉表面的超临界流体滞留层的厚度，降低界面传质阻力，减少超临界流体萃取时间，提高传质速率而使萃取速率增大，所以在一定的萃取时间内待测物的提取效率增加。 

6)蜂花粉试样溶液在利用液相色谱-串联质谱仪分析前需使用纯水稀释，否则产生色谱图不对称导致定量不准确。 

7)流动相中需要加入0.1％甲酸，为待测物提供酸性环境，提供质子，提高离子化效率。 

8)在分析蜂花粉试样溶液过程中，只有含有两个子离子，且相对丰度的差异不大于10％，保留时间相对偏差不大于1％情况下才认定含有待测物山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(2→1)-β-D-葡萄糖苷。 

2、蜂花粉中的成分复杂，不同的成分具有不同的活性 

山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(2→1)-β-D-葡萄糖苷是从具有保肝活性的混合组分中分离出的单一组分，该组分是很偶然的从具有保肝活性的组分中通过继续分离得到的，纯度也很高，然后对蜂花粉进行前处理，然后利用仪器分析方法对其进行定性和定量分析，发现很多蜂花粉中都含有该组分，而且同种蜂花粉中含量差异较小，不同种蜂花粉的含量差异很大，且含量范围无任何交集，所以觉得可以作为一个指标来鉴别这几种蜂花粉。 

本发明利用SFE技术提取蜂花粉中的山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(2→1)-β-D-葡萄糖苷，然后利用液相色谱-串联质谱联用仪对其进行定性和定量分析，该方法简单，快速，准确，稳定。 

3、本发明提供的方法检测的结果显示：标准曲线相关系数大于0.9990，添加回收率范围为73.1-98.4％，相对标准偏差小于6.1％，检测限为0.1μg/g，定量限为0.3μg/g。结果表明建立的提取方法和仪器分析方法是准确，稳定的，适合蜂花粉中山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(2→1)-β-D-葡萄糖苷的定性和定量分析。 

根据山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(2→1)-β-D-葡萄糖苷可以准确的鉴别籽瓜花粉、油菜花粉、玫瑰花粉、虞美人花粉、荞麦花粉、玉米花粉和茶花花粉，该方法完全消除了以往方法中主观性强，易受人为因素影响的缺点。 

4、经过本发明检测，发现七种蜂花粉中山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(2→1)-β-D-葡萄糖苷的含量如下：籽瓜花粉547.6-584.9μg/g、油菜花粉2791.9-2888.3μg/g、芝麻花粉845.8-894μg/g、虞美人花粉3941-4243.2μg/g、荞麦花粉318-374μg/g、玉米花粉119.5-135.6μg/g和茶花花粉0.2-0.36μg/g。由于这七种蜂花粉中山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(2→1)-β-D-葡萄糖苷的含量差异明显，所以可以用该待测物质鉴别这七种蜂花粉。 

综上所述，本发明提供了一种高效、稳定、重复性好，准确的鉴别七种蜂花粉的方法，对于加强蜂花粉种类鉴别的研究，探索蜂花粉溯源信息，以及开发我国传统中医药物，提高我国蜂花粉质量，保证消费者的健康等具有重要的意义。 

附图说明

图1：山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(2→1)-β-D-葡萄糖苷的多反应离子监测(MRM)图谱。 

图2：山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(2→1)-β-D-葡萄糖苷定量离子和定性离子的总离子流(TIC)色谱图。 

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 

实施例1 

1)标准贮备液(2.0mg/mL)的配制：准确称取标准物质山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(2→1)-β-D-葡萄糖苷50.0mg，置于25mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，充分摇匀，配制成2.0mg/mL的标准贮备液，备用(贮存条件：密封，-20℃保存，可稳定保存6个月)。 

2)标准工作液的配制：取适量标准贮备液于10mL容量瓶中，用甲醇依次稀释定容，配制成以下系列标准工作液：1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL，100ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL，备用(保存条件：密封，置4℃冰箱中保存备用，可稳定保存1个月)。 

3)蜂花粉样品前处理方法：称取粉碎均匀的蜂花粉样品12份，每份约1.0装入萃取池中，设定的温度为45℃，压力为30MPa，夹带剂浓度为75％乙醇、流速为0.3mL/min、二氧化碳流速为6.0L/h，提取时间为3.5小时。提取产物用乙醇定容到50mL。从容量瓶内吸取部分蜂花粉试样溶液用纯水稀释10倍，取1.0mL待分析。 

4)液相色谱-串联质谱条件：流动相为0.1％的甲酸和乙腈溶液；洗脱条件见表1；SB-C18色谱柱，柱温为30℃；流速为0.2mL/min；进样量为5.0μL；雾化器温度：350℃，雾化器流速：6L/min，雾化器压力35psi，毛细管电压:3500V，鞘流气温度:350℃，鞘流气流速:9L/min，锥孔电压:1000V.标准物质山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(2→1)-β-D-葡萄糖苷的母离子为610.9，定量离子为449.0(碰撞能量为6v)，定性离子为287.0(碰撞能量为15v)，驻留时间为100ms，传输电压为100v。 

表1 液相梯度洗脱表 

时间(分钟) A相(0.1％甲酸溶液) B相(乙腈) 0 90 10 1.5 90 10 6.0 80 20 9.0 80 20 9.1 90 10 15 90 10

[0065] 5)测定方法 

定性测定：根据蜂花粉试样溶液中待测物质的含量，选择峰面积相近的标准工作液和样品溶液等体积参插进样。通过色谱保留时间与质谱选择离子共同定性。样品中待测物质与标准物质的保留时间相对偏差不大于1％，而且其选择离子的相对丰度的差异不大于10％。 

定量测定：分别取适量蜂花粉试样溶液和相应浓度的标准工作液，作单点校准或多点校准，以色谱峰面积积分值定量。标准工作液及试样液中药物的响应值均应在仪器检测的线性范围内，试样液进样过程中应参插标准工作液，以便准确定量。 

6)结果：标准曲线相关系数为0.9994，添加回收率范围为76.8-97.3％，相对标准偏差小于6.1％，检测限为0.1μg/g，定量限为0.3μg/g。 

7)鉴别方法： 

七种蜂花粉中山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(2→1)-β-D-葡萄糖苷的含量如下：籽瓜花粉547.6-584.9μg/g、油菜花粉2791.9-2888.3μg/g、芝麻花粉849.1-891.5μg/g、虞美人花粉3941.7-4225.1μg/g、荞麦花粉321.6-372.4μg/g、玉米花粉119.5-132.7μg/g和茶花花粉0.22-0.35μg/g。由于这七种蜂花粉中山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(2→1)-β-D-葡萄糖苷的含量差异明显，所以可以用该待测物质鉴别这七种蜂花粉。 

实施例2 

1)标准贮备液(2.0mg/mL)的配制：同实施例1。 

2)标准工作液的配制：同实施例1。 

3)蜂花粉样品前处理方法：称取粉碎均匀的蜂花粉样品12份，每份约1.5g装入萃取池中，设定的温度为50℃，压力为25MPa，夹带剂浓度为78％、乙醇流速为0.4mL/min、提取时间为3.8小时，二氧化碳流速为4.0L/h。提取产物用乙醇定容到50mL。从容量瓶内吸取部分蜂花粉试样溶液用纯水稀释10倍，取1.0mL待分析。 

4)液相色谱-串联质谱条件：同实施例1 

5)测定方法 

定性测定：同实施例1。 

定量测定：同实施例1。 

6)结果：标准曲线相关系数为0.9991，添加回收率范围为85.7-98.4％，相对标准偏差小于6.5％，检测限为0.1μg/g，定量限为0.3μg/g。 

7)鉴别方法： 

七种蜂花粉中山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(2→1)-β-D-葡萄糖苷的含量如下：籽瓜花粉557.4-583.1μg/g、油菜花粉2804.7-2887.6μg/g、芝麻花粉845.8-894μg/g、虞美人花粉3941-4243.2μg/g、荞麦花粉318-374μg/g、玉米花粉122-135.6μg/g和茶花花粉0.2-0.36μg/g。由于这七种蜂花粉中山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(2→1)-β-D-葡萄糖苷的含量差异明显，所以可以用该待测物质鉴别这七种蜂花粉。 

实施例3 

1)标准贮备液(2.0mg/mL)的配制：同实施例1。 

2)标准工作液的配制：同实施例1。 

3)蜂花粉样品前处理方法：称取粉碎均匀的蜂花粉样品12份，每份约2.0g装入萃取池中，设定的温度为50℃，压力为40MPa，夹带剂浓度为80％、乙醇流速为0.4mL/min、提取时间为4小时，二氧化碳流速为2.0L/h。提取产物用乙醇定容到50mL。从容量瓶内吸取部分蜂花粉试样溶液用纯水稀释10倍，取1.0mL待分析。 

4)液相色谱-串联质谱条件：同实施例1。 

5)测定方法 

定性测定：同实施例1。 

定量测定：同实施例1。 

6)结果：标准曲线相关系数为0.9994，添加回收率范围为 73.1-96.7％，相对标准偏差小于6.2％，检测限为0.1μg/g，定量限为0.3μg/g。 

7)鉴别方法： 

七种蜂花粉中山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(2→1)-β-D-葡萄糖苷的含量如下：籽瓜花粉551.7-583.1μg/g、油菜花粉2801.4-2879.5μg/g、芝麻花粉849.1-882.3μg/g、虞美人花粉3960.5-4230.6μg/g、荞麦花粉320.2-370.8μg/g、玉米花粉119.5-134.2μg/g和茶花花粉0.25-0.34μg/g。由于这七种蜂花粉中山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(2→1)-β-D-葡萄糖苷的含量差异明显，所以可以用该待测物质鉴别这七种蜂花粉。对比例1： 

参考《油菜蜂花粉中黄酮类化合物的提取与鉴别》(杨洁等，食品科学，2010年31卷(22期)273-278)，其中对油菜蜂花粉的提取处理方法为：76％乙醇，料液比为1：30，超声波时间为33min，超声波温度为51℃。 

具体方法为： 

1)精密称取0.0092g芦丁标准品用甲醇溶解并在棕色容量瓶中定容至50mL，制成0.184mg/mL的标准储备溶液，将其稀释成0.00368、0.00736、0.01104、0.01472、0.0184、0.02208mg/mL和0.02576mg/mL一系列浓度的标准溶液，采用AlCl₃法进行定性和定量分析。首先将反应液在200～600nm范围进行扫描，确定标准品经AlCl₃法反应后产物的最大特征吸收波长。并在该波长处测定不同浓度标准溶液经AlCl₃法反应后产物的吸光度，每个质量浓度梯度平行测定3次，绘制标准曲线 

2)蜂花粉样品前处理方法： 

油菜蜂花粉经粉碎机粉碎，过100目筛。准确称取2g花粉粉末放入三角锥形瓶中，并加入76％的乙醇溶液60mL，于超声波提取器中提取，进行3次重复提取实验，提取时间为33min。提取液经3500r/min 离心，量取20mL的上清液并加入体积分数25％盐酸溶液5mL，热回流酸解2h后，定容至50mL，摇匀，静置，放入4℃冰箱中冷藏，作为供试样品。 

3)色谱条件：流速1.0mL/min；进样体积：10μL；检测波长：340nm；色谱柱：Waters Symmetry C18；柱温：35℃；流动相：0.25％甲酸(A)和甲醇(B)。质谱条件：离子源：E S I；负离子模式，离子源电压：5.0kV；毛细管温度：275℃；毛细管电压：35kV；扫描范围m/z 100～800。 

4)测定方法 

定性测定：同实施例1。 

定量测定：同实施例1。 

5)结果：油菜蜂花粉样品中存在槲皮素、山奈酚和异鼠李素等3种黄酮类物质；即色谱峰6号是槲皮素(Rt＝37.06min)；9号对应的是山奈酚(Rt＝42.35min)；11号是异鼠李素(Rt＝43.33min) 

6)鉴别方法：该方法未对蜂花粉种类进行鉴别，但是说可以建立蜂花粉中黄酮类物质指纹图谱进行其植物源的真实属性判定提供研究方法，为进一步建立同种蜜源植物的蜂蜜与蜂花粉的内在联系提供实验依据。 

对比例1的方法利用液相色谱单级质谱全扫描的方式测定部分黄酮类物质，但是不包含本研究中的山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(2→1)-β-D-葡萄糖苷，此外单级质谱最大的缺点是特异性差，容易受基质干扰。 

和该方法相比，本发明提供的技术方案的优势为提取效率研究方法更为科学、萃取时间短、溶剂用量少，定性和定量方法更加准确，灵敏。 

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。