细菌菌蜕在制备病毒性疫苗佐剂中的应用

摘要

本发明公开了细菌菌蜕在制备病毒性疫苗佐剂中的应用，本发明还公开了一种细菌菌蜕的大规模发酵方法。本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了细菌菌蜕的大规模制备方法，为菌蜕疫苗的商品化生产奠定了坚实的基础；此外，本发明系统性的评价了菌蜕的佐剂功能，结果表明菌蜕能极大的提高病毒性疫苗的免疫效力，而且菌蜕作为佐剂使用方法简单，可一定程度的降低疫苗的生产成本，对人类和动物病毒性传染病的防控具有重大意义。

说明书

技术领域

本发明涉及细菌菌蜕的规模化发酵制备方法与菌蜕作为佐剂在病毒性疫苗中 的应用。本发明属于基因工程与免疫学技术领域。

背景技术

细菌菌蜕(bacterial ghost，BG)是在革兰氏阴性菌中通过控制PhiX174噬菌体 的裂解蛋白E的表达使宿主菌发生裂解而产生的细胞空壳。E蛋白介导的溶菌通道 大小受细胞个体差异影响，孔径介于40nm到200nm之间。通道一旦形成，细菌胞 浆内容物在内外渗透压的作用下通过通道流出胞外，形成一个完成的细菌空壳。E 蛋白介导的溶菌作用已成功应用于各种大肠杆菌、沙门氏菌、胸膜肺炎放线杆菌、 肺炎克雷伯氏菌、幽门螺旋杆菌、霍乱弧菌、流感嗜血杆菌、巴氏杆菌等。范围如 此之大说明E蛋白介导的溶菌可能会在所有革兰氏阴性菌中发生。

菌蜕本身可以作为一种很好的疫苗。其外壳结构没有被破坏，保留与活菌一样 的胞膜结构和相关抗原蛋白，而外膜含有天然的免疫细胞通过模式识别受体识别的 高度保守结构PAMP(pathogen-associated molecular patterns)，例如脂多糖、肽聚糖、 CpG、OmpA、菌毛等，能有效地被抗原递呈细胞(APCs)吞噬、加工和递呈。这 也是菌蜕与常规灭活疫苗相比的一个突出优势。目前，菌蜕通过静脉、皮下、气体 等途径免疫已经在小鼠、兔子、猪等动物模型中取得了良好的免疫保护效果。用胸 膜肺炎放线杆菌菌蜕经气体免疫接种猪，诱导了针对A.pleuropneumoniae引起的胸 膜肺炎的完全保护。霍乱弧菌菌蜕经皮下注射小鼠诱导血清产生高水平的抗霍乱的 抗体并且足以保护新生小鼠免遭霍乱弧菌的感染。另外，菌蜕又是完美的载体，可 以接收大量的外源物质。重组蛋白可通过特定的膜锚定结构插入细胞膜，或填充于 胞周间隙和细胞空腔中，以获得重组菌蜕多价苗和多联苗。

菌蜕生产简单，发酵后可用离心重悬的方法进行收集，并可以冻干的形式保存 于室温，无需像蛋白疫苗那样复杂的纯化工作。理想的菌蜕不含胞浆、核酸等内容 物，因此不存在毒力增强的问题，使用安全，对环境无污染。

理想的佐剂是以最小的免疫刺激可引起适当的免疫促进作用，且无不良反应。 铝盐佐剂是目前兽用疫苗和人用疫苗上应用最广泛的佐剂，已大量应用于细菌、病 毒等病原微生物疫苗，虽然该佐剂在提高抗体水平和安全方面已获得长期的实践证 实，但存在许多不足之处：不能冻干；批次之间差异大；与许多重组或合成的多肽 疫苗抗原共同免疫时未能激发有效的免疫应答，使之很难满足新型疫苗发展的需 要。通常而言，油/水乳剂型佐剂以注射投递途径为主，包括M F59、QS21、A S02 以及Montanide等水包油或油包水型佐剂，这类佐剂通过肌肉或皮下注射接种来增 强疫苗抗原的免疫原性。此外，机体内源性细胞因子如IL-2、IL-12、GM-CSF等， 也可作新型疫苗佐剂，主要通过注射途径进行接种，所引发的免疫应答类型与油/ 水乳剂型佐剂相似。但此类佐剂大都成本较高。目前，单纯的粘膜途径型佐剂较少， 主要以大肠杆菌LT毒素及其突变体为主，诱导以粘膜免疫为主的应答反应，分泌 特异性sIgA，也可产生系统性免疫应答，但强度较注射途径弱。这类佐剂较粘膜途 径投递相对安全，即便佐剂存在一定毒性，但在有效剂量时进行粘膜投递仍较为安 全，而且还具有投递简便，无创伤等显著优点。具备注射和粘膜两种免疫途径的新 型疫苗佐剂受到青睐。在不同的免疫途径下，这类佐剂既可诱导出系统免疫应答， 也可产生粘膜免疫效果，既有体液免疫也有细胞免疫。由于菌蜕拥有完好的天然的 细菌外壳结构，能同时激发体液和细胞免疫应答。其菌毛、纤毛等表面黏附结构使 之能靶向黏附在特异性的组织，如胃肠道和呼吸道的黏膜表面，容易被机体吞噬细 胞，如PP结(Peyer’s Patches)的M细胞识别捕获，因而可有效递送疫苗抗原至黏 膜表面和诱发相关黏膜免疫应答。

目前，国内外研究者关注的焦点是菌蜕作为一种新型疫苗用于预防细菌感染。 而系统性的评价菌蜕的佐剂功能并将其作为佐剂应用于病毒性疫苗的免疫尚未见 相关报道。另外，本发明克服了以往菌蜕制备规模小的瓶颈问题，利用发酵罐大量 地制备了沙门氏菌菌蜕，实现了菌蜕的规模化生产。

发明内容

本发明的目的之一是提供细菌菌蜕在制备病毒性疫苗佐剂中的应用。

其中，所述的细菌菌蜕的佐剂功能主要体现在其能特异性提高病毒疫苗的免疫 效力、提高病毒疫苗的抗体持续期以及病毒疫苗的保护率。

在本发明中，所述的菌蜕来自多种细菌，优选地来自沙门氏菌菌株。所述的细 菌菌蜕可经皮下、口、局部、粘膜、肺和/或鼻施用。

本发明的目的之二是提供一种细菌菌蜕的规模化制备方法，包括以下步骤：

(1)构建含有打孔质粒pBV-E的细菌，其中所述的打孔质粒pBV-E是通过将 PhiX174噬菌体的裂解蛋白E基因克隆到pBV-220质粒中得到的；

(2)将含羧苄青霉素的LB琼脂板上的含有打孔质粒pBV-E的细菌单克隆转 接到含羧苄青霉素的LB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养10-14小时，作为一 级种子液；按5％(v/v)接种量，将一级种子液转接到含羧苄青霉素的LB液体培 养基中，37℃200rpm培养6小时，作为二级种子液；向发酵罐中加入LB液体培养 基进行原位灭菌；按5％(v/v)接种量，取二级种子液转接到发酵罐中同时加入羧 苄青霉素进行发酵；通过程序化控制诱导前发酵条件：37℃、200rpm、10L空气/ 分钟，将细菌培养至OD600＝0.75～1.0；

(3)升温至42℃诱导E蛋白表达，在诱导2.5小时的时间点，加入终浓度 150-200μg/ml的氯霉素；诱导全程时间为4小时；

(4)收集菌体，70-90℃处理，冻干。

其中，优选的，PhiX174噬菌体的裂解蛋白E基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示。其中，优选的，各步骤中羧苄青霉素的浓度均为100μg/ml。

其中，优选的，所述的细菌为沙门氏菌菌株，在本发明的一个具体实施例中， 所述的沙门氏菌菌株为沙门氏菌Sm6。

将未加佐剂的新城疫灭活苗半成品与所述菌蜕混合，对SPF鸡进行免疫。将未 加佐剂的禽流感灭活疫苗半成品与所述菌蜕混合，对SPF鸡进行免疫。将未加佐剂 的2型猪圆环病毒疫苗半成品与所述菌蜕混合，对猪进行免疫。同时设不添加菌蜕 的疫苗作为对照，结果发现，相较于未添加菌蜕的疫苗，添加菌蜕作为佐剂的疫苗 能特异性提高病毒疫苗的免疫效力、提高病毒疫苗的抗体持续期，并最终提高病毒 疫苗的保护率。

本发明的有益效果主要体现在：

1、本发明提供了细菌菌蜕的大规模制备方法，为菌蜕疫苗的商品化生产奠定 了坚实的基础；

2、系统性的评价了菌蜕的佐剂功能，菌蜕能极大的提高病毒性疫苗的免疫效 力，而且菌蜕作为佐剂使用方法简单，可一定程度的降低疫苗的生产成本，对人类 和动物病毒性传染病的防控具有重大意义。

附图说明

图1为pBV-E/Sm6的裂解曲线图；

图2为Sm6菌蜕扫描电镜图；

图3为新城疫血凝抑制抗体效价检测结果；

图4为新城疫HI抗体持续期检测结果；

图5为禽流感HI抗体持续期检测结果。

具体实施方式

下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施 例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

实施例1：肠炎沙门氏菌菌蜕的规模化制备与鉴定

(1)含有打孔质粒pBV-E的肠炎沙门氏菌Sm6的构建

根据GenBank中噬菌体PhiX174裂解基因E设计引物：

Lysise-U(5'-AGGGAATTCATGGTACGCTGGACTTTGTGG-3')

Lysise-L(5'-AGGGGATCCGAGCTCTCACTCCTTCCG-3')

上、下游引物5'端分别引入了EcoR I和BamH I限制性酶切位点，由Invitrogen(上 海)公司合成。以噬菌体PhiX174双链DNA为模板扩增裂解基因E，其核苷酸序列 如SEQ ID NO.1所示。PCR扩增反应体系为50μL，其中：灭菌的去离子水22μL， PrimeSTAR MAX Premix(2×)25μL；10μM的上下游引物各1μL；PhiX174双链DNA 1μL(含12.5ng DNA)。扩增的循环参数为：1)94℃ 20s，55℃ 10s，72℃ 20s， 30个循环；2)72℃ 5min。PCR产物用0.9％的琼脂糖凝胶电泳检测，用胶回收试 剂盒回收E基因片段。采用BamH I和EcoR I对E基因片段和pBV-220质粒分别进行双 酶切，酶切反应体系如下：E基因或pBV-220质粒15μL；BamH I 2μL；EcoR I 2μL； 10×Thermo Scientific FastDigest buffer 5μL；灭菌去离子水26μL，总体积50μL，37℃ 水浴1h，胶回收E基因片段及线性pBV-220载体。

沙门氏菌菌种Sm6系由本研究室自发病鸡群分离得到。以无菌接种环取冻存的 于普通LB平板划线，同时在含氨苄青霉素(Amp)的LB平板划线做对照，37℃温 箱培养过夜。次日挑取生长良好的单个菌落接种于5mL LB液体培养基中37℃振摇培 养过夜。取1mL活化后的培养液加到100mL LB液体培养基中，37℃振摇培养2.5-3h 使OD_600nm达到0.4左右。在无菌条件下将细菌培养物倒入灭菌后冰预冷的离心管中， 冰浴10min，4℃ 1600rpm离心10min，尽弃上清。用10mL冰预冷的0.1M CaCl₂温和 悬起细菌沉淀，冰浴放置30min。4℃ 1100rpm离心10min后尽弃上清。以4mL冰预冷 的0.1M CaCl₂溶液再次重悬沉淀，加入终浓度为15％的灭菌甘油混匀后分装为200μl/ 管，置于冰块中，加入预冷的连接产物10μL于感受态细胞中。在冰块中冰浴30min， 再置42℃热休克90s，热休克后立即冰浴2min，再加入事先预热到37℃无抗生素的 100μL LB培养液，37℃摇动培养1h，之后3500rpm离心3min，弃去多余上清，剩余 100μL，混匀菌体，取100μL均匀涂布于含50μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃ 培养12～16h。随机挑取菌落，接种于5mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中过 夜培养，采用碱裂解法小量提取质粒DNA，分别用PCR和双酶切进行鉴定，所得阳 性克隆，即为pBV-E/Sm6。

(2)菌蜕的发酵

将LB琼脂板(含100μg/ml羧苄青霉素)上的含有打孔质粒pBV-E的肠炎沙门 氏菌Sm6单克隆转接到含10ml LB液体培养基(含100μg/ml羧苄青霉素)的100ml 三角瓶中，37℃200rpm振荡培养过夜(10-14小时)，作为一级种子液。按5％(v/v) 接种量，将一级种子液转接到含150ml LB液体培养基(含100μg/ml羧苄青霉素) 的500ml锥形瓶，37℃200rpm培养6小时，作为二级种子液。向15-L发酵罐 (BIOSTAT C-15，Sartorius，Germany)中加入10L pH7.2的LB液体培养基进行原位 灭菌。按5％(v/v)接种量，取二级种子液转接到发酵罐中同时加入羧苄青霉素至 终浓度100μg/ml进行发酵。存档以下参数：温度、流动、搅拌子、pH、pO₂。通过 程序化控制诱导前发酵条件(37℃、200rpm、10L空气/分钟)将细菌培养至对数生 长期(OD600＝0.75～1.0)。升温至42℃诱导E蛋白表达，在诱导2.5小时的时间点， 加入终浓度170μg/ml的氯霉素；诱导全程时间为4小时。诱导前与诱导期间每隔 0.5小时取10ml发酵样品，检测光密度值，直至光密度不再降低，将样品涂布LB 平板于37℃培养12小时，菌落计数法计算菌蜕浓度。4℃80000×g离心10分钟收 集菌体，用pH7.0的PBS洗涤沉淀两次，将沉淀于70-90℃处理3分钟。按最后冻 干所需的菌蜕浓度，加入相应体积的PBS或冻干保护剂(明胶-蔗糖或脱脂乳)，分 装于5ml疫苗瓶，每瓶1ml(含菌蜕5×10¹⁰cfu)，使用VirTis GENESIS冻干机将样 品冻干48小时。保存于-20℃。

(3)裂解曲线绘制与裂解效率测定

发酵诱导前与诱导期间每隔0.5小时取10ml发酵样品，检测光密度值，直至光 密度不再降低，将样品涂布LB平板于37℃培养12小时，菌落计数法计算裂解效 率。

实验结果：菌落计数表明，含打孔质粒pBV-E的肠炎沙门氏菌Sm6在诱导后1 小时已经开始溶菌，4小时可充分裂解(图1)，裂解效率达到99.999％

(4)菌蜕的扫描电镜观察与菌蜕的活菌检测

取冻干前的菌蜕，3％戊二醛重悬，4℃固定过夜，乙醇逐级脱水，乙酸戊二酯 置换，干燥后喷金，扫描电镜观察。实验结果如图2，绝大多数细菌菌体呈现空泡 状结构，形态完整，并可见200nm左右的溶菌孔道。

取冻干前与冻干后的菌蜕原液，涂布LB平板于37℃培养12小时，结果平板 上无菌落出现，表明所制备的菌蜕无活菌存在。

实施例2 菌蜕作为新城疫疫苗免疫佐剂的效果

鸡新城疫油乳剂灭活苗与未加佐剂的新城疫灭活苗半成品为哈尔滨维科生物 技术开发公司生产。肠炎沙门氏菌菌蜕按实施例1方法制备。

(1)皮下免疫途径检测菌蜕的佐剂效果

1)分组处理

7日龄SPF鸡共60只，随机分为4组，每组15只，即试验Ⅰ组(鸡新城疫油乳 剂灭活苗组，颈部皮下免疫，0.3ml/只)、试验Ⅱ组(菌蜕疫苗佐剂组，新城疫灭活 苗半成品与菌蜕混合比例为1:2(体积比)，菌蜕为5×10⁹cfu，颈部皮下免疫，0.3ml/ 只)、试验Ⅲ组(LPS佐剂组，新城疫灭活苗与100μg/ml LPS 1:1混合，颈部皮下免 疫，0.3ml/只)和对照组(PBS，颈部皮下免疫，0.3ml/只)。首次免疫日记为第0 天，共免疫2次，每次免疫间隔两周。二免一周(第21天)后对试验鸡只进行滴 鼻，点眼，攻新城疫强毒株，每只鸡的攻毒剂量为10⁵EID₅₀。攻毒后每日观察其临 床症状，观察15天。计算疫苗的保护率。

2)病毒血凝抑制抗体效价与持续期检测

于一免二周(第14天)和二免一周(第21天)翅静脉采血，进行血凝(HA) 与血凝抑制(HI)试验。

HA试验：取96孔“V”形微量反应板，自左至右各孔加50μL PBS，于左侧第1 孔加50μL NDV鸡胚尿囊液，混匀后，吸50μL至第2孔，反复吹打数次后，依 次稀释至第11孔，吸弃去50μL，经倍比稀释，鸡胚尿囊液的稀释倍数为21-211， 第12孔不加鸡胚尿囊液，作为对照，然后自左至右向各孔加1％鸡红细胞悬液 50μL，振荡混匀，37℃静置25min，观察结果，以试验排中能使等量红细胞发生完 全凝集的最高稀释倍数作为鸡胚尿囊液中NDV的血凝价(HAU)，用log2表示。

HI试验：按HA试验测出的NDV血凝价除以4即为4单位HAU，按照稀释倍 数配制4单位NDV液。并进行血凝实验，验证4单位抗原，取96孔“V”形微量反 应板，自左至右1-10孔各加50μLPBS，11和12孔分别加4单位NDV液和血清对 照；第1孔加入50μL待检血清，反复吹吸混匀后，取50μL至第2孔混匀，依次稀 释至第10孔，吸弃50μL，经倍比稀释，血清的稀释倍数为2¹-2¹⁰；自第1至第10 孔各加50μL 4单位NDV液，第12孔加50μL血清，震荡混匀，置37℃温箱作用 20min；自第1至第12孔各加1％鸡红细胞50μL，震荡混匀，37℃静置20min，以 完全抑制凝集的血清最高稀释倍数作为HI滴度，用log2表示。

血凝抑制结果表明：试验Ⅰ组与试验Ⅱ组均能增强特异的病毒血凝抑制抗体的效 价，且高于试验Ⅲ组(图3)。

二免一周后每周进行翅静脉采血，进行血凝抑制试验。结果表明：直到二免十 二周(第112天)，两个实验组都可以保持较高的血凝抑制价效价(图4)。

3)新城疫攻毒后各组的保护情况和排毒情况

攻毒后，对照组的鸡出现眼观症状：头颈向后或一侧扭转，眼半开或全闭，冠 渐变暗红色，嗉囊内充满液体内容物，倒提时会出现大量酸臭液体流出；从第5天 开始死亡，第10天全部死亡，剖检可见喉头、气管、小肠浆膜粘膜出血，腺胃乳 头肿胀、出血。试验Ⅲ组于第10天有两只鸡跛行，到15天没有死亡。试验Ⅰ组、试 验Ⅱ组的鸡无眼观症状，对强毒的攻击可以达到100％保护。

攻毒后每日观察SPF鸡的健康状况，并在攻毒后第3d、第5d、第7d采集SPF 鸡的咽部拭子和泄殖腔拭子，置于含50％甘油的PBS(含青霉素、链霉素)中，样 品液4℃2000×g离心10分钟，取上清以200μL/枚的接种剂量接种于9日龄SPF 鸡胚，弃掉24小时内死亡的鸡胚，72小时后收取鸡胚尿囊液，通过HA试验检测 判定SPF鸡是否排毒。实验结果表明：在攻毒后第3d，试验Ⅰ组和试验Ⅲ组的咽喉 拭子和泄殖腔拭子均检测到排毒，而试验Ⅱ组在泄殖腔拭子中未检测到排毒。至第 10d，试验Ⅰ组、试验Ⅱ组在咽喉和泄殖腔均检测不到排毒，结果如下表1所示。

表1 新城疫攻毒后的病毒分离结果与病死率

注：“—”表示对照组鸡全部死亡

(2)皮下免疫与滴鼻免疫效果的对比

21日龄SPF鸡共75只，随机分为5组，每组15只，即试验Ⅰ组(鸡新城疫油 乳剂灭活苗组，颈部皮下免疫，20μl/只)、试验Ⅱ组(菌蜕疫苗佐剂组，新城疫灭活 苗半成品与菌蜕疫苗混合比例为1:2，菌蜕为1×10⁹cfu，颈部皮下免疫，20μl/只)、 试验Ⅲ组(鸡新城疫低毒力活疫苗组，每只滴鼻免疫1/100使用剂量)、试验Ⅳ组(菌 蜕疫苗佐剂组，新城疫灭活苗半成品与菌蜕疫苗混合比例为1:2，菌蜕为1×10⁹cfu， 每只滴鼻免疫1/100使用剂量)和对照组，免疫三周后对试验鸡只进行滴鼻，点眼， 攻新城疫强毒株，每只鸡的攻毒剂量为10⁵EID50。攻毒后每日观察其临床症状，观 察15天。计算疫苗的保护率，结果如下表2所示。

表2 皮下免疫与滴鼻免疫的HI抗体水平与保护率

组别 一免三周HI抗体平均(log2) 保护率 试验Ⅰ组 7 93.3％(14/15) 试验Ⅱ组 8 100％(15/15) 试验Ⅲ组 4.4 93.3％(14/15) 试验Ⅳ组 5.3 100％(15/15) 对照组 1 0％(0/15)

实施例3菌蜕作为禽流感灭活疫苗佐剂的免疫效果

7日龄SPF鸡共24只，随机分为3组，每组8只，即试验Ⅰ组(禽流感油乳剂 灭活苗组，胸肌免疫，0.3ml/只)、试验Ⅱ组(菌蜕疫苗佐剂组，禽流感灭活苗半成 品与菌蜕混合比例为1:2(体积比)，菌蜕为5×10⁹cfu，胸肌免疫，0.3ml/只)和对 照组。首次免疫日记为第0天，共免疫2次，每次免疫间隔两周。二免一周后每周 进行翅静脉采血，进行血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验。

HA试验：取96孔“V”形微量反应板，自左至右各孔加50μL PBS，于左侧第1 孔加50μL AIV鸡胚尿囊液，混匀后，吸50μL至第2孔，反复吹打数次后，依次 稀释至第11孔，吸弃去50μL，经倍比稀释，鸡胚尿囊液的稀释倍数为21-211，第 12孔不加鸡胚尿囊液，作为对照，然后自左至右向各孔加1％鸡红细胞悬液50μL， 振荡混匀，37℃静置25min，观察结果，以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集 的最高稀释倍数作为鸡胚尿囊液中AIV的血凝价(HAU)，用log2表示。

HI试验：按HA试验测出的AIV血凝价除以4即为4单位HAU，按照稀释倍 数配制4单位AIV液。并进行血凝实验，验证4单位抗原，取96孔“V”形微量反应 板，自左至右1-10孔各加50μL PBS，11和12孔分别加4单位AIV液和血清对照； 第1孔加入50μL待检血清，反复吹吸混匀后，取50μL至第2孔混匀，依次稀释至 第10孔，吸弃50μL，经倍比稀释，血清的稀释倍数为2¹-2¹⁰；自第1至第10孔各 加50μL 4单位AIV液，第12孔加50μL血清，震荡混匀，置37℃温箱作用20min； 自第1至第12孔各加1％鸡红细胞50μL，震荡混匀，37℃静置20min，以完全抑制 凝集的血清最高稀释倍数作为HI滴度，用log2表示。

结果表明：直到二免十二周(第112天)，两个实验组都可以保持较高的血凝抑 制价效价(图5)。

实施例4菌蜕作为2型猪圆环病毒灭活疫苗免疫佐剂的效果

7周龄SPF小鼠共15只，随机分为3组，每组5只，即菌蜕佐剂组、法国ISA15 佐剂组和对照组。菌蜕佐剂组：将PCV2灭活苗半成品与菌蜕按照1:1(体积比)混 合，菌蜕为5×10⁹cfu，背部皮下免疫，0.3ml/只；法国ISA15佐剂组：将PCV2灭 活苗半成品与法国ISA15佐剂按照15：85(质量比)混合，背部皮下免疫，0.3ml/ 只；对照组：每只小鼠注射0.3ml PBS。首次免疫日记为第0天，共免疫2次，每 次免疫间隔三周。首次免疫当天以及之后每周进行尾静脉采血，利用免疫过氧化物 酶单层细胞试验(IPMA)方法测定血清中抗PCV2的抗体水平。

IPMA操作程序：用PCV2分子标记毒株PCV2/PE株60代作为毒种，同步接 种于新消化的PK-15细胞悬液(2×10⁵/mL)，病毒维持液为RPMI1640，添加2％犊 牛血清(FCS)和青、链霉素，37℃培养6d收毒，反复冻融3次，4℃3000×g离 心10min，病毒培养物上清同步接种于新消化的PK-15细胞悬液中，以100μL/孔分 注于96孔板的奇数列，偶数列设未接种病毒细胞对照，置37℃，5％CO₂条件下培 养形成单层，用丙酮-PBS液固定，干燥后即为IPMA反应板，置-20℃备用。取IPMA 反应板置室温预热，PBS浸洗一次。用PBS液将待检猪血清按1:25、1:50、1:100 等比例系列稀释，以PCV2阳、阴性血清作对照，每份稀释的血清分别加入1个抗 原孔和l个细胞对照孔(100μL/孔)，置37℃湿盒孵育1h，PBS洗涤3次，加入稀释 的HRP-SPA液(100μL/孔，Zymed公司产品)，置37℃湿盒孵育1h，PBS洗涤3次， 加3-氨基-9-乙基咪唑(AEC)反应液显色，用光学显微镜观察判定结果。

结果表明：菌蜕佐剂可以刺激小鼠产生与ISA15佐剂相同水平的特异性抗体， 更为重要的是菌蜕佐剂的激发速度更快，较ISA15佐剂提前一周时间，结果如下表 3所示。

表3 菌蜕佐剂与ISA15佐剂免疫PCV2疫苗效果对比

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性 的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进 行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。