能够促进丹参毛状根中丹参酮积累的诱导方法

摘要

本发明公开了一种能够促进丹参毛状根中丹参酮积累的诱导方法，包括以下步骤：1)、丹参毛状根的初培养：在每50mL的6，7-V培养基接种0.15～0.2g丹参毛状根，于100～150rpm、24～26℃的培养条件下黑暗培养17～19天；2)、丹参毛状根的继续培养：然后添加硝酸铈，使6，7-V培养基中硝酸铈的终浓度为45～55μM；于100～150rpm、24～26℃的培养条件下黑暗培养(诱导培养)5～7天。采用本发明的方法能够促进丹参毛状根中丹参酮(包括隐丹参酮和二氢丹参酮I)的积累。

说明书

技术领域

本发明涉及一种能够促进丹参毛状根中隐丹参酮和二氢丹参酮I积累的诱导方法。

背景技术

丹参(Salvia miltiorrhiza)为唇形科植物丹参的根及根茎，有活血祛瘀，清热安神、养血 益气之功效。丹参酮是丹参的主要有效成分之一，主要包括隐丹参酮和二氢丹参酮I。由于在 治疗心血管系统疾病中的突出表现和无毒负作用的特点，丹参的应用和研究也越来越广泛。

目前现有的丹参毛状根可采用6,7-V培养基进行培养。一般称取新鲜毛状根0.15～0.2g接 种于50mL的6,7-V培养基中进行黑暗培养。

含30g/L蔗糖的6,7-V培养基的配方如表1所示，pH值为5.8，121℃灭菌20 min。

表1、6,7-V培养基的配方

硝酸铈的主要用途为：用于制造煤气灯网罩、药物、试剂，并用于原子能、电子管等工 业。其对植物种子的发芽、生根和生长具有刺激促进作用，能提高农作物的质量和产量。有 报道显示，1mM硝酸铈诱导处理可以提高红豆杉中紫杉醇的的产量。但是，目前没有关于 硝酸铈能用于促进丹参毛状根中丹参酮积累的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种能够促进丹参毛状根中丹参酮(包括隐丹参酮和二 氢丹参酮I)积累的诱导方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种能够促进丹参毛状根中丹参酮积累的诱导方 法，包括以下步骤：

1)、丹参毛状根的初培养：

在每50mL的6，7-V培养基接种0.15～0.2g丹参毛状根，于100～150rpm、24～26℃的 培养条件下黑暗培养17～19天；

2)、丹参毛状根的继续培养：

然后添加硝酸铈，使6，7-V培养基中硝酸铈的终浓度为45～55μM；于100～150rpm、 24～26℃的培养条件下黑暗培养(诱导培养)5～7天；从而实现促进丹参毛状根中丹参酮(隐 丹参酮和二氢丹参酮I)的积累。

作为本发明的能够促进丹参毛状根中丹参酮积累的诱导方法的改进：

步骤2)中硝酸铈的终浓度为50μM。

作为本发明的能够促进丹参毛状根中丹参酮积累的诱导方法的进一步改进：

步骤1)和步骤2)的培养条件均为：110rpm，25℃，

步骤1)的黑暗培养时间为18天，步骤2)的黑暗培养时间为6天。

备注说明：

1、所述步骤1)和2)均在超净台中进行，此属于常规技术。

2、本发明所用的丹参毛状根为采用发根农杆菌(ATCC15834)侵染丹参试管无菌苗获得； 从生长旺盛的毛状根中选取色泽新鲜的部分；此也属于常规技术。

收集经本发明方法诱导处理后的丹参毛状根，用蒸馏水冲洗，再用干净的纸吸干水份， 最后在50～60℃烘箱中干燥至恒重后进行隐丹参酮和二氢丹参酮I的含量检测(为常规技术)。 例如可采用以下方法：

干燥毛状根研钵中磨碎，过0.45mm筛，精密称取0.02g，放入5mL离心管中，加入2.5mL 甲醇-水(7:3的体积比)提取液，于40K HZ下超声提取45min，提取液12000rpm离心15min， 取上清液过0.45μm滤膜，备用。

色谱条件为：以A乙腈和B 0.01％磷酸水溶液为流动相，Waters 2996二极管阵列检测器 检测，流速1.0mL/min，柱温30℃，测定隐丹参酮和二氢丹参酮I含量。

以取消步骤2)中硝酸铈的使用为对照(CK)，即，对照中硝酸铈的终浓度为0μM。

结果表明(如图1所示)：本发明的50μM硝酸铈处理时隐丹参酮和二氢丹参酮I含量 分别达到0.27mg/g和0.87mg/g，与对照(不添加硝酸铈)相比均有了大大提高。因此，本发 明能够显著促进隐丹参酮和二氢丹参酮I的积累。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为不同浓度的硝酸铈诱导处理时，二氢丹参酮I、隐丹参酮的成分含量对比图。

具体实施方式

实施例1、一种能够促进丹参毛状根中丹参酮(隐丹参酮和二氢丹参酮I)积累的诱导方 法，依次进行以下步骤：

1)、丹参毛状根的初培养：

在超净台中，称取0.2g丹参毛状根放入装有50ml的6，7-V培养基中(100ml锥形瓶， pH：5.8)，摇床转速110rpm，25℃下黑暗培养18天。

2)、丹参毛状根的继续培养：

丹参毛状根培养18天后，添加硝酸铈，使6，7-V培养基中硝酸铈的终浓度为50μM； 于110rpm，25℃的黑暗条件下诱导培养6天。

诱导6天后收集毛状根，用蒸馏水冲洗，再用干净的纸吸干水份，最后在50～60℃烘箱 中干燥至恒重后进行隐丹参酮和二氢丹参酮I的含量检测。

以取消步骤2)中硝酸铈的使用为对照(CK)，即，对照中硝酸铈的终浓度为0μM。

所得结果如图1所示：

结果表明50μM硝酸铈处理隐丹参酮和二氢丹参酮I含量分别达到0.27mg/g和0.87mg/g, 而CK中隐丹参酮和二氢丹参酮I含量分别为0.05mg/g和0.24mg/g。

因此，本发明与对照相比分别提高了4.93倍和3.71倍。

对比例1、将实施例1中硝酸铈的终浓度由50μM分别改成5、20、100、200μM，其余 等同于实施例1。

所得结果如图1所示。

根据图1，我们得知：5、20、100和200μM浓度下的硝酸铈处理效果均不如本发明的50 μM浓度的硝酸铈处理效果显著。

对比例2-1、将实施例1步骤1)中黑暗培养的时间由18天改成20天，相应的将步骤2) 的诱导时间由6天改成4天；其余等同于实施例1。

对比例2-2、将实施例1步骤1)中的黑暗培养的时间由18天改成16天，相应的将步骤 2)的诱导时间由6天改成8天；其余等同于实施例1。

对比例3-1、将硝酸铈改成硝酸镍，浓度保持不变；其余等同于实施例1。

对比例3-2、将5硝酸铈改成硫酸硒，浓度保持不变；其余等同于实施例1。

将上述对比例2-1～对比例3-2所得的丹参毛状根按照实施例1所述方法进行隐丹参酮和 二氢丹参酮I含量的检测，所得结果如下表2所述：

表2

  隐丹参酮(mg/g) 二氢丹参酮I含量(mg/g) 对比例2-1 0.2 0.61 对比例2-2 0.22 0.65 对比例3-1 0.15 0.58 对比例3-2 0.18 0.67 实施例1 0.27 0.87

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不 限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导 出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。