一种可注射骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种可注射骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶及其制备方法和应用。本发明通过体外单层高密度培养兔的骨髓间充质干细胞，收集其分泌的细胞外基质，利用冷冻干燥、液氮下研磨及酶促消化技术获得均匀的细胞外基质混悬液。接着将细胞外基质混悬液与琼脂糖等体积充分混匀，制备成骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶材料。该材料通过简单的注射方式即可注入任意形状的软骨缺损部位，并且与周边宿主组织有较佳的附着整合能力。本发明可注射自体骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶，其细胞来源充足，避免了异体来源材料存在的潜在风险，并且便于修复任意形状的软骨缺损，达到与周边宿主组织更好的整合。

说明书

技术领域

本发明属于生物材料领域，涉及一种可注射骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术

关节软骨属于透明软骨，无神经支配，也无血管分布，故损伤关节软骨的自我修复能力有限。关节软骨损伤后对应力的吸收和缓冲作用降低，损伤会进行性加重，同时损伤的关节软骨有发展为严重骨关节炎的风险。目前，关节软骨缺损的修复方法主要有：关节冲洗和清理术、微骨折骨髓刺激术、骨软骨移植术和自体软骨细胞移植术。上述技术在临床应用中各有优缺点，其临床疗效也始终差强人意。

近年来，随着对生物材料学研究的不断发展，人工合成的高分子聚合物如聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)及聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)等；天然的生物材料如胶原(Collagen)、明胶、纤维蛋白、GAG、海藻酸盐等都能被研究者们用于生物材料支架的研制。许多学者致力于应用生物材料支架来修复软骨缺损的研究，但因其机械强度、免疫原性、生物降解速度、自身代谢产物的生物毒性及疾病传播等诸多不足尚未能广泛应用于临床。

目前，诸多学者致力于与传统人工合成或天然的生物材料支架相区别的天然细胞外基质(ECM)支架的研究。ECM支架内含有多种结构性和功能性蛋白，还含有多种粘附因子和生长因子。此外，ECM支架具有良好的天然生物降解性能，并且其自身代谢降解产物均无生物毒性。其中，软骨细胞来源的ECM支架在体内和体外研究中均有优良的软骨再生潜能。但利用自体软骨细胞修复缺损存在来源有限及需二次手术等不足；而使用异体软骨细胞虽可解决来源及二次手术问题，却存在免疫排斥反应和疾病传播风险，限制了软骨细胞来源ECM支架的临床应用。利用自体骨髓间充质干细胞来源的ECM支架则避免了这些潜在的风险，其细胞来源充足，不需要经历复杂的脱细胞过程，并且展示了较佳的体外软骨再生和体内软骨修复能力。

然而，ECM支架细胞粘附能力有限，而且多适用于规则形状的软骨缺损修复。同时临床上所面临的软骨缺损大多为不规则形状，故上述预先塑型的ECM支架在应用中也存在一定的局限性。近年来，许多研究者着力于研究一种可塑型的水凝胶支架材料用以修复软骨缺损。水凝胶支架高度含水，具有良好的通透性，其能将细胞包裹起来，为细胞的粘附、增殖和特异性分化提供一个三维的环境。目前，许多材料已被用于水凝胶支架的制备，其中琼脂糖水凝胶应用广泛，并展现出较佳的软骨再生潜能。虽然琼脂糖水凝胶的使用模拟了天然细胞外基质的水环境，但其未能提供细胞外基质所含有的功能性、结构性蛋白及营养成分，故其难以有效的促进细胞黏附、增殖和分化。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种可注射骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶的制备方法。

本发明的另一目的是提供该方法制备得到的可注射骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种可注射骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

制备骨髓间充质干细胞来源的细胞外基质混悬液：将冻干的骨髓间充质干细胞外基质支架研磨成粉末，将粉末状的细胞外基质溶于含有0.5-1.5mg/ml胃蛋白酶的0.01mol/L HCL中消化，并在20-25℃下搅拌60～72小时，待细胞外基质完全消化后加入0.1mol/L NaOH，以终止消化反应，最终获得均匀的骨髓间充质干细胞来源的细胞外基质混悬液；

制备骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶：配制4％的琼脂糖溶液，经高压真气灭菌，待温度降至40～45℃时，将上一步制备的细胞外基质混悬液与4％琼脂糖以等体积混合，轻轻摇晃使其充分混匀，静置2～3分钟后即获得骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶。

本发明所述的制备方法，优选包含以下步骤：

(1)密度梯度离心法分离及培养兔骨髓间充质干细胞；

(2)收集兔骨髓间充质干细胞来源的细胞外基质并冻干制备骨髓间充质干细胞外基质支架；

(3)权利要求1所述的制备兔骨髓间充质干细胞来源的细胞外基质混悬液；

(4)权利要求1所述的制备兔骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶。

所述的密度梯度离心法分离及培养兔骨髓间充质干细胞的方法如下：取兔骨髓，加入等体积的生理盐水混匀后，贴壁注入预先加有与骨髓等体积的淋巴细胞分离液的离心管内，以800～1200转/分速度离心8～10分钟，离心后收集单个核细胞层并进行细胞计数，以1×10⁸细胞密度接种于直径为150mm的培养皿中，每个培养皿内预先加入含10％胎牛血清的DMEM培养液20～30ml，并置入37℃，5％CO2饱和湿度培养箱内培养，细胞培养5～7天后进行初次换液，之后每2～3天换液一次，培养周期为30～40天，得兔骨髓间充质干细胞。

所述的收集兔骨髓间充质干细胞来源的细胞外基质并冻干制备骨髓间充质干细胞外基质支架方法如下：弃去上一步培养皿中的培养液，用刮勺将培养皿底膜状的细胞外基质分离并置于–80℃深低温冰箱中储存12～24小时，然后将冷冻后的细胞外基质在-55～-75℃、真空度1～10KPa条件下,经冷冻干燥处理24～48小时得到白色的骨髓间充质干细胞外基质支架。

本发明所述的制备方法中，所述的骨髓间充质干细胞外基质优选来源于待注射所述骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶的动物。

按照上述的制备方法制备的可注射骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶；优选按照上述的制备方法制备的自体可注射骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶。

本发明所述的可注射骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶在修复软骨缺损中的应用。

有益效果：

本发明利用自体骨髓间充质干细胞来源的细胞外基质，其细胞来源充足，不需要经历复杂的脱细胞过程。此外，制备了可注射自体骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶，可以增加支架的细胞粘附能力和可塑性，便于修复任意形状的软骨缺损，达到与周边宿主组织更好的整合，是一种有临床发展前景的生物支架材料。

本发明所涉及的可注射自体骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶的制备过程，无论是骨髓间充质干细胞分离及培养、冷冻干燥处理、液氮下研磨和酶促消化，都是简单易行的技术。

本发明提供的可注射自体骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶，可以增加支架的细胞粘附能力和可塑性，便于修复任意形状的软骨缺损，达到与周边宿主组织更好的整合，还能够利用ECM内的成分对缺损区通过归巢而来的细胞的增殖和分化提供营养支持作用，进而探索出一种简单而有效的软骨缺损修复的新技术，为今后临床应用提供必要的理论依据。

附图说明

图1可注射骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶制备的流程示意图。

图2骨髓间充质干细胞外基质粉末及混悬液的大体观察。A图：粉末；B图：混悬液。

图3骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶和琼脂糖水凝胶的大体观察。A图：本发明复合水凝胶正面观；B图：本发明复合水凝胶侧面观；C图：琼脂糖水凝胶正面观；D图：琼脂糖水凝胶侧面观。

图4本发明骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶和琼脂糖水凝胶的扫面电镜观察。A图：本发明复合水凝胶；B图：琼脂糖水凝胶。

图5软骨细胞包裹于骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶在不同培养时间点的大体观察。A图：1周；B图：2周；C图：4周。

图6软骨细胞包裹于骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶在不同培养时间点的番红O染色观察。A、B图：1周；C、D图：2周；E、F图：4周。

图7可注射自体骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶修复软骨缺损。A-D图：造模；E、F图：1个月。

具体实施方式

实施例1

(一)可注射骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶制备的流程示意图见图1，具体方法如下：

(1)密度梯度离心法分离及培养兔骨髓间充质干细胞：于4月龄新西兰大白兔的髂后上棘抽取骨髓，加入等体积的生理盐水混匀后，缓慢贴壁注入预先加有与骨髓等体积淋巴细胞分离液的离心管内，以1200转/分速度离心10分钟。离心后收集单个核细胞层并进行细胞计数，以1×10⁸细胞密度接种于直径为150mm的培养皿中(每个培养皿内预先加入含10％胎牛血清的DMEM培养液25ml)，并置入37℃，5％CO₂饱和湿度培养箱内培养。细胞培养7天后进行初次换液，之后每3天换液一次，培养周期为30天。

(2)兔骨髓间充质干细胞来源的细胞外基质的收集：弃去培养皿中的培养液，用刮勺将培养皿底膜状的细胞外基质分离并置于–80℃深低温冰箱中储存12小时，然后将冷冻后的细胞外基质在-55～-75℃、真空度1～10KPa条件下,经冷冻干燥处理24小时得到白色的骨髓间充质干细胞外基质支架。

(3)兔骨髓间充质干细胞来源的细胞外基质混悬液的制备：将冻干的骨髓间充质干细胞外基质支架在液氮条件下研磨成均匀的粉末。接着将粉末状的细胞外基质溶于含有1mg/ml胃蛋白酶的0.01mol/L HCL中消化，并在20-25℃下搅拌72小时。待细胞外基质完全消化后加入0.1mol/L NaOH，以终止消化反应。最终获得均匀的兔骨髓间充质干细胞来源的细胞外基质混悬液，经紫外线杀菌并置于–20℃储存备用。

(4)兔骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶的制备：配制4％的琼脂糖溶液，经高压真气灭菌，待温度降至40～45℃时，将步骤(3)制备的细胞外基质混悬液与4％琼脂糖以等体积混合，轻轻摇晃使其充分混匀，静置3分钟后即获得兔骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶。

(二)骨髓间充质干细胞外基质粉末及混悬液的大体观如图2所示(A：粉末；B：混悬液)；制备的水凝胶大体观如图3所示，骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶(A：正面观；B：侧面观)和琼脂糖水凝胶(C：正面观；D：侧面观),其中骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶展现出更致密的结构；扫面电镜观察如图4所示，骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶支架孔隙大小为250～450μm(A)，琼脂糖水凝胶支架孔隙大小为100～200μm(B)，其中骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶的孔径大小更适合软骨细胞的粘附和增殖。

实施例2

取实施例1中收集的兔骨髓间充质干细胞外基质混悬液，在制备骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶的同时，将软骨细胞包裹于复合水凝胶中，在不同培养时间点的大体观察，结果见图5；并对不同培养时间点的培养组织行番红O染色观察，结果见图6。

(1)用0.25％胰蛋白酶消化已传至P2或P3的软骨细胞，计数并控制细胞密度为5×10⁶个/ml。

(2)将消化的软骨细胞悬液与兔骨髓间充质干细胞外基质混悬液混匀，接着与4％琼脂糖混合，轻轻摇晃使其充分混匀，获得包裹软骨细胞的骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶悬液。接着将复合水凝胶悬液加入直径6mm，高度3mm的不锈钢空心模具中，静置3分钟后获得包裹软骨细胞的骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶。其中软骨细胞悬液、细胞外基质混悬液和4％琼脂糖混合的体积比为1：2：2。

(3)将获取的复合水凝胶置于24孔板中培养，每孔加入4ml含10％胎牛血清的DMEM培养基，并置入37℃，5％CO₂饱和湿度培养箱内培养，每3天换液一次。

(4)体外培养1周、2周和4周后，将培养组织取出，并用生理盐水洗去其表面的培养液颜色。接着用数码相机行大体观察，示随着培养时间的延续，骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶逐渐呈软骨样组织。同时进行如下的番红O染色观察。

(5)固定：将获取的培养组织置于10％中性甲醛固定液中固定24小时。接着流水冲洗8小时，以洗去组织表面的固定液。

(6)脱水：70％酒精1小时；80％酒精1小时；90％酒精0.5小时；100％酒精(I)0.5小时；100％酒精(II)0.5小时。

(7)透明：二甲苯(I)0.5小时；二甲苯(II)0.5小时。

(8)浸蜡：将培养组织置于熔化的石蜡中，65℃温箱过夜。

(9)包埋：在BMJ-B型石蜡包埋机上将培养组织包埋于包埋盒中。包埋机的工作条件为：工作台温度为60℃，储镊块温度为64℃，蜡嘴温度为70℃。包埋完毕后立即置于病理组织包埋冷冻台上冷却(-25～-15℃)。

(10)切片：包埋块冷却后立即在Leica石蜡切片机上切片，切片厚度为5μm。接着将切片置于恒温展片台上烘干；染色前置65℃温箱暖片20分钟。

(11)番红O染色：

1)脱蜡：二甲苯(I)15分钟；二甲苯(II)15分钟；二甲苯(III)15分钟。

2)水化：100％酒精(I)5分钟；100％酒精(II)5分钟；90％酒精5分钟；80％酒精3分钟；70％酒精3分钟；流水冲洗5分钟。

3)细胞核染色：苏木精染色5分钟；流水冲洗5分钟。

4)分化及反蓝：1％盐酸酒精2秒；流水冲洗15分钟。

5)基质染色：0.02％Fast green染色5分钟；置于1％乙酸中漂洗10～15秒；0.1％番红O染色5分钟；去离子水冲洗2分钟。

6)脱水：80％酒精3分钟；90％酒精3分钟；100％酒精(I)2分钟；100％酒精(II)2分钟。

7)透明：二甲苯(I)5分钟；二甲苯(II)5分钟。

8)封片：用中性树胶封固切片。

9)用NIKON Ci正置显微镜在不同放大倍数下(20和40倍)观察培养组织番红O染色的实验结果，见图6，示随着培养时间的延续，骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶中糖胺多糖的积累分布逐渐增多。

实施例3

可注射自体骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶修复软骨缺损见图7，具体方法如下：

(1)用生物打孔器在兔的股骨滑车处制备直径3mm的软骨缺损(图7A)；

(2)用注射针头在软骨缺损处制备数个微骨折孔洞(图7B)；

(3)取实施例1中收集的骨髓间充质干细胞外基质混悬液，与4％琼脂糖以等体积混合，轻轻摇晃使其充分混匀，获得兔骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶，接着用注射器将获得兔骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶滴加至软骨缺损处，同时设置琼脂糖水凝胶修复组(琼脂糖水凝胶制备方法见以下文献：Ahearne M,Kelly D J.A comparison of fibrin,agarose and gellan gum hydrogels as carriers of stem cells and growth factor delivery microspheresfor cartilage regeneration.Biomedical Materials,2013,8(3):035004.)作为平行对照(图7C)；

(4)等待3分钟左右,观察骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶形成并填充于软骨缺损部位(图7D)；

(5)经过1个月的修复，骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶修复组观察到软骨缺损部位被修复组织均匀地填充(图7E)，而琼脂糖水凝胶修复组可见不均匀填充的修复组织(F)。