功能化氧化石墨烯负载纳米银抗菌材料及制备方法和应用

摘要

本发明属于纳米银抗菌材料技术领域，公开了一种氨基化聚乙二醇功能化氧化石墨烯负载纳米银抗菌材料及制备方法和在抑菌、杀菌领域中的应用。该方法包括以下步骤：将氨基化聚乙二醇加入氧化石墨烯的水溶液中，再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，调节pH后搅拌反应，得到氨基化聚乙二醇修饰的氧化石墨烯；将其配成水溶液，加入硝酸银，待溶解后加热至沸腾，加入柠檬酸钠或NaBH4水溶液，反应，冷却，得到氨基化聚乙二醇功能化氧化石墨烯负载纳米银抗菌材料。本发明制备得到抗菌材料具有良好的水溶性和稳定性，且负载效率、抗菌活性得到显著提高，具有显著的抗菌活性，可广泛应用于抑菌、杀菌领域。

说明书

技术领域

本发明属于纳米银抗菌材料技术领域，特别涉及一种氨基化聚乙二醇功能 化氧化石墨烯负载纳米银抗菌材料及其制备方法和在抑菌、杀菌等领域中的应 用。

背景技术

健康是人们最为关注的话题之一，然而，细菌无处不在、无孔不入，它们 的传播和蔓延严重威胁着人类的健康。利用抗菌材料来杀灭和抑制有害细菌的 生长、繁殖是提高人类健康水平的一个重要手段。

针对细菌对抗菌素产生的耐药性，研发出更高效的抗菌药物尤其是抑制耐 药细菌药物是目前医药领域的重要策略。在众多的抗菌材料中，无机抗菌剂具 有对人体的毒副作用较低，环境污染小等优点，引起人们的高度重视。无机抗 菌剂主要包括Ag、Cu、Zn、Ti等金属及其离子，它们具有杀灭细菌或者降低 细菌的繁殖、生长能力的特性。无机抗菌剂中，目前研究最多、开发和应用较 快、商业化应用最多的是Ag系无机抗菌剂。因为Ag的杀菌能力最强，其杀 菌强度约为Zn²⁺的1000倍。由于Hg、Cd、Pb和Cr等其它金属的毒性较大， 目前无机抗菌剂使用的主要为Ag、Cu和Zn。耐热性好、抗菌谱广、有效抗 菌期长、毒性较低、不会产生耐药性等是Ag系无机抗菌剂具有的显著优点。 但是，与此同时，Ag系无机抗菌剂也具有易变色、制备相对困难等的缺点。

针对纳米银价格高、难分散和易氧化变色的缺点，近年来研究发现载体纳 米化，可使抗菌材料具有更大的比表面积，负载效率高，对微生物产生更强的 吸附作用，从而表现出更好的抗菌效果。石墨烯是单原子厚度的二维碳材料， 具有高比表面积、突出的导热性能和力学性能、非凡的电子传递性能等一系列 优异性质，是功能材料的理想载体，其衍生物氧化石墨烯在具备石墨烯以上性 质之外，还带有丰富的官能团，如羟基(-OH)、羧基(-COOH)、羰基(-C＝O)， 这些基团的存在对氧化石墨烯能够进行功能化修饰。近年来纳米材料的形貌和 粒径对抗菌性能影响的研究越来越受到人们的关注，人们希望寻找到高效且不 产生耐药的抗菌材料，即通过制备不同形貌或者不同粒径的纳米材料作为抗菌 材料，从而发现最佳的抗菌纳米形貌和粒径。如今不同形貌及粒径的纳米已经 成为新纳米制备的一个主攻方向，希望此研究为临床提供新的治疗途径和有效 药物，在抗菌研究上实现重大突破。

至今未发现有关氨基化聚乙二醇功能化氧化石墨烯负载不同粒径的纳米 银抗菌材料及其用于抑菌、杀菌的报道。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种氨 基化聚乙二醇功能化氧化石墨烯负载纳米银抗菌材料的制备方法。本发明利用 氨基化聚乙二醇对载体氧化石墨烯进行功能化，提高了氧化石墨烯负载纳米银 的稳定性以及在抑菌、杀菌过程中的生物活性，增加纳米银抗菌活性的有效性 及抗菌材料的持续性。

本发明另一目的在于提供上述方法制备的氨基化聚乙二醇功能化氧化石 墨烯负载纳米银抗菌材料。本发明的纳米银抗菌材料中纳米银可具有不同的粒 径，且在特定粒径范围内具有显著优异的抗菌效果。

本发明再一目的在于提供上述氨基化聚乙二醇功能化氧化石墨烯负载纳 米银抗菌材料在抑菌、杀菌等领域中的应用。其中，负载的纳米银为主要活性 成分，具有抑制细菌生长和杀菌的功能。

本发明的目的通过下述方案实现：

一种氨基化聚乙二醇功能化氧化石墨烯负载纳米银抗菌材料的制备方法， 包括以下步骤：

(1)水浴超声条件下，将氨基化聚乙二醇加入氧化石墨烯的水溶液中， 再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基 琥珀酰亚胺(NHS)，调节pH后搅拌反应，得到氨基化聚乙二醇修饰的氧化 石墨烯(GO@PEG)；

(2)将步骤(1)制备得到的氨基化聚乙二醇修饰的氧化石墨烯配成水溶 液，加入硝酸银，待溶解后加热至沸腾，加入柠檬酸钠或NaBH₄水溶液，反 应，冷却，得到氨基化聚乙二醇功能化氧化石墨烯负载纳米银抗菌材料 (GO@PEG@AgNps)。

步骤(1)中所用氧化石墨烯与氨基化聚乙二醇的质量比优选为1:1～1:2。

步骤(1)所用氧化石墨烯与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸 盐(EDC·HCl)的质量比优选为1:2～1:2.5。

步骤(1)所用氧化石墨烯与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的质量比优选为 1:4～1:5。

步骤(2)中所用氨基化聚乙二醇修饰的氧化石墨烯和硝酸银的质量比优 选为1:1～1:2。

步骤(2)中所用硝酸银和柠檬酸钠的质量比优选为1:1～1:2。

步骤(2)中所用硝酸银和NaBH₄的用量摩尔比优选为6:1～1:1。

本发明中主要通过添加柠檬酸钠或NaBH₄实现纳米银的制备及对其粒径 大小的控制，并通过调节柠檬酸钠或NaBH₄的用量大小可制备得到不同粒径 的纳米银。

步骤(1)中所述氧化石墨烯的水溶液的浓度优选为1～5mg/mL。步骤(1) 中所述调节pH指调节pH至弱酸性，优选为5～6。

步骤(1)中所述的水浴超声优选超声功率为60W。

步骤(1)中所述搅拌反应的时间优选为10～12h。

步骤(1)中所用的氧化石墨烯为使用常规Hummers法氧化处理石墨烯得 到的氧化石墨烯即可。

步骤(1)中所述反应在室温下进行即可。

步骤(1)中反应完成后可通过离心或过滤进行分离，得到的固体即为氨 基化聚乙二醇修饰的氧化石墨烯。分离得到的氨基化聚乙二醇修饰的氧化石墨 烯优选冷冻干燥后备用。

步骤(2)中所述氨基化聚乙二醇修饰的氧化石墨烯的水溶液浓度优选为 1～5mg/mL。

步骤(2)中所用NaBH₄水溶液的浓度优选为10～50mMol/L。

步骤(2)中所述反应的时间优选为0.5～1h。

上述本发明方法制备得到的氨基化聚乙二醇功能化氧化石墨烯负载纳米 银抗菌材料(GO@PEG@AgNps)，其中氧化石墨烯由氨基化聚乙二醇功能化， 再负载纳米银，功能化的氧化石墨烯增强了其负载的纳米银的稳定及分散性， 并提高了负载效率，且负载的纳米银粒径范围可调。本发明研究表明，本发明 制备得到的抗菌材料的抗菌活性与负载的纳米银的粒径相关，优选为10～80 nm，最优选为10nm，此时，制备得到的抗菌材料的抗菌效果最佳。

本发明方法制备得到的氨基化聚乙二醇功能化氧化石墨烯负载纳米银抗 菌材料(GO@PEG@AgNps)采用氨基化聚乙二醇功能化氧化石墨烯，提高了 其负载纳米银的稳定性，及纳米银的生物活性，增加了纳米材料抗菌活性的有 效性，可广泛应用于各种抑菌、杀菌领域中。

本发明的机理为：

本发明利用氨基化的聚乙二醇(PEG)等水溶性好的物质修饰的氧化石墨 烯具有好的水溶性和生物相容性，使其能够稳定存在。同时，氨基化的聚乙二 醇带正电荷，能够诱导更多的带负电的纳米银负载在氧化石墨烯上，不仅提高 了氧化石墨烯的负载效率、纳米银的生物活性，增加了纳米材料抗菌活性的有 效性，并且能够形成稳定的复合抗菌纳米材料。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

(1)本发明制备得到多种粒径纳米银的功能化氧化石墨烯负载纳米银抗 菌材料；

(2)本发明制备得到的功能化氧化石墨烯负载纳米银抗菌材料具有良好 的水溶性和稳定性，且其负载效率、抗菌活性得到显著提高。

(3)本发明制备方法步骤简单，直接将功能化的氧化石墨烯与硝酸银在 还原剂作用下耦合，制备过程无需添加其它辅助试剂、产物体系简单，产品可 直接保存和使用。

附图说明

图1是实施例1中氨基化聚乙二醇修饰的氧化石墨烯形貌图。

图2是功能化氧化石墨烯负载不同粒径纳米银形貌图。

图3是功能化氧化石墨烯负载不同粒径的纳米银的MTT抗菌实验图。

图4是不同粒径功能化氧化石墨烯负载纳米银抗菌材料的平板抑制细菌 生长实验图。

图5是不同粒径功能化氧化石墨烯负载纳米银抗菌材料破坏细菌细胞膜 的实验图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方 式不限于此。

本发明所用原料的纯度只要达到化学纯以上即可，来源均可从市场购得。

实施例1：氨基化聚乙二醇功能化氧化石墨烯负载纳米银抗菌材料的制备

(1)氧化石墨烯的制备，采用常规Hummers法，具体步骤如下：称取1 g石墨粉置于圆底烧瓶中，再加入6g高锰酸钾混合均匀，然后加入131mL 浓硫酸和浓磷酸混合酸(体积比9:1)。先将上述反应物加热至35～40℃搅拌 均匀，然后加热至50℃并搅拌12h。反应完成后将反应物冷却至室温并倒入 100mL冰水中，滴加3mL的30％H₂O₂。将混合物通过金属标准测试筛选筛 (W.S.Tyler，300μm)，然后将滤液在6000rpm下离心分离1h，舍弃上清液， 下层固体物质依次用200mL水，200mL 30％的HCl和200mL乙醇各离心洗 涤2次，将溶液再次离心，舍弃上清液。将得到的下层物质冷冻干燥12h，得 到氧化石墨烯(GO)。

(2)将步骤(1)所得到的氧化石墨烯配制成浓度为1mg/mL的溶液。 取50mL该溶液在水浴中超声，然后，称取50mg的氨基化聚乙二醇(PEG) 加入到上述GO溶液中，再加入100mg EDC.HCl和200mg NHS，将该混合 物的pH值调节(采用HCl调节)为5～6，在25℃下搅拌反应12h，反应完 成后将溶液在6000rpm下离心1h，将上层清液舍弃，下层物质冷冻干燥12h， 即得到氨基化聚乙二醇修饰的氧化石墨烯(GO@PEG)。通过TEANAI-10型 透射电子显微镜(TEM)观察，如图1所示。将其分散于水溶液中，得到纳 米粒子的分散体系，其粒径在400～500nm。该纳米粒子能在室温下稳定存在， 容易保存。

(3)将上述制备得到的GO@PEG用蒸馏水配制成浓度为1mg/mL的溶 液，取10mL并加入10mg硝酸银粉末，待硝酸银溶解后，将溶液加热至沸 腾，加入20mg柠檬酸钠的粉末，进一步沸腾回流1h。冷却到室温下，即可 制备得到氨基化聚乙二醇功能化氧化石墨烯负载纳米银抗菌材料，其中负载的 纳米银的粒径约为10nm。

实施例2：氨基化聚乙二醇功能化氧化石墨烯负载纳米银抗菌材料的制备

(1)氧化石墨烯的制备同实施例1

(2)氨基化聚乙二醇修饰的氧化石墨烯(GO@PEG)的制备同实施例1。

(3)将上述制备得到的GO@PEG用蒸馏水配制1mg/mL的溶液，取10 mL并加入10mg硝酸银粉末，待硝酸银溶解后，将溶液加热至沸腾，加入15 mg柠檬酸钠的粉末，进一步沸腾回流1h，冷却到室温下，即可制备得到氨基 化聚乙二醇功能化氧化石墨烯负载纳米银抗菌材料，其中负载的纳米银的粒径 约为30nm。

实施例3：氨基化聚乙二醇功能化氧化石墨烯负载纳米银抗菌材料的制备

(1)氧化石墨烯的制备同实施例1

(2)氨基化聚乙二醇修饰的氧化石墨烯(GO@PEG)的制备同实施例1。

(3)将上述制备得到的GO@PEG用蒸馏水配制1mg/mL的溶液，取10 mL并加入10mg硝酸银粉末，待硝酸银溶解后，将溶液加热至沸腾，加入10 mg柠檬酸钠的粉末，进一步沸腾回流1h。冷却到室温下，即可制备得到氨基 化聚乙二醇功能化氧化石墨烯负载纳米银抗菌材料，其中负载的纳米银的粒径 约为50nm。

实施例4：氨基化聚乙二醇功能化氧化石墨烯负载纳米银抗菌材料的制备

(1)氧化石墨烯的制备同实施例1。

(2)将步骤(1)所得到的氧化石墨烯配制5mg/mL的溶液。取10mL 该溶液在水浴中超声1h，然后，称取75mg的氨基化聚乙二醇(PEG)加入 到上述GO溶液中，再加入125mg EDC.HCl和250mg NHS，将该混合物的 pH值调节(用HCl调节)为5～6，在25℃下搅拌反应12h，反应完成后将 溶液在6000rpm下离心1h，将上层清液舍弃，下层物质冷冻干燥12h，即得 到氨基化聚乙二醇修饰的氧化石墨烯(GO@PEG)。将其分散于水溶液中，得 到纳米粒子的分散体系，其粒径在400～500nm。该纳米粒子能在室温下稳定 存在，容易保存。

(3)将上述制备得到的GO@PEG用蒸馏水配制1mg/mL的溶液，取10 mL并加入10mg硝酸银粉末，待硝酸银溶解后，将溶液加热至沸腾，加入20 mg柠檬酸钠的粉末，进一步沸腾回流1h。冷却到室温下，即可制备得到氨基 化聚乙二醇功能化氧化石墨烯负载纳米银抗菌材料，其中负载的纳米银的粒径 约为10nm。

实施例5：氨基化聚乙二醇功能化氧化石墨烯负载纳米银抗菌材料的制备

(1)氧化石墨烯的制备同实施例1。

(2)将步骤(1)所得到的氧化石墨烯配制2mg/mL的溶液。取25mL 该溶液在水浴中超声，然后，称取100mg的氨基化聚乙二醇(PEG)加入到 上述GO溶液中，再加入100mg EDC.HCl和200mg NHS，将该混合物的pH 值调节(用HCl调节)为5～6，在25℃下搅拌反应12h，反应完成后将溶液 在6000rpm下离心1h，将上层清液舍弃，下层物质冷冻干燥12h，即得到氨 基化聚乙二醇修饰的氧化石墨烯(GO@PEG)。将其分散于水溶液中，得到纳 米粒子的分散体系，其粒径在400～500nm。该纳米粒子能在室温下稳定存在， 容易保存。

(3)将上述制备得到的GO@PEG用蒸馏水配制1mg/mL的溶液，取10 mL并加入15mg硝酸银粉末，待硝酸银溶解后，将溶液加热至沸腾，加入10 mg柠檬酸钠的粉末，进一步沸腾回流1h。冷却到室温下，即可制备得到氨基 化聚乙二醇功能化氧化石墨烯负载纳米银抗菌材料，其中负载的纳米银的粒径 约为50nm。

实施例6：氨基化聚乙二醇功能化氧化石墨烯负载纳米银抗菌材料的制备

(1)氧化石墨烯的制备同实施例1。

(2)氨基化聚乙二醇修饰的氧化石墨烯(GO@PEG)的制备同实施例1。

(3)将上述制备得到的GO@PEG用蒸馏水配制1mg/mL的溶液，取10 mL并加入10mg硝酸银粉末，待硝酸银溶解后，将溶液加热至沸腾，加入1mL 浓度为10mMol/L的NaBH₄溶液，搅拌30min，冷却到室温下，即可制备得 到氨基化聚乙二醇功能化氧化石墨烯负载纳米银抗菌材料，其中负载的纳米银 的粒径约为80nm。

实施例7：氨基化聚乙二醇功能化氧化石墨烯负载纳米银抗菌材料的性能 测定

(1)通过TEANAI-10型透射电子显微镜(TEM)观察实施例1～3和实 施例6制备得到的氨基化聚乙二醇功能化氧化石墨烯负载纳米银抗菌材料的 粒径，结果见图2。由图可见，本发明制备得到粒径分布为10～80nm的纳米 银，并成功负载在氨基化聚乙二醇功能化氧化石墨烯上，且上述四种粒子均能 在室温下稳定存在，容易保存。

(2)实施例1～3和实施例6制备得到的氨基化聚乙二醇功能化氧化石墨 烯负载纳米银抗菌材料作为抗菌材料的的抑菌实验：

本实验选择多种购自广东省菌种保藏中心的菌株，包括大肠杆菌、金黄色 葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、耐药大肠杆菌、耐药金黄色葡萄球菌、 耐药枯草芽孢杆菌、耐药绿脓杆菌。所试样品编号为：a、实施例1的纳米银 粒径为10nm的功能化氧化石墨烯负载纳米银抗菌材料；b、实施例2的纳米 银粒径为30nm的功能化氧化石墨烯负载纳米银抗菌材料；c、实施例3的纳 米银粒径为50nm的功能化氧化石墨烯负载纳米银抗菌材料；d、实施例6的 纳米银粒径为80nm的功能化氧化石墨烯负载纳米银抗菌材料。

①MTT测试方法

取处于对数生长期的细菌，调整活细胞浓度为1×10⁶CFU/mL加于96孔 培养板，每孔9μL，再分别加入不同浓度10μL上述四种样品溶液，阴性对照 为等体积PBS缓冲液，加样组和对照组均设4个复孔置于37℃，培养24h， 然后加入MTT(5mg/mL)20μL/孔，在空气振荡培养箱中继续培养4h，然 后加入三联溶液100μL孔，采用振荡器使其混合均匀，然后继续在37℃下培 养，放置过夜。用酶标仪在570nm波长下测定OD值。计算细胞存活率，结 果见图3。

细菌存活率(％)＝加药孔的实际OD值/阴性对照孔的OD值；

细菌抑制率(％)＝100％-细胞存活率；

②平板稀释法抑制细菌生长实验

将细菌培养在培养基在37℃过夜得到对数期的细菌。调整细菌悬浮液使 其浓度接近1×10⁶CFU/mL。随后，50μL的细菌悬浮液的接种均匀地在LB 琼脂平板上。然后，分别将20μL浓度为15μg/mL上述四种样品加入到LB 琼脂平板的并涂布均匀，并在37℃下保温过夜。观察细菌的生长密度，结果 见图4。

③最小抗菌浓度(MIC)实验

取生长期达到对数期的细菌，将细菌稀释浓度约1×10⁶CFU/mL。然后将 上述四种样品稀释成一系列浓度分别加入到含菌培养基中，置37℃共同孵育8 h。通过酶标仪测定600nm处的光密度值进行评估(OD ₆₀₀)。在受试样品中浊 度最接近对照组浊度的最低浓度即为最小抑菌浓度，每个实验平行三个，结果 见表1～2。

表1功能化氧化石墨烯负载纳米银抗菌材料的最小抗菌浓度

注：使用的菌株编号，大肠杆菌K12，金黄色葡萄球菌ATCC25213，绿脓杆菌GF31， 枯草芽孢杆菌ATCC6633。

表2功能化氧化石墨烯负载纳米银抗菌材料对耐药细菌的最小抗菌浓度

注：使用的菌株编号，耐药大肠杆菌CICC10662，耐药金黄色葡萄球菌S4050，耐药 绿脓杆菌ATCC9027，耐药枯草芽孢杆菌ATCC9327。

④功能化氧化石墨烯负载纳米银抗菌材料破坏细菌细胞膜实验

收集细菌细胞，并用PBS洗涤两次，加入20μL浓度为15μg/mL的上述 四种样品加入含菌液中在37℃下共同孵育2h，然后用2.5％戊二醛溶液固定2 h。然后将样品按序分别用50、70、85、90和100％的乙醇脱水10min，然后 镀金膜，用扫描电子显微镜(SEM)观察细菌形态的变化，结果见图5。

由图1～5和表1～2可见，本发明制备得到了负载有不同粒径纳米银的氨 基化聚乙二醇功能化氧化石墨烯负载纳米银抗菌材料，且上述体系均可稳定、 长期保存和使用。且本发明的抗菌材料对于多种细菌及其耐药细菌有显著的抗 菌活性，且抗菌活性随制备得到的纳米银粒径变化而变化，在纳米银粒径为 10nm时有最优的抗菌效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实 施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、 替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。