一种小麦丛矮病抗性的规模化定量强化接种鉴定方法

摘要

本发明公开了一种小麦丛矮病抗性的规模化定量强化接种鉴定方法，该方法步骤如下：（a）、获取大田灰飞虱并分离纯化出大量整齐一致的5龄灰飞虱若虫；（b）、繁育并分离筛选出大量整齐一致2龄灰飞虱若虫；（c）、对获取的2龄灰飞虱若虫饲毒；（d）、计量灰飞虱若虫；（e）、将待测小麦品种与带毒2龄灰飞虱若虫定量共育传毒；（f）、大田显症统计：将待测小麦移栽至大田隔虫网室，抽穗期调查统计丛矮病穴发病率，即可准确鉴定出待测小麦品种的抗病能力。本发明的规模化强化接种鉴定方法克服了排趋性的干扰和灰飞虱规模量获取的难题，实现了定量而强化的小麦丛矮病接种鉴定，能够准确地评价小麦品种对小麦丛矮病的抗性水平。

说明书

技术领域

本发明涉及一种小麦丛矮病抗性的规模化定量强化接种鉴定方法，属于植物病害抗性鉴定技术。

背景技术

小麦是小麦属植物的统称，是一种在世界各地广泛种植的禾本科植物，最早起源于中东的新月沃土地区。小麦是三大谷物之一，绝大部分作为食用，仅约有六分之一作为饲料使用。小麦作为世界上总产量第二的粮食作物也是中国第二大粮食作物，在国人食品中扮演着重要角色。据统计，在当前中国的口粮消费总量中，小麦占43%左右。近年来，世界人口增长以及人们生活水平不断提高，粮食需求持续增长，与此同时，耕地逐渐减少、水资源不足、小麦病害频发、生态环境恶化、自然灾害频发，以及饲料用粮和生物燃料耗粮增加等给世界粮食供给带来了严峻的挑战，小麦生产在粮食安全的地位日益重要。

小麦丛矮病是靠传毒媒介灰飞虱传播的病毒病，是西北和华北冬麦区的一种常发性病害，小麦丛矮病的典型症状表现为叶片有黄绿相间条纹，分蘖增多，植株矮化，形成明显的丛矮状。冬前感病株大部分不能越冬而死亡，冬前未显症和早春拔节后感病植株上部叶片显条纹，一般不能抽穗而提早枯死，有的能抽穗，但穗小籽粒秕瘦，对产量影响较大。小麦丛矮病在我国分布较广，陕西、甘肃、宁夏、内蒙古、山东、山西、河北、河南、江苏、浙江、新疆、北京、天津等省（区、市）均有发生，为害程度因年份和地区而异。轻病田减产10%～20%，重病田减产50%以上，甚至绝收。

小麦丛矮病毒主要由灰飞虱传毒。在中国多数北方地区，灰飞虱一年发生3～4代，2～3龄若虫在杂草根际或土缝中越冬。翌年3月中旬开始活动，集中危害新返青的杂草嫩叶。4月上旬，冬麦返青或春麦出苗后由田埂转至麦田，靠田埂的虫口密度高，后渐向田中扩散。4月下旬是越冬代成虫羽化盛期。6月下旬第一代成虫出现。小麦成熟后，灰飞虱转至秋作物及田边杂草，再繁殖1～2代，于11月份迁移到田埂等杂草丛下土中越冬。灰飞虱1～2龄若虫易获毒，成虫传毒能力最强，最短获毒时间12h，最短传毒时间20min，获毒率及传毒率随吸食时间延长而提高。灰飞虱一旦获毒可终生带毒，但不经卵传播。病毒在若虫体内越冬。在冬麦区，灰飞虱秋季从带病毒的越夏寄主上大量迁飞至麦田，造成早播秋苗发病。越冬带毒若虫是毒源，翌年迁回麦田危害。近几年，随着小麦田灰飞虱发生数量逐年上升，小麦丛矮病的发生和危害程度也越来越严重，已成为制约我国小麦生产的严重病害，给我国的粮食安全带来了极大的挑战。

目前，对小麦丛矮病的防治主要是使用农药防治传毒介体灰飞虱，但由于介体昆虫种群数量大导致防治效果不佳，且存在环境污染。培育抗病品种是防治各类病害最为经济、有效的手段。筛选、发掘和创新抗病种质是开展抗病育种的前提和基础，而抗性基因定位和克隆，则为利用标记辅助选择等分子育种手段、加快和高效培育抗病品种提供了全新而有利的工具。但迄今小麦丛矮病抗性QTL检测和遗传效应分析还处于起步阶段，在生产上也没有发现对小麦丛矮病免疫的品种，所以对小麦丛矮病抗性种质进行大规模筛选和展开小麦丛矮病抗性遗传特性研究显得尤为迫切。

筛选抗病资源应用于抗病育种生产是最为直接有效的方法，目前小麦育种上筛选抗病品种、抗病基因定位鉴定抗性家系均采用田间自然发病鉴定，即将各鉴定品种或品系以小区形式种植于大田，每个小区几十株左右，大田常规栽培管理，传毒介体灰飞虱自然传毒，待小麦显现病症后调查各鉴定品种（家系）小区的株发病率，以此为标准鉴别小麦品种（家系）抗感能力的差异。然而，由于植物对天敌的抗性分为耐害性、抗生性和排趋性三种类别，各种抗性类别具有不同的抗性机理。不同小麦品种（家系）对灰飞虱排趋性的差异使得不同小麦品种（家系）的某些形态和生理等特性，表现出对灰飞虱的取食偏向的差异。而小麦丛矮病的传毒介体正为灰飞虱，因此，通过自然鉴定方法鉴定得到的抗病小麦，实际上可能是抗虫（排趋性强）小麦而并非抗病小麦。然而，假若以该抗虫不抗病小麦育成品种进行病害区规模种植后，规模种植导致传毒介体被迫选择而使得小麦对灰飞虱排趋而产生的假抗病表现消失，将可能给小麦生产带来较大的损失。

为排除排趋性对抗病鉴定的影响，对小麦进行人工定量接种带毒介体成为一种必然。然而，进行小麦品种资源的抗性鉴定需要大量的传毒介体灰飞虱，灰飞虱人工饲养规模量小，饲养成本很高，难以满足品种抗性鉴定的规模量的需求，限制了人工定量接种鉴定的推广应用。

灰飞虱重灾区大田生态系统内每年的灰飞虱数量均非常巨大，人工获取也比较容易，而实验室饲养灰飞虱用于品种资源抗性鉴定难以满足规模量的要求，若能够设计一种方法利用大田生态系统规模量的灰飞虱进行小麦定量强化接种鉴定从而实现对小麦品种资源的准确评价将是一种可行的选择。

在大田，昆虫与寄生作物在很长的历史时期就生活在一起，双方相互作用、彼此影响，相互调节制约，小麦丛矮病等昆虫传毒介体病的大发生，正体现了作物和昆虫之间长期互作关系，而昆虫与作物间的相互影响又受自然环境、生态环境的多变性制约，为实现对小麦品种资源的准确评价，需要实验室提供作物昆虫互作研究的稳定而适宜的生态环境。模拟大田生态系统内灰飞虱与小麦的互作关系、利用大田生态系统解决规模灰飞虱的获取难题、定量并强化小麦丛矮病接种鉴定从而实现对小麦品种资源的准确评价正是本发明的根本思路。

利用本方法评价小麦品种对小麦丛矮病的抗性水平，既可以去除排趋性对鉴定结果的干扰，又可以克服品种抗性鉴定所需灰飞虱规模量获取的难题，并且实现了定量而强化的小麦丛矮病抗性接种鉴定。这一鉴定方法除了可以应用于小麦品种资源的发掘鉴定、品种抗性评价、抗病品种选育外，亦可以应用于抗病基因定位的表型鉴定和抗性遗传规律研究等众多领域。

发明内容

本发明的目的是针对小麦丛矮病田间自然鉴定中存在的排趋性干扰难题和室内人工接种鉴定的灰飞虱规模量获取难题，提供一种小麦丛矮病抗性的规模化定量强化接种鉴定方法，该鉴定方法既可以去除排趋性对鉴定结果的干扰，又解决了品种抗性鉴定所需灰飞虱规模量获取的难题，并且实现了定量而强化的小麦丛矮缩病接种鉴定，最终实现了对小麦丛矮病抗性的准确评价。

本发明的目的是通过以下技术方案解决的：

一种小麦丛矮病抗性的规模化定量强化接种鉴定方法，其特征在于：所述的规模化定量强化接种鉴定方法步骤如下：

（a）、采用搪瓷盘法从田间采集灰飞虱后通过纯化筛选装置获取大量5龄灰飞虱若虫；

（b）、将筛选获得的5龄灰飞虱若虫接种到作物昆虫共育箱内培育的水稻上共育并繁育下一代灰飞虱若虫，并进一步利用调整的纯化筛选装置分离获取大量整齐一致的2龄灰飞虱若虫；

（c）、将筛选获得的2龄灰飞虱若虫移入栽有小麦丛矮病重灾区取材的小麦丛矮病病株上进行饲毒；

（d）、通过精密电子天平称重获得单头2龄灰飞虱若虫的重量，根据确定的虫/苗比例计算所需灰飞虱总重，进而称重定量；

（e）、根据确定的虫/苗比例将饲毒后的定量2龄灰飞虱若虫接种到作物昆虫共育箱内栽培的待测小麦幼苗上共育传毒；

（f）、待灰飞虱半数死亡时将待测小麦移栽至大田隔虫网室，常规栽培管理，抽穗期调查统计丛矮病穴发病率，并根据丛矮病穴发病率准确鉴定出待测小麦品种的抗病能力。

所述步骤（a）中的灰飞虱收集时间为每年五月下旬～六月上旬期小麦田由青转黄期。

所述步骤（a）中的纯化筛选装置使用时，采用孔径为22目和26目的分样筛组合以有效分离出5龄灰飞虱若虫和部分灰飞虱成虫；然后将筛选分离出的灰飞虱倒入内壁光滑的深桶内，拍击桶外壁使得灰飞虱成虫飞离而若虫滞留，即可获得大量整齐一致的5龄灰飞虱若虫。

所述步骤（b）中的5龄灰飞虱若虫接种到作物昆虫共育箱内培育的水稻上时，与5龄灰飞虱若虫共育的水稻为2～3叶期。

所述步骤（b）中的作物昆虫共育箱的培养温度控制在25℃、光14h/暗10h。

所述步骤（b）中的作物昆虫共育箱内繁育下一代灰飞虱若虫后，此时筛选装置翻转90°将垂直的趋光方向改变为水平方向，采用孔径为32目和35目的分样筛组合以有效分离获得大量整齐一致的2龄灰飞虱若虫。

所述步骤（c）中的小麦丛矮病病株为上一年自小麦丛矮病重灾区取材后于-20℃的冰箱冷藏的，待病株自然解冻后将根用浸水脱脂棉包裹并用塑料布包扎结实模拟大田移栽方式垂直固定于作物昆虫共育箱内，然后移入2龄灰飞虱若虫饲毒不低于48h。

所述步骤（d）中的2龄灰飞虱若虫饲毒后采用趋光分离毛刷刷离灰飞虱若虫时夹杂的杂质和死虫，然后转移20～50头灰飞虱若虫进称量瓶，通过精密电子天平称重，去皮计算瓶内灰飞虱若虫的总重后根据瓶内灰飞虱若虫的数量，计算得到单头灰飞虱若虫的重量，根据待测小麦株数和接种强度确定饲毒灰飞虱若虫数目，进而计算接种所需饲毒灰飞虱若虫的总重并称重定量。

所述步骤（e）中的待测小麦是经过人工春化预处理后播种的，待其生长处于1～2叶期，且待测小麦按照20cm²/株的比例留取长势健康均匀的幼苗。

所述步骤（e）中的待测小麦按照5～15虫/苗的比例接种饲毒后的2龄灰飞虱若虫，作物昆虫共育箱的培养温度控制在20℃、光12h/暗12h共育传毒至接种的灰飞虱自然衰老死亡。

本发明相比现有技术有如下优点：

本发明通过纯化筛选装置获得大量整齐一致的大田来源的5龄灰飞虱若虫，进而通过作物昆虫共育箱共育出大量的2龄灰飞虱若虫，并再次通过纯化筛选装置获得大量整齐一致的2龄灰飞虱若虫，然后通过2龄灰飞虱若虫共育饲毒、待测小麦定量共育接种传毒的方式使得待测小麦发病，最后通过调查丛矮病穴发病率即可准确鉴定出待测小麦品种的抗病能力。

本发明的规模化强化接种鉴定方法既可以去除排趋性对鉴定结果的干扰，又可以克服品种抗性鉴定所需灰飞虱规模量获取的难题，并且实现了定量而强化的小麦丛矮病接种鉴定，能够准确地评价小麦品种对小麦丛矮病的抗性水平；该鉴定方法除了可以应用于小麦品种资源的发掘鉴定、品种抗性评价、抗病品种选育外，亦可以应用于抗病基因定位的表型鉴定和抗性遗传规律研究等众多领域，故适宜推广使用。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

一种小麦丛矮病抗性的规模化定量强化接种鉴定方法，该规模化定量强化接种鉴定方法步骤如下：（a）、大田灰飞虱的获取和分离纯化：在每年五月下旬～六月上旬期小麦田由青转黄期，搪瓷盘法调查灰飞虱5龄虫占多数时，采用搪瓷盘法从田间采集灰飞虱（其中含有大量杂质和杂虫），然后利用纯化筛选装置进行分离筛选，为主要获取5龄灰飞虱若虫，纯化筛选装置的分样筛采用孔径为22目和26目的分样筛组合，因为筛取调查发现，22～26目的分样筛组合可有效的屏蔽掉灰飞虱死虫、杂质和无（弱）趋光性昆虫、大体型趋光性昆虫、小体型趋光性昆虫和灰飞虱幼龄若虫的干扰，有效分离出5龄若虫和部分灰飞虱成虫，将分离出的灰飞虱置入内壁光滑的深桶内，拍击桶外壁使得灰飞虱成虫飞离而若虫滞留，最终获得大量整齐一致的5龄灰飞虱若虫；（b）、2龄灰飞虱若虫的培育和分离筛选：将筛选获得的5龄灰飞虱若虫接种到作物昆虫共育箱内培育的2～3叶期水稻上共育并繁育下一代灰飞虱若虫，作物昆虫共育箱的培养温度控制在25℃、光14h/暗10h，共育两周左右可观察到大量灰飞虱若虫出现，待多数若虫生长到2龄期，用柔软的毛刷将聚集在水稻叶和茎秆上的大量灰飞虱若虫分离进塑料盒内；为筛选整齐一致的2龄灰飞虱若虫，筛选装置参照成虫筛选装置进行调整，同样利用若虫的趋光性进行分选，分样筛组合选择32～35目，且由于若虫运动能力较弱，此时筛选装置翻转90°设置将垂直的趋光方向改变为水平方向，将若虫置于黑暗一端，若虫趋光水平爬动，采用32～35目的分样筛组合能够分离获得大量整齐一致的2龄灰飞虱若虫；（c）、灰飞虱若虫饲毒：将上一年在-20℃的冰箱中冷藏的小麦丛矮病重灾区取材的小麦病株自然解冻，将病株根用浸水脱脂棉包裹并用塑料布包扎结实模拟大田移栽方式垂直固定于作物昆虫共育箱（仅通风光照，不播种、不通水）内，然后移入2龄灰飞虱若虫饲毒不低于48h，使得2龄灰飞虱若虫带毒；（d）计量灰飞虱若虫：用柔软的毛刷将饲毒后的2龄灰飞虱若虫分离进塑料盒，不设分样筛，采用纯化筛选装置趋光分离毛刷刷离2龄灰飞虱若虫时夹杂的杂质和死虫，转移20～50头2龄灰飞虱若虫进称量瓶，精密电子天平称重，去皮计算瓶内2龄灰飞虱若虫的总重，瓶内2龄灰飞虱若虫肉眼计数，计算得到单头2龄灰飞虱若虫的重量，根据待测小麦株数和接种强度确定饲毒灰飞虱若虫数目，进而计算接种所需饲毒灰飞虱若虫的总重并称重定量；（e）、待测小麦与带毒2龄灰飞虱若虫定量共育传毒：当步骤（b）中的作物昆虫共育箱内灰飞虱若虫大量出现（多一龄幼虫）时，将经过人工春化预处理的待测小麦播种在作物昆虫共育箱内培养，每箱播种一个待测小麦品种（家系），完成步骤（c）后待测小麦幼苗的生长会处于1～2叶期，按照20cm²/株的比例淘汰弱苗和不均匀的苗以留取长势健康均匀的稻苗，按照5～15虫/苗的比例将饲毒后的定量2龄灰飞虱若虫接种到作物昆虫共育箱内栽培的待测小麦品种幼苗上共育传毒，作物昆虫共育箱的培养温度控制在20℃、光12h/暗12h共育传毒至接种的灰飞虱自然衰老死亡；（f）、待测水稻大田显症统计：待灰飞虱半数死亡后将待测小麦移栽至大田隔虫网室，常规栽培管理，小麦抽穗期调查统计丛矮病穴发病率，丛矮病症状主要表现为病株生长细弱，叶部仍有黄绿相间条纹，病株矮化，一般不能拔节和抽穗，有的即使能抽穗，其籽粒也很秕瘦，统计计数穴发病率，并根据丛矮病穴发病率准确鉴定出待测小麦品种的抗病能力。

实施例一

2013年6月，采用重灾区取材的冷冻小麦病株作为毒源，采用本方法进行接种鉴定，同期采用1～2龄无毒灰飞虱若虫做对照，其他处理相同。饲毒时间定为48h，接种强度均为10头/株，显症后调查丛矮病穴发病率。

通过上述实施例和对比例可知，四个小麦品种采用大田来源灰飞虱传毒与无毒灰飞虱传毒的丛矮病发病率差异均不显著，表明采用大田来源的灰飞虱传播小麦丛矮病毒不受遗传携带的杂毒干扰。

目前小麦丛矮病的鉴定中自然鉴定法中无法克服排趋性的干扰，而人工筛选无毒灰飞虱人工饲养规模量小，饲养成本很高，难以满足品种抗性鉴定的规模量的需求，限制了该方法的推广应用。而本实施例发现利用大田来源灰飞虱成虫繁育一代若虫后饲毒并接种传毒的效果与无毒（RSV）灰飞虱接种效果并无显著性差异，并且解决了无毒（RSV）灰飞虱人工饲养难以规模化的技术难题，证明了本鉴定技术的可行性和进步性。

实施例二

2013年采用本方法鉴定了四个小麦品种，亦在小麦丛矮病重灾区采用自然发病鉴定法鉴定该四个小麦品种，统计丛矮病发病率并计算其它品种相对于青春892的相对抗感比。

通过比较采用本方法鉴定与重灾区自然发病的小麦丛矮病发病率、相对于青春892的相对抗感比表现可以发现，不同品种小麦本技术鉴定的结果与重灾区自然发病鉴定的相对抗感比不相同，个别品种差异显著，可能是小麦品种间的排趋性差异造成的。

为研究不同鉴定技术鉴定的小麦品种抗病能力差异的原因，我们对以上小麦品种进行了排趋性鉴定实验。小麦播种在育苗穴盘上，同一穴盘播不同小麦品种，同一穴盘的每一个品种各10株，共种植10盘重复。在第1代灰飞虱成虫始盛期播种，于小麦一叶一心期接种灰飞虱，育苗穴盘置入安静温室内培养，培养温度控制在20℃，光12h/暗12h。两天后调查每个小麦品种上灰飞虱数目。

由排趋性实验可以发现，四个品种的灰飞虱排趋性由强到弱依次为青春892>绿叶熟>辐阿l号>阿勃。对比表二可以发现，在大田自然鉴定小麦丛矮病抗病品种仅获得辐阿l号，阿勃大田自然鉴定抗病表现中等发病，而通过本技术鉴定辐阿l号、阿勃抗病表现均较好，表三排趋性检测发现，阿勃大田自然鉴定抗病表现不好的原因是对灰飞虱的排趋性较差，但是自身抗病性较好，在抗性育种中可以用作小麦丛矮病抗源。

由实施例二可以断定，本技术对种质资源小麦丛矮病抗病能力的鉴定结果可以排除排趋性的影响，其结果比大田自然鉴定更加准确，值得进一步推广利用。

以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。