一种基于全基因组结合生物信息学特异性筛选华根霉脂肪酶基因的方法

摘要

本发明公开了一种基于全基因组结合生物信息学特异性筛选华根霉脂肪酶基因的方法，属于基因工程领域。本发明针对具有特定催化性能和用途的目标脂肪酶，通过全基因组脂肪酶基因挖掘，分类、催化特性预测得到候选基因；将候选基因分别在大肠杆菌中表达，通过分别检测可溶蛋白和包涵体活性进行筛选，获得具有特定催化性能的华根霉脂肪酶基因，并在重组大肠杆菌中进行活性表达制备。最终获得了编码仅在包涵体状态下表现酯合成活性和甲醇解活性的脂肪酶的基因。本发明方法将显著地提高具有特定特性新型脂肪酶基因获得的效率，对于其他酶的筛选和制备也提供了有价值的参考。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于全基因组结合生物信息学特异性筛选华根霉脂肪酶基因的方法，尤其是一种基于全基因组结合生物信息学特异性筛选华根霉脂肪酶基因并在重组大肠杆菌中重组表达的方法，属于基因工程领域。

背景技术

脂肪酶又称三酰基甘油水解酶(EC3.1.1.3)，是一种广泛应用的水解酶类，能够在水相中催化水解底物酯键，有些脂肪酶也可以在非水相中催化酯化反应和酯交换反应等。微生物脂肪酶已被广泛应用于很多工业，如油脂工业、制药工业、食品工业和饲料工业等。目前已有数百种微生物脂肪酶报道，并且许多已经商品化，但是，由于脂肪酶种类的广泛多样性，不同脂肪酶的催化特性，如催化活性(酯合成活性、水解活性、甲醇解活性)、底物特异性、位置选择性、立体选择性等有着显著的差异。为满足不同行业对特定特性脂肪酶的需求，进一步挖掘微生物脂肪酶资源，开发和制备特定活性的脂肪酶仍然具有重要的现实意义。本发明从具有特定基因资源的微生物出发，欲采用结合生物信息学和特异性筛选技术，基于微生物全基因组的脂肪酶基因挖掘，分类、催化特性预测的基础上，通过分别检测大肠杆菌外源表达可溶蛋白和包涵体的不同催化特性的筛选技术，获得具有特定特性的新型华根霉脂肪酶基因，并在重组大肠杆菌中进行活性表达制备。

由于微生物特性和筛选方法的限制，通过传统微生物筛选方法获得特定特性脂肪酶，进而开发新型脂肪酶基因资源的效率一般不高。近年来，现代基因组学技术为深度开发微生物基因资源提供了可能，通过对特定微生物的全基因组测序，挖掘其中相关基因的方法已被研究者所采用。华根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC No：M201021是从我国传统微生物载体——大曲中分离得到的一株丝状真菌，用于白酒生产，具有显著的催化酯化合成和酯水解的能力，表明其含有丰富的脂肪酶，其中一种脂肪酶已被分离并克隆表达。但进一步研究发现，一种外源表达的华根霉脂肪酶并不具有野生华根霉膜结合脂肪酶催化酯合成的能力，表明华根霉中可能存在其他活性表现形式的脂肪酶。目前该菌株全基因组测序已经完成(GenomeAnnouncements,2013,1(2):e00195-12)，为进一步挖掘华根霉脂肪酶基因资源提供了可能。现代生物信息学技术及相关软件也为脂肪酶基因资源的挖掘提供了有效的手段。

此外，脂肪酶的催化特性最终还是由活性测定来确定。而脂肪酶的活性测定方法较多，常用的方法有橄榄油指示剂滴定法、对硝基苯脂肪酸酯(p-NP)法、有机相酯合成法、甲醇水解法等。这些方法分别反映了脂肪酶的不同催化性能，而且不同方法测得的活性间并不具有明显的对应关系。仅通过一种活性测定筛选方法，欲得到不同催化特性的新型脂肪酶通常是比较困难的。因此，针对特定目标，有必要选择适当的活性测定方法以筛选特定催化特性的脂肪酶。

通常具有活性的酶，包括野生酶及外源表达酶，均为可溶性蛋白；而不溶性蛋白，如大肠杆菌外源表达的包涵体，通常不表现出酶的活性，需复性后才可能表现相应的活性。本发明基于华根霉基因组资源，主要针对脂肪酶催化酯合成和水解反应的不同性能，分别对候选脂肪酶基因大肠杆菌外源表达可溶蛋白和包涵体进行不同活性检测和筛选，以获得具有特定特性的新型华根霉脂肪酶基因，进而在重组大肠杆菌中进行活性表达制备。本发明方法将显著地提高具有特定特性新型脂肪酶基因获得的效率，对于其他特性脂肪酶的筛选和制备也提供了有价值的技术方案。

发明内容

本发明的目的是针对脂肪酶及其催化特性的多样性，克服现有脂肪酶筛选方法针对性不强、效率不高的问题，提供一种基于全基因组结合生物信息学特异性筛选华根霉脂肪酶基因的方法，基于华根霉全基因组序列结合生物信息学挖掘潜在的候选脂肪酶基因，将候选基因分别在大肠杆菌中表达，通过分别检测可溶蛋白和包涵体部分的活性进行筛选，获得具有特定催化性能的华根霉脂肪酶基因。

本发明的技术方案主要包括以下步骤：

(1)根据华根霉全基因组基因注释获得潜在的脂肪酶和酯酶基因，并对脂肪酶和酯酶进行分类，选择已知的具有特定催化特性的脂肪酶基因，与所得华根霉基因组中潜在的脂肪酶和酯酶基因进行同源性比对，选择同源性较高的脂肪酶或酯酶基因，预测其催化特性，作为候选基因；

(2)将候选基因建立脂肪酶基因文库，在大肠杆菌中表达，分别检测可溶蛋白和包涵体的不同催化特性，筛选获得具有特定催化特性的华根霉脂肪酶基因。

本发明技术方案还可以包括将筛选获得的具有特定特性的华根霉脂肪酶基因在重组大肠杆菌中进行活性表达，制备相应酶制剂。具体地，是根据大肠杆菌表达的蛋白活性形式，分别对可溶蛋白或不可溶蛋白(包涵体)进行处理，制备相应酶制剂。

步骤(1)所述具有特定功能的华根霉，是从我国传统微生物载体——大曲中分离得到的一株丝状真菌华根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC No：M201021。该菌株用于白酒生产，具有显著的催化酯化合成和酯水解的能力，可产多种脂肪酶。其全基因组已测序完成，参见文献Genome Announcements,2013,1(2):e00195-12，基因注释参见http://genome.jgi.doe.gov/Rhich1/Rhich1.home.html。

步骤(1)所述采用生物信息学技术进行脂肪酶基因筛选及催化特性预测，优选根据基因注释获得所有潜在的脂肪酶和酯酶基因，并利用生物信息学工具进行脂肪酶和酯酶的分类；选择已知的具有特定催化特性的脂肪酶的基因，与华根霉基因组中潜在的脂肪酶和酯酶基因进行同源性比对，选择确定同源性较高的脂肪酶或酯酶基因，预测其催化特性，建立脂肪酶候选基因库。

所述已知的具有特定催化特性的脂肪酶可以是用于生物柴油合成的米根霉脂肪酶(Rhizopus oryzae Lipase，ROL)和/或用于非水相有机合成的南极假丝酵母脂肪酶B(Candidaantarctica Lipase B，CALB)和/或用于食品加工的尖孢镰刀菌脂肪酶(Fusarium oxysporumLipase，FOL、FOL1)等。

步骤(2)优选以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，以pET-22b为表达载体。

步骤(2)所述分别检测可溶蛋白和包涵体的不同催化特性，是根据脂肪酶不同的催化特性和用途，采用不同的脂肪酶活性测定方法，如橄榄油指示剂滴定法测定脂肪酶水解活性(参考国家标准GBT23535-2009脂肪酶制剂)、有机相酯合成法测定脂肪酶合成活性(参考Bioprocess and Biosystems Engineering,2007,30(3):147-155中描述的方法)、甲醇水解法测定脂肪酶甲醇解活性(参考Journal of Bioscience and Bioengineering,2006,101(4):328-333中描述的方法)。检测对象同时包括重组大肠杆菌可溶和不可溶蛋白(包涵体)表达产物。

本发明要解决的第二个技术问题是提供两个应用上述方法筛选得到的华根霉脂肪酶基因，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因(A06672)编码的脂肪酶，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，以pET-22b为表达载体时，表达得到的可溶性蛋白部分具有脂肪酶水解活性(62U/mg)和较低的合成活性(0.029U/mg)，包涵体部分则同时具有脂肪酶水解活性(108U/mg)、合成活性(0.42U/mg)和甲醇解活性(201.7U/mg)。

进一步地，所述包涵体的获得方法优选将带有目的基因的pET-22b转化E.coli BL21(DE3)，将阳性转化子单菌落接入含Amp抗性的5mlLB液体培养基的试管中，于37℃200rpm培养3-4个小时作为种子液；向1LLB液体培养基中加入3试管种子液，37℃200rpm培养4-5个小时，加入IPTG至终浓度0.4mmol/L进行诱导，28℃180rpm诱导3-5小时，离心收集菌体，在适当的缓冲液中超声破碎，离心后沉淀即为包涵体蛋白。所得包涵体可直接作为催化非水相酯合成或醇解反应的脂肪酶使用。

所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的基因(A07506)编码的脂肪酶，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，以pET-22b为表达载体时，表达得到的可溶性蛋白部分具有脂肪酶水解活性(201U/mg)和较低的合成活性(0.015U/mg)，包涵体部分则也具有脂肪酶水解活性(78U/mg)和较低的合成活性(0.042U/mg)与甲醇解活性(19.0U/mg)。

进一步地，所述可溶性蛋白的获得方法优选将带有目的基因的pET-22b转化E.coli BL21(DE3)，将阳性转化子单菌落接入含Amp抗性的5ml LB液体培养基的试管中，于37℃200rpm培养3-4个小时作为种子液，1L LB液体培养基中加入3试管种子液，30℃200rpm培养1小时，加入IPTG至终浓度0.4mmol/L进行诱导，16℃180rpm诱导2小时，离心收集菌体，在适当的缓冲液中超声破碎，离心后得到的上清液即为脂肪酶溶液。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

(1)本发明针对具有特定催化功能的目标脂肪酶，利用微生物全基因组数据和生物信息学工具进行脂肪酶基因的初步筛选；根据脂肪酶的不同催化功能和用途，分别采用不同的脂肪酶活性分析方法进行进一步筛选具有特定催化功能的脂肪酶。可有效减轻实验工作量，针对性强，筛选效率较高。

(2)通常情况下，有活性的酶包括野生酶及外源表达酶，均为可溶性蛋白；而不溶性蛋白，如大肠杆菌外源表达的包涵体，则不表现酶活。由于脂肪酶可以催化水相、油水界面以及有机相(非水相)介质中的反应，因此，不溶于反应体系中的脂肪酶，例如包涵体，也有可能表现出某些催化能力。本发明根据脂肪酶的催化功能，针对大肠杆菌外源表达时可能出现的不同蛋白形式，包括可溶蛋白和不可溶蛋白(包涵体)，均进行活性筛选分析，有效地提高了获得目的基因及蛋白的可能性。可避免仅仅分析可溶性蛋白活性时，漏掉特定基因编码的酶具有多种不同催化功能的情况。例如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列编码的酶，在筛选过程中，如果放弃分析包涵体的不同催化活性，即使基因功能分析预测其具有甲醇解活性，在测不到具体活性的情况下，则还是无法挖掘、确定所述酶的甲醇解活性。而本发明通过对包涵体进行活性分析，最终确定所述酶还具有甲醇解活性，并发现在可溶与不可溶状态下不同催化特性的活力不同。

本发明方法将显著地提高具有特定特性新型脂肪酶基因获得的效率，对于其他酶的筛选和制备也提供了有价值的参考。

具体实施方式

实施例1基于华根霉全基因组的脂肪酶基因挖掘

基于华根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC No：M201021全基因组数据(GenBank编号ANKS00000000)，通过Augustus软件与Genemark软件工具分别对测序后全基因组序列数据进行基因预测，将预测基因序列与各数据库NR、PFAM、CDD、KEGG、COG、SwissProt及TrEMBL进行比对，获得相应的功能注释信息(http://genome.jgi.doe.gov/Rhich1/Rhich1.home.html)。从基因注释中共发现119个酯酶基因和123个脂肪酶基因，其中部分基因既属于酯酶又属于脂肪酶。

实施例2预测具有目的酶功能的脂肪酶候选基因的确定

分别选择用于生物柴油合成的米根霉脂肪酶(Rhizopus oryzae Lipase，ROL，氨基酸序列如GeneBank：BAG16821.1所示)，用于非水相有机合成的南极假丝酵母脂肪酶B(Candidaantarctica Lipase B，CALB，氨基酸序列如NCBI UniProtKB/Swiss-Prot：P41365.1所示)，用于食品加工的尖孢镰刀菌脂肪酶(Fusarium oxysporum Lipase，FOL和FOL1氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示)作为目标酶，将华根霉基因组中的脂肪酶和酯酶基因与目标酶基因序列进行Blast比对。在使用标准Blastp比对过程结果不理想时，使用更为灵敏的Position-Specific Iterated(PSI)-BLAST，有利于发现远亲物种的相似蛋白或某个蛋白家族的新成员。以Query cover、Score、Identities和Positives为指标进行分析，选择最有可能的目的酶候选基因。针对各目标酶主要候选基因及比对参数如表1所示，其中，针对米根霉脂肪酶ROL，最有可能的候选脂肪酶基因依次为A07506、A06672和A03113(http://genome.jgi.doe.gov/pages/search-for-genes.jsf？organism＝Rhich1)。

表1各目标酶候选基因及比对参数

实施例3候选脂肪酶基因大肠杆菌工程菌的构建与表达

针对表1中的候选基因及其成熟肽片段分别设计特异性引物，PCR扩增产物连接PMD19-T，转化入大肠杆菌Jm109中，37℃培养过夜，挑取阳性转化子，提取质粒，经双酶切和PCR验证后进行测序。经测序正确后经双酶切，分别将目的基因连接pET-22b，转化大肠杆菌Jm109，37℃过夜培养，挑取阳性转化子，提取质粒，经双酶切和PCR验证后进行测序。经测序正确后的重组表达质粒分别转化E.coli BL21(DE3)，挑取单克隆进行扩培，并在LB培养基中培养，菌液浓度OD₆₀₀0.6～0.8时加入IPTG至终浓度0.4mmol/L30℃诱导培养4h进行目的基因的外源表达。经诱导表达后的菌体经过超声破碎后将上清及沉淀分别收集，作为粗酶进行进一步分析。

实施例4候选脂肪酶基因表达产物的脂肪酶活性分析及脂肪酶基因的筛选

针对各候选基因重组大肠杆菌不同表达产物(包括可溶蛋白和包涵体)，根据脂肪酶用途分别采用不同的脂肪酶活性测定方法进行分析，包括橄榄油指示剂滴定法测定脂肪酶水解活性、有机相酯合成法测定合成活性、甲醇水解法测定醇解活性。同时以未携带候选基因的宿主菌作为对照菌。对照菌仅表现出微弱的脂肪酶水解活性(<5U/mL)，其他活性未能检测到。而重组菌各脂肪酶表达产物均表现出不同程度的水解活性，其中A07506表达的可溶部分水解活性相对较高。但令人意想不到的是表现出较为明显的脂肪酶合成活性和甲醇解活性的，却是A06672基因表达的包涵体部分，将包涵体复性后，上述两种活性丧失。这两个基因表达产物的活性分析结果如表2所示。

表2不同表达产物的脂肪酶活性分析

结合表1和表2的结果，针对用于生物柴油合成的米根霉脂肪酶ROL，候选基因A07506和A06672序列上更为接近，甲醇解活性分析也表明这两个基因的表达产物具有类似功能，但只有包涵体具有这样的活性，其中A06672的表达产物活性更高，表明该基因为具有醇解活性的脂肪酶功能，在生物柴油合成等领域具有潜在的应用价值。

针对用于非水相有机合成的南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)，基因比对未发现非常类似的华根霉脂肪酶基因，因而与CALB同源性较高的华根霉脂肪酶基因表达产物未能表现出较高的合成活性。但是有报道ROL也具有较高的脂肪酶合成活性，因而与ROL同源性很高的A06672表达的包涵体也表现出了较高的合成活性，具有相关领域应用的潜力。

针对用于食品加工的尖孢镰刀菌脂肪酶FOL，虽然基因比对未发现同源性较高的华根霉脂肪酶基因，但FOL具有的脂肪酶水解活性通常一般脂肪酶都能表现，而活性高低就显得较为重要。因而活性分析表明，华根霉脂肪酶A07506具有相关领域的应用潜力。

实施例5特定脂肪酶基因在重组大肠杆菌中的活性表达及脂肪酶的制备

将带有表达质粒pET22-RCL1(华根霉脂肪酶A06672)的E.coli BL21(DE3)单菌落加入含Amp抗性的5ml LB液体培养基试管中37℃200rpm培养3-4个小时作为种子液，1L LB液体培养基摇瓶中加入3试管种子液，37℃200rpm培养4-5个小时，加入IPTG至终浓度0.4mmol/L进行诱导，28℃180rpm诱导3-5小时，离心收集菌体，在20mM磷酸缓冲液(pH6.2)中超声破碎5min(400w，间隔时间3s)，离心后沉淀即为包涵体蛋白，其非水相酯合成活性为0.42U/mg，甲醇解活性为201.7U/mg(对照菌活性均为0U/mg)，可直接作为催化非水相酯合成或醇解反应的脂肪酶使用。

将带有表达质粒pET22-RCL2(华根霉脂肪酶A07506)的E.coli BL21(DE3)单菌落加入含Amp抗性的5ml LB液体培养基试管中37℃200rpm培养3-4个小时作为种子液，1L LB液体培养基摇瓶中加入3试管种子液，30℃200rpm培养1小时，加入IPTG至终浓度0.4mmol/L进行诱导，16℃180rpm诱导2小时，离心收集菌体，在20mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液中超声破碎5min(400w，间隔时间3s)，离心后得到的上清液即为脂肪酶溶液，经水解活性测定，活力为109U/mg。可作为常见脂肪酶使用。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。