血浆中氨基酸分析用标准液

摘要

一种血浆中氨基酸分析用外标液，其含有下述(1)和(2)：(1)选自下述A成分的至少1种氨基酸，每种的浓度为0.0007M～0.49M；(2)(i)选自下述B成分的至少1种氨基酸，每种的浓度为选自A成分的氨基酸之中浓度最低的氨基酸的0.2倍～0.9倍；(ii)选自下述C成分的至少1种氨基酸，每种的浓度为选自A成分的氨基酸之中浓度最低的氨基酸的0.1倍～0.4倍；或者(iii)选自下述D成分的至少1种氨基酸，每种的浓度为选自A成分的氨基酸之中浓度最低的氨基酸的0.05倍～0.2倍,A成分：缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸和谷氨酰胺；B成分：丝氨酸、脯氨酸、苏氨酸、牛磺酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、组氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸；C成分：天冬酰胺、鸟氨酸、精氨酸和色氨酸；D成分：谷氨酸、蛋氨酸、瓜氨酸和胱氨酸。

说明书

技术领域

本发明涉及氨基酸分析用标准液，特别是涉及外标物或内标物用途的标准液、以 及使用了该标准液的氨基酸定量方法。

背景技术

近年来，已知生物体内的代谢物不仅受遗传因素的影响，还大大受到环境因素的 影响，这些代谢物的分析与基因、蛋白质的分析同样地被作为疾病诊断和健康状态的 指标而受到关注。其中，氨基酸、胺等氨基酸相关化合物是最广泛存在的代谢物组之 一(例如非专利文献1)，自古以来就对其进行定量分析，并且开发出各种各样的分析 方法。

另一方面，在定量分析中，一般使用标准曲线法，该标准曲线法通常对覆盖着分 析对象化合物的测定点的2种以上浓度的标准物质进行分析来制作标准曲线。在利用 这样的标准曲线法的定量分析中，使用已知浓度的外标物预先求出浓度与信号 (signal，具体来说表示为峰面积、峰高等)的相关关系，根据其中所得到的信息(即标 准曲线)求出检测样品中的浓度。因此，在使用标准曲线法的定量分析中以由外标(基 准)得到的标准曲线作为基准，因而为了进行高精度的解析，定量用的标准品极为重 要。并且，为了高精度地进行利用标准曲线法的定量分析，准备多个不同浓度系列的 标准品，实际测定这些标准品来制作标准曲线，并且检测样品中的测定对象的浓度处 于标准曲线制作中使用的标准品的浓度之间对于进行高精度定量而言是重要的。具体 来说，如果检测样品中的对象的浓度为50μM(μmol/l)的样本，则优选使用从25μM到 75μM的标准品。进一步，此时的标准品的校准点(测定点)的范围窄时更容易确保浓 度与信号的线性，因而是优选的。更具体来说，相比于在1μM到100μM间取校准点， 优选在25μM至75μM间取校准点。

然而，生物体内的氨基酸(氨基酸相关化合物)的种类较多。例如，在SRL公司的 氨基酸分析的检查项目中，举出了39种氨基酸相关化合物作为分析对象(例如非专利 文献2)。并且，已知生物体内的氨基酸浓度因氨基酸的种类而大大不同，浓度高的氨 基酸和浓度低的氨基酸之间存在100倍左右(2数量级)的浓度差。因此，使用已有的 混合标准液[例如，氨基酸混合标准液AN-II型(代码编号：015-14461、011-14463)、 B型(代码编号：016-08641、012-08643)、H型(代码编号：013-08391、019-08393)等(均 由和光纯药工业株式会社销售)]进行分析时，存在需要根据各氨基酸相关化合物的浓 度范围对标准物质或检测样品进行稀释等需要花费工夫进行准备的问题。

另一方面，已有关于针对人血浆中的氨基酸的参考标准物质的报告(非专利文献 3)，该报告中的标准物质为由非特定多数的100名美国男女得到的血浆混合而成的血 浆池，因此无法避免批次间的浓度值的偏差。另外，将其用作标准液进行氨基酸测定 时，该标准物质中含有的各种氨基酸的浓度为100人的平均值，因而样本的氨基酸浓 度超过平均值时，该浓度脱离标准曲线的范围，在测定精度方面欠缺可靠性。进一步， 该标准物质含有氨基酸以外的各种生物体物质，因此无法否定因这些物质对测定值产 生影响的可能性，在用作用于高精度定量分析的标准物质时存在问题。

因此，期望开发出一种标准物质，其不需要根据所测定的氨基酸的种类调整浓度， 使用适当稀释1种溶液而成的物质就能够制作可以对来自生物体的样本中的各种氨 基酸能够进行高精度定量的标准曲线。

进一步，使用标准曲线法的定量分析法中有所谓的外标法和内标法等，而对于内 标物质来说，与外标物质一样通过匹配检测样品的特性来设计标准物质，从而可以提 高定量精度。特别是将质谱仪作为检测器时，样品中的基质效应的影响较大，使用内 标物质在高精度测定方面非常重要。

关于使用该内标法的氨基酸测定已有多项研究报道(例如非专利文献4、5)，以往 的内标物质的浓度与信号的线性差，使用这些内标物质时具有氨基酸的测定精度不良 等问题。因此，期望开发克服了这类问题的内标物质。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2003/069328

非专利文献

非专利文献1：B.D.Bennett,E.H.Kimball,M.Gao,R.Osterhout,S.J.Van Dien and  J.D.Rabinowitz,Nat.Chem.Biol.,5,593-599(2009).

非专利文献2：http：//www.srl.info/srlinfo/kensa_ref_CD/KENSA/SRL6354.htm

非专利文献3：http：//www.nist.gov/cstl/analytical/organic/metabolitesinserum.cfm

非专利文献4：Kazutaka Shimbo,Takashi Oonuki,Akihisa Yahashi,Kazuo Hirayama  and Hiroshi Miyano,Rapid Commun.Mass Spectrom.2009;23:1483-1492.

非专利文献5：E.A.McGaw,K.W.Phinney and M.S.Lowenthal.J Chromatogr A. 2010;1217:5822-5831.

发明内容

发明要解决的问题

本发明是鉴于上述状况而完成的，本发明要解决的问题在于简便且高精度地实施 氨基酸的定量。更具体来说，本发明的课题为提供用于对血浆中存在的氨基酸的定量 分析简便且高精度地进行分析的外标液、外标物质、内标液和内标物质以及使用了这 些物质的血浆中氨基酸的定量方法。

用于解决问题的手段

本发明人为了解决上述课题，首先通过对6469份样本的人血浆样本中的各种氨 基酸浓度进行分析，以统计学的方式求出了作为基准的人血浆中的各氨基酸的浓度分 布。并且，以该浓度分布为基础制备了外标液。其结果发现，该外标液与以往不同， 若使用该外标液和将其进行适当稀释而成的溶液制作标准曲线，则大多数样本中的各 种氨基酸浓度会落入使用了这些外标液的标准曲线内，因而能够高精度地测定样本中 的氨基酸浓度，从而完成了本发明。进一步，本发明人发现，例如使用以质谱仪作为 检测器的液相色谱时，使用以稳定同位素标记过的特定氨基酸作为内标物质，由此内 标物质的浓度与信号的关系为直线，能够进行高精度地氨基酸分析，从而完成了本发 明。

即，本发明的血浆中氨基酸分析用外标液(以下有时仅简称为本发明的外标液)基 于由6469份样本的样本数据得到的血浆中的各种氨基酸浓度分布，按照实际的血浆 中的浓度平衡含有各种氨基酸，将该标准液用于制作氨基酸的定量分析的标准曲线， 由此，制作出的标准曲线的浓度差可以覆盖实际的血浆中氨基酸浓度的最小浓度至最 大浓度的大部分，从而发挥了可以比以往更简便且高精度地进行氨基酸分析的效果。 另外，本发明的外标液的特征在于，适于将例如液体色谱法、气相色谱法、超临界流 体色谱法、电泳法、电感耦合等离子体法等与质谱分析组合而成的各种分离分析方法， 特别适于利用组合了质谱分析的色谱法进行各种氨基酸的分离分析测定。

即，在本发明的一种实施方式中，血浆中氨基酸分析用外标液的特征在于，其含 有下述(1)和(2)：

(1)选自下述A成分的至少1种氨基酸，每种的浓度为0.0007M(mol/l)～0.49M；

(2)(i)选自下述B成分的至少1种氨基酸，每种的浓度为选自A成分的氨基酸之 中浓度最低的氨基酸的0.2倍～0.9倍；

(ii)选自下述C成分的至少1种氨基酸，每种的浓度为选自A成分的氨基酸之 中浓度最低的氨基酸的0.1倍～0.4倍，并且在含有B成分的情况下，低于B成分中 浓度最低的氨基酸的1倍；或者

(iii)选自下述D成分的至少1种氨基酸，每种的浓度为选自A成分的氨基酸之 中浓度最低的氨基酸的0.05倍～0.2倍，并在含有B成分的情况下，低于B成分中浓 度最低的氨基酸的1倍，且在含有C成分的情况下，低于C成分中浓度最低的氨基 酸的1倍，

A成分：缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸和谷氨酰胺，

B成分：丝氨酸、脯氨酸、苏氨酸、牛磺酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、组氨 酸、苯丙氨酸和酪氨酸，

C成分：天冬酰胺、鸟氨酸、精氨酸和色氨酸，

D成分：谷氨酸、蛋氨酸、瓜氨酸和胱氨酸。

另外，在本发明一种实施方式中，血浆中氨基酸分析用外标液的特征在于，

“其含有：

(1)选自A成分的至少1种氨基酸，每种的浓度为0.0007M～0.49M；和

(2)选自B成分的至少1种氨基酸，每种的浓度为选自A成分的氨基酸之中浓度 最低的氨基酸的0.2倍～0.9倍”。

另外，在本发明一种实施方式中，血浆中氨基酸分析用外标液的特征在于，

“上述外标液中进一步含有选自C成分的至少1种氨基酸，每种的浓度为选自A 成分的氨基酸之中浓度最低的氨基酸的0.1倍～0.4倍，并且低于B成分的氨基酸之 中浓度最低的氨基酸的1倍”。

进一步，在本发明一种实施方式中，血浆中氨基酸分析用外标液的特征在于，“在 上述外标液中进一步含有选自D成分的至少1种氨基酸，每种的浓度为选自A成分 的氨基酸之中浓度最低的氨基酸的0.05倍～0.2倍，并低于B成分的氨基酸之中浓度 最低的氨基酸的1倍，且低于C成分的氨基酸之中浓度最低的氨基酸的1倍”。

另外，在本发明的另一实施方式中，血浆中氨基酸分析用外标液的特征在于，“其 含有缬氨酸和选自亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、色氨酸和瓜氨酸 中的至少1种而成，其中，缬氨酸浓度为0.0003M～0.49M；含有亮氨酸的情况下亮 氨酸的浓度为缬氨酸的0.1倍～低于1倍；含有异亮氨酸的情况下异亮氨酸的浓度为 缬氨酸的0.05倍～0.7倍；含有苯丙氨酸的情况下苯丙氨酸的浓度为缬氨酸的0.1倍～ 0.6倍浓度；含有酪氨酸的情况下酪氨酸的浓度为缬氨酸的0.1倍～0.7倍；含有组氨 酸的情况下组氨酸的浓度为缬氨酸的0.1倍～0.8倍；含有色氨酸的情况下色氨酸的 浓度为缬氨酸的0.1倍～0.6倍，并且在含有亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸 或组氨酸时，色氨酸的浓度低于它们的1倍；含有瓜氨酸的情况下瓜氨酸的浓度为缬 氨酸的0.01倍～0.3倍浓度，并且在含有亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、组 氨酸或色氨酸时，瓜氨酸的浓度低于它们的1倍”。

进一步，在本发明的另一实施方式中，血浆中氨基酸分析用外标液的特征在于， “其含有缬氨酸和选自亮氨酸和异亮氨酸的至少1种，其中，含有0.0003M～0.49M 的缬氨酸；含有亮氨酸的情况下亮氨酸的浓度为缬氨酸的0.1倍～低于1倍；含有异 亮氨酸的情况下异亮氨酸的浓度为缬氨酸的0.05倍～0.7倍”。

更进一步，在本发明的另一实施方式中，血浆中氨基酸分析用外标液的特征在于， “在上述标准液中进一步含有苯丙氨酸和酪氨酸中的至少1种，其中，含有苯丙氨酸 的情况下苯丙氨酸的浓度为缬氨酸的0.1倍～0.6倍；含有酪氨酸的情况下酪氨酸的 浓度为缬氨酸的0.1倍～0.7倍”。

另外，本发明的另一实施方式中，血浆中氨基酸分析用外标液的特征在于，“在 上述标准液中进一步含有组氨酸和色氨酸中的至少1种，其中，含有组氨酸的情况下 组氨酸的浓度为缬氨酸的0.1倍～0.8倍；含有色氨酸的情况下，色氨酸的浓度为缬 氨酸的0.1倍～0.6倍，并且在含有亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或组氨酸 时，色氨酸的浓度低于它们中的1倍”。

进一步，其他的本发明的另一实施方式中，血浆中氨基酸分析用外标液的特征在 于，“在上述标准液中进一步含有瓜氨酸，其中，瓜氨酸的浓度为缬氨酸的0.01倍～ 0.3倍，并且在含有亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、组氨酸或色氨酸时，瓜 氨酸的浓度低于它们的1倍”。

即，与以往市售的混合浓度大致一致的氨基酸而制备的外标物质不同，本发明可 以提供与人血浆中的实际氨基酸存在浓度的比率(氨基酸平衡)相匹配而制备的外标 液，由该外标液制备几份～10份左右的稀释液，使用这些稀释液，可以制作用于人 血浆中氨基酸的定量分析的各种氨基酸的标准曲线，并且相比于使用了以往的标准物 质的情况，通过将该外标液用作氨基酸的定量方法的标准液，可以简便且高精度地对 生物体内的氨基酸进行定量分析。

另外，本发明的血浆中氨基酸分析用内标液(以下有时仅简称为本发明的内标液) 发挥如下效果：在浓度和信号之间显示了良好的线性，因此能够进行高精度的氨基酸 测定，并且将其用于色谱法时，内标液中的氨基酸与作为测定对象的氨基酸的保留时 间几乎没有差异，因此能够进行测定。

本发明的内标液的特征在于，“其含有利用1种以上的稳定同位素进行过标记的 脯氨酸、甘氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸和牛磺酸”。

进一步，本发明的内标液的特征在于，“其含有利用1种以上的稳定同位素进行 过标记的脯氨酸、甘氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸、牛磺酸、异亮氨酸、苯丙氨酸 和天冬酰胺”。

更进一步，本发明的内标液的特征在于，“其含有利用1种以上的稳定同位素进 行过标记的脯氨酸、甘氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸、牛磺酸、异亮氨酸、苯丙氨 酸、天冬酰胺、鸟氨酸、乙醇胺、谷氨酸、3-甲基组氨酸、丝氨酸、组氨酸和精氨酸”。

本发明提供了一种内标液，该内标液与血浆中氨基酸的特性相匹配，且发挥如下 效果：例如色谱法中保留时间几乎没有差异，且浓度与信号的关系保持直线；若如上 所述将本发明的内标液用于氨基酸的定量方法，则能够简便且高精度地对生物体内的 氨基酸进行定量分析。

从本发明的另一角度来看，本发明的氨基酸的定量方法的特征在于“使用上述外 标液或外标物质”；另外，其特征在于“在上述外标液或外标物质中进一步使用内标液 或内标物质”；此外，其特征在于“使用上述内标液或内标物质”。通过如上所述进行， 可以简便且高精度地对血浆中的氨基酸进行定量分析。另外，在本发明的定量方法中， 特别优选利用质谱仪进行测定。因此，与使用以往的外标物质和/或内标物质时相比， 本发明的氨基酸的定量方法不仅可以简便地对血浆中的氨基酸进行定量分析，而且可 以以格外优异的精度进行分析。

发明效果

对于本发明的标准液来说，根据分别对6469份样本的人血浆样本进行分析而得 到的数据，按照统计学的方式求出人血浆中的各种氨基酸的浓度分布，然后根据该浓 度分布设定了各种氨基酸的浓度。因此，人血浆中氨基酸的标准误差非常低，通过将 该标准液和适当稀释该标准液而成的溶液用于制作氨基酸的定量分析用的标准曲线， 能够进行高精度的测定。另外，以往的标准液为混合浓度大致相同的氨基酸而成的混 合溶液，因此为了使各种氨基酸的测定浓度范围落入所制作的标准曲线的范围内，需 要在非常多的校准点处进行测定。然而，对于本发明的标准液来说，如上所述的那样 根据对大量的人血浆样本进行分析而得到的数据设定了氨基酸浓度，因此只要进行将 其以特定的2种以上的稀释倍数进行稀释的一系列操作(制作几个到10个以内的稀释 系列)，便可以简便地提供与作为分析对象的血浆中的各种氨基酸浓度相匹配的标准 曲线用标准液。其结果是，能够减少校准点，进行简便的测定，进一步能够进行高精 度的定量分析。

另外，对于本发明的内标液来说，与以往的氨基酸的内标液相比，适当稀释本发 明的内标液进行使用时，浓度和信号的关系为线性，因此能够进行高精度的氨基酸测 定。特别是在用于色谱法时，内标液中的氨基酸与作为测定对象的氨基酸的保留时间 几乎没有差别，因此能够进行高精度的测定。

进一步，在本发明的血浆中氨基酸的测定方法中，通过组合使用上述本发明的外 标液和本发明的内标液，能够进行更高精度的定量分析。

因此，本发明在血浆中氨基酸的定量分析方面极为有用。

附图说明

图1为表示在实验例1中测定的各种氨基酸的平均浓度、最大浓度、最小浓度、 平均浓度＋2SD(标准偏差)和平均浓度－2SD(标准偏差)、在实施例1中制备的本发明 的外标液(浓度1和浓度5)以及在比较例1中制备的以往的氨基酸混合标准液(浓度1’ 和浓度5’)的浓度分布的曲线图。

具体实施方式

本发明的血浆中氨基酸分析用外标液(本发明的外标液)

本发明的外标液用于在使用标准曲线法的定量分析法中所采用的所谓的外标，具 体来说，本发明的外标液是与作为测定对象的人的生物体样品中的各种氨基酸的存在 浓度的比率相匹配而制备混合成作为标准物质(基准)的2种以上氨基酸产品(市售品) 的溶液，也称作外部混合标准液。

作为使用本发明的外标液进行测定的氨基酸，例如可以举出缬氨酸(Val)、甘氨酸 (Gly)、丙氨酸(Ala)、谷氨酰胺(Glu)、丝氨酸(Ser)、脯氨酸(Pro)、苏氨酸(Thr)、牛磺 酸(Tau)、亮氨酸(Ler)、异亮氨酸(Ile)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)、苯丙氨酸(Phe)、 酪氨酸(Tyr)、天冬酰胺(Asn)、鸟氨酸(Orn)、精氨酸(Arg)、色氨酸(Trp)、谷氨酸(Glu)、 蛋氨酸(Met)、瓜氨酸(Cit)、胱氨酸(Cys)、α-氨基丁酸(ABA)、乙醇胺(EtOHNH₂)、肌 氨酸(Sar)、γ-氨基丁酸(GABA)、β-氨基异丁酸(β-AiBA)、羟脯氨酸(HyPro)、天冬氨 酸(Asp)、α-氨基己二酸(α-AAA)、羟赖氨酸(HyLys)、1-甲基组氨酸(1MeHis)、3-甲基 组氨酸(3MeHis)、肌肽(Car)、鹅肌肽(Ans)等，特别优选为缬氨酸(Val)、甘氨酸(Gly)、 丙氨酸(Ala)、谷氨酰胺(Glu)、丝氨酸(Ser)、脯氨酸(Pro)、苏氨酸(Thr)、牛磺酸(Tau)、 亮氨酸(Ler)、异亮氨酸(Ile)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、 天冬酰胺(Asn)、鸟氨酸(Orn)、精氨酸(Arg)、色氨酸(Trp)、谷氨酸(Glu)、蛋氨酸(Met)、 瓜氨酸(Cit)、胱氨酸(Cys)等。

本发明的外标液可按照所测定的氨基酸从上述氨基酸中适当选出，但含有下述A 成分中所包括的氨基酸的至少1种，并且含有下述B～D成分中所包括的氨基酸的至 少1种。具体来说，本发明的外标液优选含有A成分中所包括的氨基酸的至少1种 且含有B成分中所包括的氨基酸的至少1种；优选进一步含有C成分中所包括的氨 基酸的至少1种；优选进一步含有D成分中所包括的氨基酸的至少1种。

[A成分]

缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸和谷氨酰胺

[B成分]

丝氨酸、脯氨酸、苏氨酸、牛磺酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、组氨酸、苯丙 氨酸和酪氨酸

[C成分]

天冬酰胺、鸟氨酸、精氨酸和色氨酸

[D成分]

谷氨酸、蛋氨酸、瓜氨酸和胱氨酸

在上述A成分中，优选为缬氨酸。

在上述B成分中，优选为丝氨酸、脯氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨 酸、组氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸，更优选为亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、 酪氨酸。

在上述C成分中，优选为色氨酸、天冬酰胺，更优选为色氨酸。

在上述D成分中，优选为瓜氨酸、蛋氨酸，更优选为瓜氨酸。

另外，本发明的外标液也可以含有作为上述A～D成分以外的氨基酸的乙醇胺、 肌氨酸、γ-氨基丁酸、β-氨基异丁酸、羟脯氨酸、天冬氨酸、α-氨基己二酸、羟赖氨 酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、肌肽、鹅肌肽或α-氨基丁基酸(以下简称为E成 分)。

上述A～D成分是以匹配人血浆中存在的氨基酸的存在浓度的比率的方式进行 分类得到的，人血浆中的氨基酸的存在浓度按照A成分、B成分、C成分、D成分的 顺序降低。该分组与人的生物体样品中的氨基酸的存在浓度的比率相匹配，更具体来 说，不仅匹配平均存在浓度的比率，而且通过(1)考虑存在浓度的中位值、最大值和 最小值等，对于存在浓度的最大值高的氨基酸而言，设定为高于平均存在浓度的比率， 对于存在浓度的最小值低的氨基酸而言，设定为低于平均存在浓度的比率；(2)考虑 氨基酸的浓度分布，多分布于高于平均存在浓度的浓度的情况下，设定为高于平均存 在浓度的比率，多分布于低于平均存在浓度的浓度的情况下，设定为低于平均存在浓 度的比率；或者，(3)综合考虑这2种以上的要素进行设定；等等来进行匹配。具体 来说，例如，牛磺酸的情况下，仅与平均存在浓度的比率匹配时属于C组，但是存 在浓度的最大值高，因而优选设定为高浓度的B组而非C组。另外，异亮氨酸的情 况下，仅与平均存在浓度的比率匹配时属于C组，但根据氨基酸分布，多以高于平 均存在浓度的浓度存在，因此优选设定为浓度高于C组的B组。

需要说明的是，人血浆中存在的氨基酸的存在浓度可以根据使用大量样本而得到 的数据求出，而样本数越多，就越能形成高精度且更真实反映人血浆中浓度的优良外 标液。本发明的外标液中的氨基酸的浓度比使用6469样本算出，是标准误差小的优 异的外标液。需要说明的是，通常来说，从标准偏差为σ、元素数为N的总体抽取n 个标本时，标本平均的标准误差由进行估算，而N充分 大时，由进行估算。可知，与由例如300份样本计算出浓度数据的情况相比， 由6469个样本计算出浓度数据的情况下的标本平均的标准误差约为0.22倍，可以得 到标准误差更小的数据。

上述A～D成分的氨基酸组的具体摩尔浓度比和优选摩尔浓度为下表所示的那 样。需要说明的是，表中，对于将A组设为1时的摩尔浓度比和优选摩尔浓度比来 说，A成分为1种时，其为将该氨基酸设为1时的摩尔浓度比；A成分为2种以上时， 表示将浓度最低的氨基酸设为1时的摩尔浓度比。另外，C成分的“但是，低于B组 的1倍”是指，在本发明的外标液含有B成分，在B成分为1种时，C成分浓度低于 该氨基酸浓度的1倍；在B成分为2种以上时，C成分浓度低于其中浓度最低的氨基 酸的1倍。D成分的“但是，低于B组的1倍且低于C组的1倍”是指，本发明的外 标液含有B成分，在B成分为1种时，D成分浓度低于该氨基酸浓度的1倍，在B 成分为2种以上时，D成分浓度低于其中浓度最低的氨基酸的1倍；并且本发明的外 标液含有C成分，在C成分为1种时，D成分浓度低于该氨基酸浓度的1倍，C成 分为2种以上时，D成分浓度低于其中浓度最低的氨基酸的1倍。

另外，本发明的外标液中的A组成分的浓度通为0.0007M～0.49M。其下限优选 为0.0008M以上，浓度高于A组成分中的平均浓度+2SD最高的谷氨酰胺的767.7μM； 其下限更优选为0.0013M以上，浓度高于A组成分中的最大浓度最高的谷氨酰胺的 1276.9μM。上限优选为0.1M以下，更优选为0.05M以下。可以对B组～C组进行设 定，使相对于A组的摩尔浓度比为上述表的范围。

需要说明的是，本发明的外标液含有上述E成分时，E成分的浓度可以如下设定： 在本发明的外标液含有B成分的情况下，E成分浓度低于其中浓度最低的氨基酸的1 倍，并且在含有C成分的情况下，E成分浓度低于其中浓度最低的氨基酸的1倍，而 且在含有D成分的情况下，E成分浓度低于其中浓度最低的氨基酸的1倍。

本发明的外标液在保存时优选不使A成分及B成分、与D成分和/或E成分共存。 具体来说，例如使用含有A～E全部成分的溶液作为本发明的外标液时，优选分为A 成分、B成分和C成分；D成分和E成分进行保存，使用时混合必要的量制备含有A～ E全部成分的外标液，从而进行使用。

作为本发明的外标液中所含有的氨基酸的优选具体例，例如可以举出含有缬氨酸 和选自亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、色氨酸和瓜氨酸中的至少1 种。其中，优选含有缬氨酸与选自亮氨酸和异亮氨酸的至少1种；更优选含有缬氨酸、 选自亮氨酸和异亮氨酸的至少1种、和选自苯丙氨酸和酪氨酸的至少1种；进一步优 选含有缬氨酸、选自亮氨酸和异亮氨酸的至少1种、选自苯丙氨酸和酪氨酸的至少1 种、和选自组氨酸和色氨酸的至少1种；特别优选含有缬氨酸、选自亮氨酸和异亮氨 酸的至少1种、选自苯丙氨酸和酪氨酸的至少1种、选自组氨酸和色氨酸的至少1 种、和瓜氨酸。

从缬氨酸和选自亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、色氨酸和瓜氨 酸中的至少任1种中选择氨基酸制成外标液时，各自的浓度比和优选浓度比如下所 述。

另外，本发明的外标液在至少含有缬氨酸且含有亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、 酪氨酸、组氨酸、色氨酸和瓜氨酸中的至少1种时，缬氨酸的浓度通常为0.0003M～ 0.49M。其下限优选为0.0004M以上，该浓度高于作为缬氨酸的平均浓度+2SD的 341.4μM；更优选为0.0005M以上，该浓度高于作为缬氨酸的最大浓度的469.9μM。 上限优选为0.1M以下，更优选为0.05M以下。对于其他氨基酸来说，可以在形成上 述氨基酸比的范围内适当设定。

本发明的外标液的制备方法

本发明的外标液可以在上述浓度范围内以形成上述浓度比的方式将上述氨基酸 溶解于水或缓冲液等中进行制备。作为这样的缓冲液，具体来说，可以举出例如磷酸 缓冲液、柠檬酸缓冲液、硼酸缓冲液、三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液等Tris缓冲液；N， N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)缓冲液、2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)缓冲 液、3-吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲液、乙酸缓冲液、碳酸缓冲液等Good’s缓冲液等。

对于本发明的外标液来说，将某些特定的氨基酸浓度作为基准调整与各氨基酸的 浓度比率，由此以与人血浆样品中的实际的氨基酸浓度平衡相匹配的方式制备本发明 的外标液。例如，可以对人血浆的6469份样本使用以往的标准物质，从而求出了如 下述实施例1的表3中所示的氨基酸浓度的基准值，据此制备本发明的外标液。具体 来说，例如可以使用各氨基酸制备如下述表1中所示的5级浓度1～5的外标物质。 需要说明的是，在下述表1中示出的浓度1～5中，浓度3最接近血浆中的平均浓度， 但作为本发明的外标液，仅提供了表1的浓度1的外标液，使用时优选将其适当稀释 制备表1的浓度2～5的外标液，从而进行使用。

[表1]

另外，在本发明的外标液的制备中，如标准液的保存时的项中记载的那样，优选 不使上述A成分和B成分、与D成分和/或E成分共存，并优选制成2种氨基酸混合 液。

进一步，更优选将预先制备的2种氨基酸混合液(1和2)与在溶液中稳定性低的 氨基酸按照临用时配制的方式进行混合制备，从而制备最终外标物质。即，在本发明 的其他优选实施方式中，本发明的外标物质溶液优选利用含有2种氨基酸混合液1、 2和临用时配制用氨基酸而成的试剂盒(キット)进行制备。更详细来说，氨基酸混合 液1含有在血浆中存在浓度相对低的氨基酸，这些氨基酸的具体例为β-AiBA、HyPro、 Asp、α-AAA、Sar、δ-HyLys、EtOHNH₂、3MeHis、1MeHis、Ans、Car、GABA、α-ABA、 Cit、Cys₂、Glu、Met等。氨基酸混合液2含有在血浆中存在浓度相对高的氨基酸， 这些氨基酸的具体例为Arg、Orn、Ile、Leu、Phe、Pro、Ser、Thr、Tyr、Tau、His、 Lys、Gly、Ala、Val等。另外，临用时配制用氨基酸为在溶液中稳定性相对低的氨基 酸，具体例为Asn、Gln、Trp等。

因此，本发明的外标物质通过混合这些试剂(即氨基酸混合液1和2、临用时配制 用氨基酸)进行制备。所制备的本发明的优选外标物质的组成为：例如Asp、3MeHis、 EtONH₂、1MeHis、HyPro、Sar、α-AAA、β-AiBA、δ-HyLys、GABA、Ans、Car等 各含有0.02M，例如α-ABA含有0.05M，Met、Cit、Glu、Cys₂各含有0.1M，例如 Trp、Orn、Asn、Arg等各含有0.25M，例如Phe、Tyr、Tau、His、Ile、Ser、Leu、 Thr、Pro、Lys等各含有0.50M，例如Val、Gly、Ala、Gln等各含有1.0M。

本发明的血浆中氨基酸分析用外标物质

对于本申请发明的外标物质来说，可以通过将一定量的本发明的外标物质溶解于 一定量的水或缓冲液中，从而将各种氨基酸混合制成上述发明的外标液，该氨基酸可 以举出与上述外标液中的记载相同的氨基酸。另外，该外标物质优选为将本发明的外 标液进行冷冻干燥而成的物质等。

本发明的血浆中氨基酸分析用内标液

本发明的内标液是在使用标准曲线法的定量分析法中使用的所谓的内标，具体来 说，其是主要考虑测定对象的生物体样品中的氨基酸的存在浓度的比率和检测灵敏度 等而制备混合作为标准物质(基准)的2种以上氨基酸产品而成的溶液，也称作内标混 合液。

本发明的内标液的特征在于含有利用1种以上的稳定同位素进行过标记的氨基 酸，优选按照与生物体样品中的氨基酸的特性相匹配的方式进行制备。即，优选考虑 例如氨基酸的存在浓度、夹杂成分的存在、检测灵敏度(尤其是就液相色谱-质谱分析 仪而言的检测灵敏度)、氨基酸与内标物质的峰的重叠程度或者综合考虑它们中的2 种以上要素，从而确定向内标物质中添加的氨基酸的种类、内标物质的浓度和利用稳 定同位素进行标记的元素。对于例如就液相色谱－质谱分析仪而言检测灵敏度良好的 脯氨酸来说，优选设定内标浓度低于人血浆平衡氨基酸浓度，更优选设定为本发明的 内标液中的最低浓度。另一方面，对于就液相色谱－质谱分析仪而言检测灵敏度差且 容易受到夹杂成分影响的牛磺酸和就液相色谱－质谱分析仪而言检测灵敏度差且因 峰发生分叉导致测定的稳定性不良的胱氨酸来说，优选设定内标浓度高于人血浆平衡 氨基酸浓度，更优选设定牛磺酸的内标浓度为本发明的内标液中的最高浓度，进一步 优选将牛磺酸的内标浓度设定为最高浓度并将胱氨酸的内标浓度设定为次于牛磺酸 的高浓度。

作为本发明的内标液中的利用1种以上的稳定同位素进行过标记的氨基酸，可以 举出脯氨酸、甘氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸、牛磺酸、异亮氨酸、苯丙 氨酸、天冬酰胺、鸟氨酸、乙醇胺、谷氨酸、3-甲基组氨酸、丝氨酸、组氨酸、精氨 酸、肌氨酸、丙氨酸、γ－氨基丁酸、β-氨基异丁酸、α-氨基丁酸、苏氨酸、羟脯氨 酸、亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、α-氨基己二酸、δ-羟赖氨酸、1-甲基组 氨酸、瓜氨酸、肌肽、鹅肌肽和胱氨酸等。其中，优选至少含有脯氨酸、甘氨酸、缬 氨酸、蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸和牛磺酸，更优选至少含有脯氨酸、甘氨酸、缬氨酸、 蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸、牛磺酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和天冬酰胺。

作为本发明的内标液中的稳定同位素，可以举出例如²H、¹³C、¹⁵N、¹⁸O等，优 选为¹³C、¹⁵N等。

利用1种以上的稳定同位素进行过标记的氨基酸与非标记体的氨基酸的分子量 差优选为3以上。通过利用稳定同位素按照相对非标记体的氨基酸形成3以上的分子 量差的方式进行标记，由此非标记体中的同位素的天然存在比例产生影响减小，可以 进行更高精度的分析。例如丙氨酸(分子式：C₃H₇NO₂，分子量为88)中天然同位素的 分布为分子量88(95.8%)、89(3.74%)、90(0.34%)、91(0.02%)，而通过使分子量差为3 以上，天然同位素的影响几乎消失。

作为利用1种以上的稳定同位素进行过标记的氨基酸的具体例，可以举出例如 Pro-U¹³C₅，¹⁵N、Gly-U¹³C₂，¹⁵N、Val-U¹³C₅，¹⁵N、Met-U¹³C₅，¹⁵N、Trp-U¹³C₁₁，¹⁵N₂、 Tyr-Ring-¹³C₆、Tau-U¹³C₂、Ile-U¹³C₆，¹⁵N、Phe-U¹³C₉，¹⁵N、Asn-U¹³C₄，¹⁵N₂、Orn-U¹³C₅、 EtONH₂-1，1，2，2-d₄、Glu-U¹³C₅、3MeHis-methyl-d₃、Ser-U¹³C₃，¹⁵N、His-U¹³C₆， ¹⁵N₃、Arg-U¹⁵N₄等。

本发明的内标液中的利用1种以上的稳定同位素进行过标记的氨基酸的浓度通 常为10μM～300μM。对于各氨基酸的浓度来说，优选脯氨酸浓度低于任一种氨基酸， 更优选牛磺酸浓度高于任一种氨基酸且脯氨酸浓度低于任一种氨基酸。更具体来说， 优选设定成浓度按照牛磺酸＞乙醇胺、谷氨酸、3-甲基组氨酸、丝氨酸、组氨酸、精 氨酸、酪氨酸＞天冬酰胺＞异亮氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、色氨酸＞甘氨酸、缬氨酸、 蛋氨酸＞脯氨酸的顺序降低。

本发明的内标液的制备方法

对于本发明的内标物质来说，以与生物体样品中的氨基酸的特性相匹配的方式将 如上所述的利用1种以上稳定同位素进行过标记的氨基酸按照形成上述浓度范围的 方式溶解于水或缓冲液等中进行制备。具体来说，可以根据下述实施例的表3的氨基 酸浓度中涉及的基准值等进行制备。需要说明的是，上述缓冲液可以举出与上述本发 明的外标液的记载相同的缓冲液。

本发明的血浆中氨基酸分析用外标物质

对于本申请的内标物质来说，可以通过将一定量的本发明内标物质溶解于一定量 的水或缓冲液中，从而将各种氨基酸混合制成上述本发明的内标液，该氨基酸可以举 出与上述内标液中的记载相同的氨基酸。另外，该内标物质优选为将本发明的内标液 进行冷冻干燥而成的物质等。

本发明的血浆中氨基酸的定量方法

通常，在使用标准曲线法的定量分析法中有外标法(即使用本发明的外标液或外 标物质的方法)和内标法等。在本发明的定量方法中，除了外标以外，如果还预先向 检测样品内添加与样本具有同样特性的标准物质(即本发明的内标液或内标物质)，则 能够提高定量的精度。即，在本申请发明中，也可以仅利用使用外标液或外标物质的 方法或使用内标液或内标物质的方法进行定量，但通过合用这两种可以进行精度更高 的定量分析。

作为本发明中的使用外标液或外标物质的氨基酸的定量方法，可以按照本身公知 的标准曲线法进行，具体来说，例如制备本发明的外标液(或将外标物质溶解于水等 中得到溶液)的2倍稀释液、4倍稀释液、10倍稀释液和20倍稀释液，利用适当的分 析方法对原液和这些稀释液进行测定，制作表示峰面积或峰高与浓度的关系的标准曲 线。其后，使用例如人血浆对作为测定对象的氨基酸进行测定，通过将所得到的峰面 积或峰高对应上述标准曲线而计算出浓度，从而进行定量。作为上述分析方法，可以 为该领域中通常进行的分析方法，具体来说，可以举出例如液相色谱－质谱分析 (LC-MS)、液相色谱-质谱分析-质谱分析(LC-MS-MS)、液相色谱-荧光分析、液相色 谱-UV检测等，其中优选为使用了质谱分析仪的LC-MS、LC-MS-MS等。对于这些 分析的条件来说，可以按照本身公知的方法进行设定。

需要说明的是，大多数的氨基酸的吸收、荧光性和电化学性应答非常弱，优选按 照分析条件对氨基酸的氨基进行标记后进行分析。此时，优选使用灵敏度更高且可以 发挥高选择性的标记试剂，作为该标记试剂，具体可以举出例如专利文献1中记载的 氨基甲酸酯化合物，其中，优选为3-氨基吡啶基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯 (APDS)。

作为本发明的使用内标液或内标物质的氨基酸的定量方法，可以按照本身公知的 使用内标的方法进行定量，具体来说，例如将内标液(或将内标物质溶解于水等而成 的溶液)添加至例如作为样本的人血浆中，使用该混合物，按照上述使用外标液的方 法中记载的方法等，对作为测定对象的氨基酸和内标液中的利用稳定同位素进行过标 记的氨基酸进行测定。由所得到的作为测定对象的氨基酸的峰面积或峰高和利用稳定 同位素进行过标记的氨基酸的峰面积或峰高出发，求出其比值，根据该值修正制备时、 样品注入时的误差等，算出作为测定对象的氨基酸浓度，由此进行定量。

下面举出具体的实施例更详细地说明本发明，但本发明的范围不限于这些示例。

实施例

实验例1血浆平衡氨基酸浓度的确定

(1)样本

作为用于求出血浆平衡氨基酸浓度的样本，使用了6469份人血浆样本。

(2)外标液

按照达到下述表中的浓度的方式向市售品的氨基酸混合标准溶液H型和B型(和 光纯药工业株式会社制造)添加下述表中的各种氨基酸，制备了用于向上述人血浆样 本添加的7种外标液。表中的浓度表示制备后的浓度。

[表2]

(3)内标液

下述的稳定同位素标记过的氨基酸由味之素公司、Cambridge Isotope Laboratories 和Isotec处获得，制备了含有Gln-U¹³C₅，¹⁵N₂(100μM)、Arg-U¹⁵N₄(100μM)、 His-U¹⁵N₃(100μM)(部分为His-U¹³C₆，¹⁵N₃(100μM))、Glu-U¹³C₅，¹⁵N(200μM)、 Ser-U¹³C₃，¹⁵N(100μM)、Gly-2，2-d2₂(50μM)、Ala-3，3，3-d₃(80μM)、Leu-5,5,5-d₃(80μM)、 Lys-4,4,5,5-d₄(100μM)、Val-2,3,4,4,4,5,5,5-d₅(25μM)、Met-methyl-d₃(25μM)、 Pro-d₇(100μM)、Trp-U¹³C₁₁，¹⁵N₂(100μM)、Phe-phenyl-d₅(100μM)、Orn-U¹³C₅(80μM) 和Cit-4,4,5,5-d₄(100μM)的内标液。

(4)样本的前处理

向上述的内标液50μL加入上述样本50μL并充分进行混合，然后加入乙腈100μL 并进一步充分进行混合。利用微量高速冷却离心机对该溶液进行了离心分离，然后抽 取其上清组分。

(5)柱前衍生化

使用所得到的上清组分、标记试剂(3-氨基吡啶基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸 酯试剂)进行了柱前衍生化。具体来说，向200mM硼酸缓冲液(pH8.8)12μL中添加上 清组分4μL，充分混合，进一步添加3-氨基吡啶基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯 试剂(将20mg该试剂溶解于乙腈1mL中得到的溶液)4μL并充分进行混合，然后在 55℃下加热5分钟。接着，向该溶液中加入25mM甲酸铵水溶液(pH6.0)60μL和0.1% 甲酸水溶液20μL并充分进行混合，将所得到的溶液作为高效液相色谱-质谱分析的分 析用样品。

(6)利用高效液相色谱-质谱分析装置的分析

在下述条件下进行分析。

高效液相色谱：L-2100series(Hitachi High-Technologies)

分析柱：Wakosil-II3C8-100HG(和光纯药工业)

保护柱：Wakosil-II3C8-100HG(和光纯药工业)

流动相：流动相A：25mM甲酸(使用氨水调整至pH6.0)

流动相B：乙腈/水(6：4(v/v))

柱温：40℃

样品注入量：5μL

质谱分析装置：Thermo Scientific Surveyor MSQ Plus(Thermo Fisher Scientific)

监测离子：

EtONH2：182、Gly：196、Ala：210、Sar：210、GABA：224、β-AiBA：224、 α-ABA：224、Ser：226、Pro：236、Val：238、Thr：240、Tau：246、HyPro：252、 Ile：252、Leu：252、Asn：253、Asp：254、Gln：267、Glu：268、Met：270、His： 276、α-AAA：282、Phe：286、1MeHis：290、3MeHis：290、Arg：295、Cit：296、 Tyr：302、Trp：325、Car：347、Ans：361、Orn：373、Lys：387、δ-HyLys：403、 Cys₂：481

(7)标准曲线的制作

对于外标液来说，使用表2的浓度1～7这7点中的5点以上(从精密度±15%(下 限为±20%)的范围内脱离的点除外)，不通过原点，利用1/x进行加权。

由此，将高效液相色谱-质谱分析装置的结果适用于标准曲线，从而求出了6469 份样本的氨基酸浓度(血浆平衡氨基酸浓度)。其平均浓度、最大浓度、最小浓度、标 准偏差示于下述表3中。另外，其曲线示于图1。

[表3]

实施例1本发明的外标液(含血浆平衡氨基酸混合物质的溶液)的制备

使用各种氨基酸产品(EtONH₂、Gly、Sar、Ala、GABA、β-AiBA、α-ABA、Ser、 Pro、Val、Thr、Tau、Hypro、Leu、Ile、Orn、Asp、Lys、Glu、Met、His、α-AAA、 δ-HyLys、Phe、1MeHis、3MeHis、Arg、Cit、Tyr、Car、Ans、Cys₂，以上由和光纯 药工业株式会社制造)，参考血浆中的氨基酸浓度比率[即由实验例1确定的人血浆平 衡氨基酸浓度(参照表3和图1)]和氨基酸的稳定性，制备了下述氨基酸混合液1和2。

氨基酸混合液1：

含有200μM的β-AiBA、HyPro、Asp、α-AAA、Sar、δ-HyLys、EtONH₂、3MeHis、 1MeHis、Ans、Car和GABA；500μM的α-ABA；1000μM的Cit、Cys₂、Glu和Met 的水溶液。

氨基酸混合液2：

含有2500μM的Arg和Orn；5000μM的Ile、Leu、Phe、Pro、Ser、Thr、Tyr、 Tau、His和Lys；10000μM的Gly、Ala和Val的水溶液。

其后，将氨基酸混合溶液1、2和临用时配制的Asn、Gln和Trp(Sigma公司制造) 混合，制备了按照如下所示的组成混合了氨基酸的外标液(血浆平衡氨基酸混合标准 液)。

含有20μM的Asp、3MeHis、EtONH2、1MeHis、HyPro、Sar、α-AAA、β-AiBA、 δ-HyLys、GABA、Ans和Car；50μM的α-ABA；100μM的Met、Cit、Glu和Cys₂； 250μM的Trp、Orn、Asn和Arg；500μM的Phe、Tyr、Tau、His、Ile、Ser、Leu、 Thr、Pro和Lys；1000μM的Val、Gly、Ala和Gln。

下述表4表示由上述结果制备的本发明的外标液(血浆平衡氨基酸混合标准液)的 内容。另外，关于浓度1和浓度5的曲线图在图1中示出。

比较例1作为以往品的外标液

作为实施例1的本发明的外标液的比较对照，使用氨基酸混合标准液Type B(和 光纯药工业株式会社制)和氨基酸混合标准液Type ANII(和光纯药工业株式会社制)制 备了氨基酸混合标准液来代替上述氨基酸混合液1和2。

该氨基酸混合标准液的内容在下述表4中与上述本发明的外标液一并示出。另 外，关于浓度1’和浓度5’的曲线图在图1中示出。

[表4]

实施例2本发明的内标液的制备

下述的稳定同位素标记过的氨基酸由由味之素株式会社、Cambridge Isotope  Laboratories、Isotec处获得，制备了含有Gln-U¹³C₅，¹⁵N₂(100μM)、Arg-U¹⁵N₄(100μM)、 His-U¹³C₆，¹⁵N₃(100μM)、Glu-U¹³C₅，¹⁵N(100μM)、Ser-U¹³C₃，¹⁵N(100μM)、Gly-U¹³C₂， ¹⁵N(50μM)、Ala-3,3,3-d₃(100μM)、Leu-5,5,5-d₃(80μM)、Lys-U¹³C₆，¹⁵N₂(130μM)、 Val-U¹³C₅，¹⁵N(50μM)、Met-U¹³C₅，¹⁵N(50μM)、Pro-U¹³C₅，¹⁵N(25μM)、Trp-U¹³C₁₁， ¹⁵N₂(80μM)、Phe-U¹³C₉，¹⁵N(80μM)、Orn-U¹³C₅(80μM)、Cit-4,4,5,5-d₄(100μM)、 Thr-U¹³C₄(100μM)、Tyr-Ring-¹³C₆(100μM)、Tau-U¹³C₂(250μM)、Ile-U¹³C₆，¹⁵N(80μM)、 Asn-U¹³C₄，¹⁵N₂(90μM)、3MeHis-methyl-d₃(100μM)、Asp-2,3,3-d₃(100μM)、 Cys₂-3,3,3',3'-d₄(200μM)和EtONH₂-1,1,2,2-d₄(100μM)的内标液。

作为比较对照，对非专利文献4中记载的内标液进行调整，制成作为针对实施例 2的比较例的内标液(以往的内标液)。

下述表5示出使用上述内标液(本发明的内标液)或比较例的内标液(以往的内标 液)对人血浆中各种氨基酸浓度进行测定时的针对各种氨基酸的内标液。表中，框内 带有灰色的氨基酸表示未使用其自身的稳定同位素作为内标液。对于这些带有灰色的 的框内的氨基酸来说，考虑到与未利用稳定同位素进行过标记的氨基酸的保留时间的 接近程度、化合物的物性、添加回收试验的结果等，从各种利用稳定同位素进行过标 记的氨基酸中选出最佳的内标物质。

[表5]

实施例3使用本发明的外标液对氨基酸进行定量分析

(1)生物体样品的制备

对5名健康人志愿者进行采血，在血浆分离后将血浆混合，制成了库血浆作为生 物体样品。

(2)添加已知浓度氨基酸的血浆和对照(コントロール)血浆的制备

将所得到的库血浆与下述表6中记载的已知浓度氨基酸混合溶液按照1：1进行 混合而成的样本作为添加已知浓度氨基酸的血浆，将所得到的库血浆与水按照1：1 混合而成的样本作为对照血浆。

(3)样本的前处理

向上述的添加已知浓度氨基酸的血浆或对照血浆50μL中添加实施例2的内标液 50μL，然后充分进行混合，然后加入乙腈100μL并充分进行混合。

接着，分别利用微量高速冷却离心机进行了离心分离，然后将所得到的上清组分 用于分析。

(4)柱前衍生化

使用所得到的上清组分、标记试剂(3-氨基吡啶基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸 酯试剂)进行了柱前衍生化。具体来说，向200mM硼酸缓冲液(pH8.8)60μL中添加上 清组分20μL，充分进行混合。进一步添加3-氨基吡啶基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲 酸酯试剂(将20mg该物质溶解于乙腈1mL而成的溶液)20μL并充分进行混合，然后 在55℃下加热10分钟。接着，将该溶液在室温下放置冷却，然后添加100μL的0.1% 甲酸水溶液并充分进行混合，将该混合物作为高效液相色谱-质谱分析的分析用样品。

(5)利用高效液相色谱-质谱分析装置的分析

在下述条件下进行分析。

高效液相色谱：10Avp series(岛津制作所)

分析柱：Inartsil C8-3(GL Sciences)

保护柱：Inartsil ODS-3(GL Sciences)

流动相：流动相A：25mM甲酸(使用氨水调整至pH6.0)

流动相B：乙腈/水(6：4(v/v))

柱温：40℃

样品注入量：3μL

质谱分析装置：API3000LC/MS/MS系统(AB SCIEX)

监测离子(Q1/Q3)：

EtONH₂：182/121、Gly：196/121、Ala：210/121、Sar：210/121、GABA：224/121、 β-AiBA：224/121、α-ABA：224/121、Ser：226/121、Pro：236/121、Val：238/121、 Thr：240/121、Tau：246/121、HyPro：252/121、Ile：252/121、Leu：252/121、Asn： 253/121、Asp：254/121、Gln：267/121、Glu：268/121、Met：270/121、His：276/121、 α-AAA：282/121、Phe：286/121、1MeHis：290/121、3MeHis：290/121、Arg：295/121、 Cit：296/121、Tyr：302/121、Trp：325/121、Car：347/121、Ans：361/121、Orn：373/121、 Lys：387/121、δ-HyLys：403/121、Cys₂：481/121

(6)标准曲线的制作

使用实施例1的外标液，与上述添加已知浓度氨基酸的血浆同样地进行上述(4) 的衍生化处理，进行了(5)的分析。由该分析结果制作了上限浓度和下限浓度的差为 20倍的标准曲线。作为外标液，使用表4的浓度1～5(血浆平衡氨基酸混合标准液) 的5个点，不通过原点，利用1/x进行加权。

(7)向血浆中的氨基酸添加回收

由添加已知浓度氨基酸的血浆的测定结果求出了添加回收率。添加回收率如下进 行计算。

添加回收率＝｛(添加已知浓度氨基酸的血浆中的氨基酸浓度)-(对照血浆中的氨 基酸浓度)｝×2÷添加的已知浓度氨基酸(%)

需要说明的是，对于各浓度来说，求出峰面积比｛(各成分的峰面积)÷(内标液的 峰面积)｝，使用上述标准曲线计算出了各浓度。其结果列于表6。此处，实施例的添 加回收率是在使用实施例1的外标液(血浆平衡氨基酸混合标准液)制作的标准曲线的 基础上计算的值。

比较例2使用比较例1的外标液对氨基酸进行定量分析

在实施例3的(6)中，作为外标液，使用表4的浓度1’～5’(以往的氨基酸混合标 准液)的5点，除此以外，利用与实施例3同样的方法求出了向人血浆中添加了氨基 酸时的添加回收率。其结果在表6中与实施例3的结果一并示出。表中，比较例的添 加回收率是在使用作为比较对照而制备的外标液(以往的氨基酸混合标准液)制作的 标准曲线的基础上计算的值。

[表6]

使用了实施例1中制备的本发明的外标液(血浆平衡氨基酸混合标准液)的情况 下，用作标准品的35种化合物的回收率为80%～111%，而使用了比较例的外标液(以 往品的氨基酸混合标准液)的情况下为0%～392%。即，使用比较例的外标液(以往品 的氨基酸混合标准液)，在下限浓度为上限浓度稀释20倍的范围内利用5点的校准点 制作了标准曲线的情况下，其结果为，定量值在标准曲线范围外的化合物也较多，精 度欠佳。换而言之，使用比较例的外标液(以往品的氨基酸混合标准液)，为了使各种 氨基酸在标准曲线的范围内，需要增加下限浓度相对于上限浓度的稀释倍数，并且需 要增加校准点(例如1000倍浓度且10校准点等)。

另一方面可知，使用实施例1中所得到的本发明的外标液(血浆平衡氨基酸混合 标准液)制作了标准曲线的情况下，即使最低浓度为最高浓度稀释20倍的范围内且校 准点为5点，各种氨基酸浓度也落入标准曲线的范围内，因此可以高精度地测定各种 氨基酸。由此可知，本发明的外标液(血浆平衡氨基酸混合标准液)在生物体样品中的 氨基酸测定方面非常有用。

实施例4使用了本发明的内标液对外标液中的氨基酸进行定量分析

(1)本发明的内标液和外标液

使用了实施例2中制备的本发明的内标液(表5中的实施例2)作为内标。另外， 作为比较例，使用了实施例2中制备的以往的内标液(表5中的比较例)作为内标。

另外，将实施例1中所得到的表4的浓度1的本发明的外标液(血浆平衡氨基酸 混合标准液)依次进行分级稀释为5/4倍、5/3倍、2倍、5/2倍、10/3倍、5倍、10倍、 20倍、40倍，制备了作为测定用的氨基酸的10种浓度。

对实施例1的外标液(血浆平衡氨基酸混合标准液)75μL添加了实施例2的本发明 的内标液75μL，然后充分进行混合，加入乙腈150μL，充分进行混合。同样地，对 实施例1的外标液(血浆平衡氨基酸混合标准液)75μL添加了实施例2的以往的内标液 75μL，然后充分进行混合，加入乙腈150μL，充分进行混合。

(2)柱前衍生物

使用3-氨基吡啶基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯试剂进行了柱前衍生化。向 200mM硼酸缓冲液(pH8.8)185μL中添加上述(1)的含有本发明的内标液的溶液中的 10μL，充分进行混合。进一步添加3-氨基吡啶基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯试 剂(将20mg该物质溶解于乙腈1mL而成的溶液)5μL并充分进行混合，然后在60℃下 加热5分钟，将所得到的混合物作为分析用样品。同样地，向200mM硼酸缓冲液 (pH8.8)185μL中添加上述(1)的含有以往的内标液的溶液中的10μL，充分进行混合。 进一步，添加3-氨基吡啶基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯试剂5μL并充分进行混 合，然后在60℃下加热5分钟，将所得到的混合物作为比较例的分析用样品。

(3)利用高效液相色谱-质谱分析装置的分析

按照下述条件分别对上述分析用样品进行了分析。

高效液相色谱：20A series(岛津制作所)

分析柱：Inertsil ODS-3(GL Sciences)

柱前过滤器：0.5μm滤片、柱前过滤器用(岛津制作所)

流动相：流动相A：25mM甲酸(利用氨水将pH调整为6.0)

流动相B：乙腈

柱温：40℃

样品注入量：5μL

质谱分析装置：LCMS2020(岛津制作所)

监测离子：

EtONH₂：182、Gly：196、Ala：210、Sar：210、GABA：224、β-AiBA：224、 α-ABA：224、Ser：226、Pro：236、Val：238、Thr：240、Tau：246、HyPro：252、 Ile：252、Leu：252、Asn：253、Asp：254、Gln：267、Glu：268、Met：270、His： 276、α-AAA：282、Phe：286、1MeHis：290、3MeHis：290、Arg：295、Cit：296、 Tyr：302、Trp：325、Car：347、Ans：361、Orn：373、Lys：387、δ-HyLys：403、 Cys₂：481

测定后，使用所得到的测定结果进行标准化的响应因子的计算。即，用峰面积比 除以浓度值计算出响应因子，将浓度8的响应因子设为1.0，从而进行了标准化。

下述表7表示由使用了本发明的内标液的结果得到的响应因子，表8表示由使用 了以往的内标液的结果得到的响应因子。需要说明的是，表7和表8仅对内标液不同 的氨基酸进行记载。

需要说明的是，根据上述结果，对于实施例和比较例之间可观察到线性上的差异 的浓度，在表中的框内附加灰色(灰色：相当于表3所示的人血浆中的氨基酸的最小 浓度～最大浓度的浓度范围)，氨基酸缩写的旁边分别附加了如下符号，◎：灰色部 分中实施例与比较例的差异大于0.3；○：该差异为0.2～0.3；△：该差异为0.1～ 0.2；▲：该差异小于0.1。另外，*表示在可观察到这样的差异的氨基酸中，该氨基 酸在实施例和比较例中所标记的元素不同；对于**来说，表示在可观察到这样的差异 的氨基酸中，该氨基酸在实施例和比较例中使用了不同氨基酸的稳定同位素。

[表7]

[表8]

可知，使用本发明的内标液时，相比于以往的内标液，Asn、Gly、Tau、Pro、 Tyr、Val、Met、Ile、Phe、Trp的线性得到了改善。即表明，本发明的内标液可以在 宽浓度范围内保证定量性，在生物体样品中的氨基酸测定中非常有用。另外，在人血 浆中的氨基酸的浓度范围(表中的灰色部分)中，相比于以往的内标液，特别是Gly、 Tau、Pro、Tyr、Val、Met、Trp的线性得到了改善，其中，特别是Tau、Pro的线性 得到了改善。

组合上述各实施方式或本领域技术人员通过公知的方法施加各种变更而成的其 他实施方式也包含在本发明的范围内。

产业上利用可能性

本发明在血浆中的氨基酸的定量分析领域提供了与作为分析对象的氨基酸的存 在浓度的比率相匹配的外标液和使用了该外标液的氨基酸的定量方法。由此，可以减 少制作标准曲线的校准点，并且可以缩小作为分析对象的氨基酸的浓度范围，能够进 行高精度的氨基酸的定量分析。因而，本发明与以往技术相比发挥了显著效果，是极 为有用的。

符号说明

在图1中，－□－表示实验例1中测定的6469份样本的各种氨基酸的平均浓度， --◆--表示实验例1中测定的各种氨基酸的平均浓度＋2SD(标准偏差)，--▲--表示实验 例1中测定的各种氨基酸的平均浓度－2SD(标准偏差)，－◇－表示实施例1中制备 的本发明的外标液(浓度1)，－△－表示实施例1中制备的本发明的外标液(浓度5)， －＊－表示比较例1中制备的以往的氨基酸混合标准液(浓度1’)，－○－表示比较例 1中制备的以往的氨基酸混合标准液(浓度5’)。另外，上下延伸的条线表示对6469 份样本的氨基酸进行测定时的最大值和最小值。