青霉素结合蛋白PBP6的β-内酰胺类抗生素受体法检测试剂盒制备方法及检测方法

摘要

本发明的目的是提供一种基于青霉素结合蛋白PBP6的β-内酰胺类抗生素受体法快速检测试剂盒的制备方法，及其使用检测方法，以解决传统ELISA方法检测β-内酰胺类药物时漏筛的问题。本发明公布了一种青霉素结合蛋白PBP6的β-内酰胺类抗生素受体法检测试剂盒制备方法，以及一种采用青霉素结合蛋白PBP6的β-内酰胺类抗生素受体法检测试剂盒对牛奶中β-内酰胺类药的含量的间接竞争受体法检测方法，本发明的有益效果是利用了青霉素结合蛋白6能与β-内酰胺类药物特异性结合的特点，能在缓冲液体系或者样本基质提取液中特异性地识别该类药物，不受到其它抗生素类如大环内酯类、喹诺酮类、四环素类的影响。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是应用生物技术检测兽药残留领域，涉及了一种基于青霉素结合蛋白PBP6的β-内酰胺类抗生素受体法快速检测试剂盒。

背景技术

β-内酰胺类抗生素(β-Lactam antibiotics)是一大类含有β内酰胺环结构的抗生素。根据β内酰胺环结构差异，该类抗生素主要包括青霉素类、头孢菌素类、头霉素类、碳青霉烯类和单环β-内酰胺类等，其中青霉素类和头孢菌素类发展最为迅速，应用最为广泛。

β-内酰胺类药物主要通过抑制细胞壁黏肽合成酶，即青霉素结合蛋白活性，阻止细胞壁肽聚糖的合成，使细菌菌体破裂而产生抗菌作用。由于哺乳动物细胞无细胞壁，因此此类药物对人、畜等一般无特殊影响，对细菌宿主毒性较小。

由于该类药物药效突出，在生产中应用时也存在一些问题，诸如药物滥用、不按照休药期停药、不同药物乱配伍等，导致药物疗效降低，也对相关动物性食品安全造成了隐患。β-内酰胺类药物目前最大的问题就是引起部分不适应人群的过敏反应，造成人体健康受损甚至死亡等，此外诸如致癌、致畸、致突变等也有研究报道。

由于存在各种潜在危害，目前世界范围内都对β-内酰胺类药物在动物源性食品中的残留限量做了严格规定，其中欧盟、美国、日本和中国的限量要求基本类似，如对青霉素类药物的要求大多数在4μg/L。

β-内酰胺类抗生素残留检测技术从最初的微生物学方法、薄层色谱法、到如今的大型仪器分析法如气相色谱及气质联用法、高效液相色谱法以及液质联用法和毛细管电泳法以及免疫学分析法等均有报道。近年来，微生物传感器、电化学传感器技术和生物传感器技术等也逐步被应用于此项研究。

青霉素结合蛋白(Penicillin binding proteins,PBPs)是广泛存在于细菌表面的一种膜蛋白，是β-内酰胺类抗生素的主要作用靶位。不同细菌其种类及含量均不相同。但各种菌种的PBPs又有许多类似的结构与功能，在细菌生长、繁殖中发挥重要作用。PBPs结构与数量的改变是产生细菌耐药的一个重要机制。由于能够和青霉素特异性结合，因而也被广泛应用于β-内酰胺类抗生素的残留检测中。申请号为CN201010139088.7和CN201110057523.6的中国发明专利等均是以青霉素结合蛋白2(PBP2)为基础建立了相应的检测方法，而利用青霉素结合蛋白6(PBP6)建立检测方法在公开号为CN203376330U、CN203385734U以及CN203376317U中公开了检测试纸条和试纸盒，但没有公开其制作方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于青霉素结合蛋白PBP6的β-内酰胺类抗生素受体法快速检测试剂盒的制备方法，及其使用检测方法，以解决传统ELISA方法检测β-内酰胺类药物时漏筛的问题。

本发明的技术方案如下：

一种序列为SEQ ID NO.1所示的青霉素结合蛋白PBP6的β-内酰胺类抗生素受体法检测试剂盒制备方法，步骤如下：

1)青霉素结合蛋白6的重组表达载体的构建及蛋白表达

人工合成青霉素结合蛋白6基因序列，根据基因序列设计合成一对引物，在引物中引入酶切位点NdeI和XhoI，以合成的基因为模板，用合成的引物进行基因扩增，扩增程序如下：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min30s，30个循环，72℃延伸5min，得到的基因扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳，电泳后通过胶回收试剂盒回收扩增产物。

回收的PCR产物和原核表达载体pET28a分别用NdeI和XhoI 37℃双酶切2h，酶切后用胶回收试剂盒进行回收；将回收的基因产物和pET28a用T4连接酶16℃连接2h，将连接产物全量转化DH5α感受态细胞，并涂布到含有卡那青霉素的LB平板上37℃倒置过夜培养；挑取单克隆菌落进行PCR鉴定，将阳性单克隆提取质粒进行双酶切鉴定，将双酶切鉴定正确的单克隆进行DNA测序，对测序结果进行比对，与所需的DNA完全一致。

将重组质粒转化表达菌株BL21(DE3)中，挑取单克隆菌株摇菌，以IPTG进行诱导表达，SDS-PAGE电泳检测表达结果；大量表达后以镍柱纯化，纯化的蛋白脱盐冻于液氮中备用。

2)青霉素结合蛋白6特异性单克隆抗体的制备

将纯化好的青霉素结合蛋白6以50μg/次·只的量免疫Balb/C小白鼠，初次免疫时与弗氏完全佐剂(sigma，F5881)等量混合，后续免疫时将PBP6与弗氏不完全佐剂(sigma，F5506)等量混合；3次免疫后采血测定血清效价，后续每次免疫后均采集血清测定效价；待血清效价大于1:1000(OD450nm>1.5)后，以100μg/次/只的PBP6进行加强免疫，并于加强免疫后72小时内将小鼠处死，收集其脾细胞与SP2/0细胞株进行融合，制备能分泌PBP6单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

使用PBP6筛选阳性细胞株，选择显色较好的细胞株以体内法生产腹水抗体，并以亲和层析法进行纯化，收集纯化后的抗体储藏备用；

3)辣根过氧化物酶标记青霉素结合蛋白6特异性单克隆抗体的制备

采用戊二醛法将辣根过氧化物酶(HRP)与PBP6单克隆抗体进行标记，具体操作如下：

(1)称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，室温静置过夜；

(2)反应后的酶溶液经SephadexG-25层析柱，用生理盐水洗脱；流速控制在1ml/min，收集棕色流出液；如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml；放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌；

(3)将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中；

(4)用1MpH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3小时；

(5)加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时；

(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时；

(7)3000rpm离心半小时，弃上清；沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15MPH7.4的PBS中；

(8)将上述溶液装入透析袋中，对0.15MPH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为HRP-PBP6，分装后，冰冻保存；

4)采用戊二醛法合成包被原氨苄青霉素与牛血清白蛋白偶联物(AMP-BSA)；

5)制作青霉素结合蛋白PBP6的β-内酰胺类抗生素受体法快速检测试剂盒

将AMP-BSA以包被缓冲液，其pH值为9.6，浓度为0.05M碳酸盐缓冲液，将其稀释到10μg/ml,以100μl每孔加入到酶标板中，37℃孵育2小时后，4℃过夜；甩干酶标板中的包被液，用洗涤缓冲液，其pH7.4，浓度为0.1M磷酸盐缓冲液，含有0.05％吐温20，洗板3次后，拍干备用；

6)组装试剂盒

试剂盒中的组份如下：

标准品溶液：用PBS溶解并稀释的氨苄青霉素溶液，浓度为0，0.05，0.2，0.8，2.4和9.6μg/L；

青霉素结合蛋白6溶液：以pH7.40.1M磷酸盐缓冲液稀释的PBP6，蛋白浓度为0.1mg/ml；

辣根过氧化物酶标记PBP6单克隆抗体溶液：以PBS稀释3000倍，并含有0.05％的叠氮钠作为防腐剂；

单组份TMB底物液；

终止液：1M硫酸溶液；

本发明还包括一种采用青霉素结合蛋白PBP6的β-内酰胺类抗生素受体法检测试剂盒对牛奶中β-内酰胺类药的含量的间接竞争受体法检测方法，具体步骤如下：

1)加标准品/牛奶样品：用移液器吸取50μl样品或者标准品加入到酶标板为空中，轻轻震荡后放置在水平桌面上；

2)加青霉素结合蛋白6：继续加入50μl青霉素结合蛋白6溶液，轻轻震荡酶标板，使其中的溶液均匀混合；

3)加酶标记单克隆抗体：将酶标记物以50μl每孔加入酶标板孔中后，轻轻震荡酶标板，使其中的溶液均匀混合；

4)孵育，洗板：将酶标板用盖板膜盖好后置于37℃温箱，孵育30min；取出后，甩掉孔中液体，洗板3次，排干；

5)加显色液，终止反应：每孔加入单组份显色底物100μl，轻轻震荡后，盖上酶标板，置于37℃温箱，孵育15min；完毕后，以50μl终止液终止反应；

6)读数：以酶标仪450nm读取数据，以630nm作为参比波长；

7)结果分析：以Logit-Log双对数曲线建立标准曲线，并分析样品检测结果。

本发明的有益效果是利用了青霉素结合蛋白6能与β-内酰胺类药物特异性结合的特点，能在缓冲液体系或者样本基质提取液中特异性地识别该类药物，不受到其它抗生素类如大环内酯类、喹诺酮类、四环素类的影响。

本发明利用基因重组方法制备得到了青霉素结合蛋白6，其能与β-内酰胺类抗生素广谱结合，且灵敏度较高；(2)基于青霉素结合蛋白6建立了受体法β-内酰胺类抗生素快速检测试剂盒及将其应用于食品中的该类药物残留检测。该试剂盒可以检测包括7种青霉素和5种头孢菌素类药物在内的12种β-内酰胺类抗生素，检测灵敏度高，操作简便，可用于各类食品中的β-内酰胺类抗生素的大规模筛选检测，非常适合于基层检测使用。

利用这种特异性识别的特性建立的受体法快速检测方法具有灵敏度高、特异性强的特点，对样品前处理要求较低，处理过程简单，能同时检测处理大批量样品。

本发明所提供的受体法快速检测试剂盒与传统的ELISA试剂盒相比较，检测药物种类多，克服了传统ELISA方法检测β-内酰胺类药物时漏筛的风险，在确保相关动物源性食品安全中将发挥重要作用。

具体实施方式

下面结合具体实施方式来进一步描述本发明。本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚，但这些实施例仅是范例性质，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或者替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。

实施例一、青霉素结合蛋白PBP6的β-内酰胺类抗生素受体法检测试剂盒制备方法

1)青霉素结合蛋白6的重组表达载体的构建及蛋白表达青霉素结合蛋白6序列来源于Genebank(编号P08506.2)或者其它同源序列，首先进行基因序列的人工合成，根据合成的序列设计一对引物，在引物中引入酶切位点NdeI和XhoI，引物序列如下：、上游引物P1:5’GGAATTC CATATGGCGGAACAAACCGTT 3’

下游引物P2:5’CCG CTCGAG TTAAGAGAACCAGCTGCCGA 3’

以合成的基因为模版进行PCR扩增，扩增程序如下：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min30s，30个循环，72℃延伸5min，得到的基因扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳，电泳后通过胶回收试剂盒回收扩增产物。

回收的PCR产物和原核表达载体pET28a分别用NdeI和XhoI 37℃双酶切2h，酶切后用胶回收试剂盒进行回收；将回收的基因产物和pET28a用T4连接酶16℃连接2h，将连接产物全量转化DH5α感受态细胞，并涂布到含有卡那青霉素的LB平板上37℃倒置过夜培养；挑取单克隆菌落进行PCR鉴定，将阳性单克隆提取质粒进行双酶切鉴定，将双酶切鉴定正确的单克隆进行DNA测序，对测序结果进行比对，与所需的DNA完全一致。

将构建成功的重组质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，37℃倒置过夜培养，挑取单克隆摇菌做表达检测，通过SDS-PAGE胶鉴定表达量高的单克隆菌株保存甘油菌。将甘油菌以1:1000的比例接种至50ml含有50μg/ml Kan的LB液体培养基中，37℃210rpm过夜培养，5000rpm 10min离心收集菌体，用5ml LB液体培养基重悬，然后加入到含有50μg/ml Kan的1L LB液体培养基中37℃210rpm培养至OD600达0.6，加入终浓度1mM IPTG 20℃195rpm过夜诱导表达。5000rpm 10min离心收集菌体，收集的菌体用50mM Hepes 500mM NaCl 5mM咪唑pH 7.4重悬备用。

将菌悬液加入蛋白酶抑制剂，在冰浴条件下超声破碎，超声破碎的溶液4℃18000rpm 30min离心去除沉淀，上清用0.22μm滤膜过滤备用。将蛋白通过镍柱亲和层析的方法纯化，所用Buffer A(50mM Hepes 500mM NaCl 5mM咪唑pH 7.4)，BufferB(50mM Hepes 500mM NaCl 500mM咪唑pH 7.4)。最终纯化的蛋白脱盐冻于液氮中备用。

2)青霉素结合蛋白6特异性单克隆抗体的制备

将纯化好的青霉素结合蛋白6以50μg/次·只的量免疫Balb/C小白鼠，初次免疫时与弗氏完全佐剂(sigma，F5881)等量混合，后续免疫时将PBP6与弗氏不完全佐剂(sigma，F5506)等量混合。3次免疫后采血测定血清效价，后续每次免疫后均采集血清测定效价。待血清效价大于1:1000(OD450nm>1.5)后，以100μg/次/只的PBP6进行加强免疫，并于加强免疫后72小时内将小鼠处死，收集其脾细胞与SP2/0细胞株进行融合，制备能分泌PBP6单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

使用PBP6筛选阳性细胞株，选择显色较好的细胞株以体内法生产腹水抗体，并以亲和层析法进行纯化，收集纯化后的抗体储藏备用。

3)辣根过氧化物酶标记青霉素结合蛋白6特异性单克隆抗体的制备

采用戊二醛法将辣根过氧化物酶(HRP)与PBP6单克隆抗体进行标记，具体操作如下：

(1)称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，室温静置过夜。

(2)反应后的酶溶液经SephadexG-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/min，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。

(3)将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。

(4)用1MpH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3小时。

(5)加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。

(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。

(7)3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15MPH7.4的PBS中。

(8)将上述溶液装入透析袋中，对0.15MPH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为HRP-PBP6，分装后，冰冻保存。

4)包被原氨苄青霉素与牛血清白蛋白偶联物(AMP-BSA)的制备

采用戊二醛法合成AMP-BSA。

5)制作青霉素结合蛋白PBP6的β-内酰胺类抗生素受体法快速检测试剂盒

将AMP-BSA以包被缓冲液(pH9.60.05M碳酸盐缓冲液)稀释到10μg/ml,以100μl每孔加入到酶标板中，37℃孵育2小时后，4℃过夜。甩干酶标板中的包被液，用洗涤缓冲液(pH7.40.1M磷酸盐缓冲液，含有0.05％吐温20)洗板3次后，拍干备用。

试剂盒中的其它组份如下：

标准品溶液：用PBS溶解并稀释的氨苄青霉素溶液，浓度为0，0.05，0.2，0.8，2.4和9.6μg/L；

青霉素结合蛋白6溶液：以pH7.40.1M磷酸盐缓冲液稀释的PBP6，蛋白浓度为0.1mg/ml；

辣根过氧化物酶标记PBP6单克隆抗体溶液：以PBS稀释3000倍，并含有0.05％的叠氮钠作为防腐剂；

单组份TMB底物液：商品化成品；

终止液：1M硫酸溶液。

实施例二、牛奶中β-内酰胺类药的含量的间接竞争受体法检测方法

以牛奶样本为例，检测时无须任何前处理，直接点到酶标板即可。具体步骤如下：

(1)加标准品/样品：用移液器吸取50μl样品或者标准品加入到酶标板为空中，轻轻震荡后放置在水平桌面上。

(2)加青霉素结合蛋白6：继续加入50μl青霉素结合蛋白6溶液，轻轻震荡酶标板，使其中的溶液均匀混合；

(3)加酶标记单克隆抗体：将酶标记物以50μl每孔加入酶标板孔中后，轻轻震荡酶标板，使其中的溶液均匀混合；

(4)孵育，洗板：将酶标板用盖板膜盖好后置于37℃温箱，孵育30min。取出后，甩掉孔中液体，洗板3次，排干；

(5)加显色液，终止反应：每孔加入单组份显色底物100μl，轻轻震荡后，盖上酶标板，置于37℃温箱，孵育15min。完毕后，以50μl终止液终止反应。

(6)读数：以酶标仪450nm读取数据，以630nm作为参比波长。

(7)结果分析：以Logit-Log双对数曲线建立标准曲线，并分析样品检测结果。

实施例三、试剂盒的准确度和精密度测试

取空白的牛奶样本20份，将其中添加青霉素G标准品，使其浓度达到4μg/L，用制备好β-内酰胺类受体法试剂盒按操作说明进行操作，检测其中的青霉素G含量，计算样品回收率作为准确度的测定结果，同时以测定结果的变异系数作为试剂盒的精密度。具体测定结果如下表所示。

表1 准确度和精密度测定结果

样品编号测定结果测定结果测定结果测定结果1号-5号92.5％105.0％90.0％70.0％6号-10号67.5％85.0％102.5％72.5％11号-15号107.5％80.0％92.5％90.0％16号-20号100.0％90.0％95.0％105.0％平均回收率90.3％变异系数13.9％

由表可以知道，试剂盒对牛奶样品的检测在添加4μg/L青霉素G时，回收率在67.5％～107.5％，平均回收率为90.3％，变异系数为13.9％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。